biología celular

El Apoptosoma es un complejo implicado en el proceso de apoptosis por vía intrínseca. Este complejo surge de la unión de la proteínaApaf-1 (factor de activación de la apoptosis) con el citocromo c.¹ El apoptosoma produce la activación de la procaspasa 9, para dar lugar a la caspasa 9. Se producen una serie de activaciones en cascada hasta llegar a la caspasa 3,² la cual se encarga de la activación de CAD (desoxirribonucleasa) separándolo del inhibidor ICAD. CAD induce la fragmentación de DNA que conduce a la muerte celular por apoptosis.

El apoptosoma es una gran estructura de la proteína cuaternario formado en el proceso de la apoptosis. Su formación es desencadenada por la liberación de citocromo c de la mitocondria en respuesta a un estímulo interno o externo de la muerte celular. Los estímulos pueden variar de un daño en el ADN y la infección viral a las señales de desarrollo tales como las que conducen a la degradación de la cola de un renacuajo.

En células de mamíferos, una vez que el citocromo c se libera, se une a la proteína citosólica Apaf-1 para facilitar la formación del apoptosoma. Un estudio bioquímico temprano sugiere una relación de doce y cincuenta y ocho minutos de la tarde del citocromo c a Apaf-1 para la formación del apoptosoma. Sin embargo, los estudios estructurales recientes sugieren que el citocromo c a Apaf-1 relación es de uno a uno. También se ha demostrado que el nucleótido dATP como tercer componente se une a Apaf-1, sin embargo, su papel exacto todavía se debate. El apoptosoma mamíferos nunca se había cristalizado, sino una APAF-1/cytochrome-c humana apoptosoma se ha reflejado en la resolución más baja por vía criogénica microscopía electrónica de hace 10 años, revelando una rueda-como partículas con simetría de 7 veces. Recientemente, una estructura de resolución media de apoptosoma humano también fue resuelto por crio-microscopía electrónica, lo que permite inferir sin ambigüedades para las posiciones de todos los Apaf-1 dominios y citocromo c.

 Una vez formado, el apoptosoma entonces puede reclutar y activar la inactiva pro-caspasa-9. Una vez activado, este caspasa iniciadora puede entonces activar las caspasas efectoras y desencadenar una cascada de eventos que conducen a la apoptosis.

Historia

El término apoptosoma se introdujo por primera vez en 1998 el periódico de Yoshihide Tsujimoto "El papel de Bcl-2 la familia de proteínas de la apoptosis: apoptosomes o mitocondrias". Sin embargo, el apoptosoma se conocía antes de este tiempo como un complejo ternario. Este complejo implicado caspasa-9 y Bcl-XL, que cada una cota específica Apaf-1 dominio. La formación de este complejo fue entonces cree que juega un papel regulador en la muerte de células de mamíferos. En diciembre del mismo año, otro artículo fue publicado en The Journal of Biological Chemistry indicando que Apaf-1 es el regulador de la apoptosis a través de la activación de procaspasa-9.

Los criterios para una apoptosoma fueron presentados en 1999 - En primer lugar, debe ser un gran complejo. En segundo lugar su formación requiere la hidrólisis de un enlace de alta energía del ATP o dATP. Y, por último, debe activar la procaspasa-9 en su forma funcional. La formación de este complejo es el punto de no retorno, y se producirá apoptosis. El complejo mutimeric estable Apaf-1 y citocromo ajustan a esta descripción, y ahora se llama el apoptosoma.

Se pensaba que el apoptosoma ser un complejo mutimeric por dos razones. En primer lugar, para llevar múltiples procaspasa-9 moléculas muy juntas para la escisión. Y en segundo lugar, para elevar el umbral de la apoptosis, por lo tanto, las fugas no específico del citocromo c sería no dar lugar a la apoptosis.

Una vez que el apoptosoma se estableció como el activador de procaspasa-9, las mutaciones en esta vía se convirtió en un área de investigación importante. Algunos ejemplos incluyen las células de leucemia humana, cáncer de ovario y las infecciones virales. Áreas de investigación actuales de esta vía se discutirán con más detalle. Hay rutas ocultas para la muerte celular, así, que son independientes de Apaf-1 y por lo tanto el apoptosoma. Estas rutas también son independientes de la caspasa-3 y 9 - Estas vías ocultas para la apoptosis son más lentos, pero pueden resultar útiles con la investigación adicional.

Estructura

El apoptosoma es un complejo de holoenzima multimolecular montado alrededor de la proteína adaptadora APAF1 a la apoptosis mediada por mitocondrias que debe ser estimulada por algún tipo de señal de esfuerzo de la formación de T de la apoptosoma requiere la presencia de ATP/dATP y el citocromo c en el citosol. Un estímulo estrés puede desencadenar la liberación de citocromo c en el citoplasma que se unirá entonces a la C-terminal de Apaf-1 dentro de una región que contiene múltiples repeticiones WD-40. La oligomerización de Apaf-1 parece estar acompañada por el reclutamiento sincronizada de la procaspasa-9 al motivo TARJETA en el extremo N-terminal de Apaf-1. El apoptosoma desencadena la activación de las caspasas en la vía intrínseca de la apoptosis.

El complejo heptameric en forma de rueda con estructura de simetría séptuple de la apoptosoma fue puesto de manifiesto por primera vez en 27 resolución por cryomicroscopytechniques de electrones y tiene una masa calculada de alrededor de 1 MDa. Esta rueda-como partícula tiene siete radios y un concentrador central. La región distal del radio tiene una forma de Y pronunciada. El dominio del concentrador está conectado al dominio Y por un brazo doblado. Cada dominio Y comprende dos lóbulos entre los que los sitios de unión del citocromo c. Debido a que la resolución de la estructura apoptosoma fue relativamente baja, se propusieron dos modelos controvertidos para el montaje apoptosoma. Un modelo sugiere dominios NOD forman el cubo central y los dominios CARD forman un anillo más libre en la parte superior de la región NOD. Otro modelo propone que Apaf-1 está organizado de una manera extendida de tal manera que tanto la tarjeta de N-terminal y la región de unión de nucleótidos que forma el eje central de la apoptosoma, mientras que las 13 repeticiones WD-40 constituyen los dos lóbulos. La gran lóbulo está formado por siete repeticiones y el pequeño lóbulo está formado por seis repeticiones. Cada caspasa-9 molécula se une a un dominio CARD en el eje central, formando una estructura en forma de cúpula. Esta controversia se ha resuelto mediante una estructura reciente de alta resolución del complejo apoptosoma-procaspasa-9 TARJETA humano. Esta estructura demostró claramente que sólo las regiones NOD forman el eje central de la apoptosoma, mientras que la tarjeta está flexible vinculado a la plataforma de apoptosoma y se vuelve desordenada en el estado fundamental apoptosoma. Una vez apoptosoma se une a la procaspasa-9, los Apaf-1 tarjetas y procaspasa-9 cartas forman un disco flexible de estructura similar que se sienta encima de la plataforma. El número de repeticiones WD-40 también ha sido demostrado ser 15 en lugar de 13, y se compone de un 7-beta-hélice de palas y una beta-hélice 8 palas.

La evidencia de Wang y colegas indica que la relación estequiométrica de la procaspasa-9 a Apaf-1 dentro del complejo es de aproximadamente 1:01. Esto se demostró adicionalmente mediante análisis de espectrometría de masas cuantitativa. La estequiometría de citocromo c a Apaf-1 dentro del complejo se prueba que es 1:01. Hay algunos debates sobre si es necesaria la incorporación estable de citocromo c en el apoptosoma después de oligomerización, pero los datos estructurales recientes favorecen la idea de que el citocromo c estabiliza el oligómero apoptosoma humano. Sin embargo, el citocromo c puede no ser necesaria para el montaje de apoptosoma en las especies animales no mamíferos, como los gusanos y las moscas de la fruta. Además, varias otras moléculas, más notablemente la caspasa-3, se ha informado que co-purifica con el apoptosoma y la caspasa-3 se ha demostrado ser capaz de unirse al complejo apoptosoma-procaspasa-9.

Apaf-1 es la columna vertebral del apoptosoma. Tiene tres regiones distintas: el dominio de reclutamiento de caspasas-N-terminal, una región de unión a nucleótidos y oligomerización central y una región C-terminal de WD40 que componen una proteína de aproximadamente 140 kDa.

• El dominio CARD de Apaf-1 interactúa con procaspase-9 y participó en el reclutamiento dentro de la apoptosoma.
• La región NB-ARC/NOD exhibe una importante secuencia similar a la C. elegans proteínas Ced-4.
• La región C-terminal de WD40 APAF1 contiene 15 WD-40 repite estructurados en dos dominios b-en forma de hélice. WD-40 son repeticiones de secuencias de alrededor de 40 aminoácidos de longitud que terminan en Trp-Asp y normalmente están involucrados en la interacción proteína-proteína.

Un enlazador corto y dominios a/b de unión de nucleótidos que contienen cajas conservadas Walker A y B siguen el dominio CARD N-terminal. El Walker cajas A/B son fundamentales para dATP/ATP y Mg 2 vinculante. Después de la NBD es un pequeño dominio helicoidal, un segundo enlazador y un dominio hélice alada conservada. La región NOD comprende NBD, HD1 y del DMS, la creación de un dominio de ATPasa que es parte de la familia de ATPasas AAA . No es un super helicoidal dominio presente en la unión entre el NOD y las repeticiones WD-40. Las repeticiones WD40 están en grupos de ocho y siete con enlazadores que los conectan.

Mecanismo de acción

Inicio

El inicio de la acción apoptosoma corresponde con los primeros pasos en la vía de la muerte celular programada. En los animales, la apoptosis puede ser catalizada en una de dos maneras; la vía extrínseca implica la unión de ligandos extracelulares a receptores transmembrana, mientras que la vía intrínseca tiene lugar en las mitocondrias. Esta vía intrínseca implica la liberación de citocromo c de la mitocondria y la posterior unión a la proteína citosólica Apaf-. La liberación del citocromo c es por lo tanto necesaria para la iniciación de la acción apoptosoma; esta versión se regula en un número de maneras, lo más importante de la detección de los niveles de iones de calcio.

Liberación del citocromo c

Liberación del citocromo c, se propone que tenga lugar en una de dos maneras. En primer lugar, el poro de transición de permeabilidad en la mitocondria recibe una señal que induce la muerte, y libera espacio intermembrana proteínas. La PTP se compone de el canal de aniones dependiente de voltaje, la proteína de membrana transponedor de nucleótidos de adenina interior y la matriz de proteína ciclofilina D. Esta poros hace que la mitocondria se hinche y la membrana mitocondrial externa a la ruptura. Con este cambio en la permeabilidad, proteínas tales como citocromo c se liberan en el citosol. Este cambio probablemente hace que la transición de la permeabilidad mitocondrial, donde los derrumbes potenciales transmembrana mitocondrial y la producción de ATP cesa. La inhibición de este método por el agente farmacéutico ciclosporina A, conduce al descubrimiento de la segunda vía. El segundo método de liberación de citocromo c es independiente de la PTP y sólo implica la VDAC. Los miembros de la familia Bcl-2 de proteínas pro-apoptóticas pueden inducir la apertura de la VDAC. Esto hará que la misma liberación de proteínas espacio intermembrana, incluyendo citocromo c, y la posterior MPT a ocurrir.

Apaf-1

 un. Ausencia de citocromo c

En la ausencia de citocromo c, Apaf-1 existe en su forma monomérica, se cree que el dominio WD-40 siguen siendo plegada de nuevo en la proteína, manteniendo Apaf-1 en un estado de auto inhibido. Además, varias áreas están enrolladas con tanta fuerza que la proteína es incapaz de unirse a cualquier otra cosa. Se ha determinado a través de espectrometría de masas que en el estado autoinhibited, o "bloqueado", ADP se une al dominio ATPasa de Apaf-1. En este estado, esta proteína es singular, y es incapaz de activar cualquier caspasas.

 b. Presencia de citocromo c

El citocromo c se une al dominio WD-40 de Apaf-1. Esto permite que el "bloqueo" está en libertad, es decir, este dominio ya no es autoinhibited. Sin embargo, los dominios CARD y NB-ARC permanecen en estado autoinhibited. El dominio CARD sólo se dará a conocer a partir de este bloqueo cuando Apaf-1 se une a ATP/ATP; cuando el ATP se une, el dominio CARD a continuación, se dejó que se uniera a la caspasa-9. Cuando ADP es en el dominio ATPasa, oligomerización se inhibe. Por lo tanto, la unión de ATP también permite para la oligomerización de Apaf-1 en la estructura heptagonal necesaria para la activación de caspasas corriente abajo. Las mutaciones en el dominio ATPasa hacen que la proteína inactiva, sin embargo, el método de controlar este intercambio ADP-ATP no está claro. La oligomerización puede por lo tanto sólo se producen en la presencia de moléculas de citocromo c 7, 7 proteínas Apaf-1 y suficiente ATP/ATP. El dominio ATPasa pertenece a la familia de AAA ATPasas, esta familia es conocida por su capacidad de vincular a otros dominios ATPasa y la forma hexa-o heptamers. El apoptosoma es entonces considerado activo cuando hay siete Apaf-1 moléculas dispuestas en una estructura de rueda, orientados de tal manera que la NB-ARC dominios de descanso en el centro.

Acción apoptosoma Activo

Esto entonces apoptosoma funcional puede proporcionar una plataforma de activación de la caspasa 9. La caspasa 9 existe como un zimógeno en el citosol y se cree que se encuentra en 20 nM en células. A pesar de que se sabe que no tiene que ser escindido para el zimógeno para convertirse en activa, la actividad de la procaspasa-9 puede aumentar de manera significativa una vez que escinde. La primera hipótesis es que el apoptosoma proporciona una ubicación para la dimerización de dos moléculas de caspasa 9 antes de la escisión, esta hipótesis se vio favorecido por Reidl y Salvasen en 2007 - La segunda es que el corte se lleva a cabo mientras que la caspasa 9 se encuentra todavía en su forma monomérica. En cada caso, la activación de caspasa 9 conduce a la activación de una cascada de caspasas completo y posterior muerte celular. Se ha sugerido que la razón evolutiva para el complejo de proteína multimérica la activación de la cascada de caspasas es para asegurar cantidades traza de citocromo c no causar accidentalmente la apoptosis.

Áreas de Investigación

¿Qué sucede cuando se producen las mutaciones?

Mientras que la apoptosis se requiere para la función natural del cuerpo, las mutaciones de la vía apoptosoma causan efectos catastróficos y los cambios en el cuerpo. Las mutaciones del camino de la célula o bien pueden promover la muerte celular o la muerte celular no permitir la creación de una gran cantidad de enfermedad en el cuerpo. Vías de la apoptosis mutadas que causan la enfermedad son abundantes y tienen una amplia gama de cáncer, debido a la falta de actividad apoptosoma, la enfermedad de Alzheimer debido a la actividad demasiado apoptosoma, y muchas otras enfermedades neurodegenerativas tales como la enfermedad de Parkinson y la enfermedad de Huntington. Las enfermedades neurodegenerativas tales como la enfermedad de Alzheimer, Parkinson, Huntington y son todas las enfermedades relacionadas con la edad e implican aumento de la apoptosis en donde las células que mueren son todavía capaces de funcionar o que contribuyen a apoyar la función del tejido. Apaf-1-ALT es una Apaf-1 mutante que se encuentra en el cáncer de próstata, que no tiene residuos de 339-1.248 - estudios estructurales recientes de apoptosoma probar que Apaf-1-ALT no puede formar apoptosoma como se echa de menos componentes estructurales clave para el montaje.

La represión de la apoptosis causando cáncer

Las anomalías genéticas y bioquímicas dentro de una célula generalmente provocan la muerte celular programada para librar el cuerpo de la función celular irregular y desarrollo, sin embargo, las células cancerosas se han adquirido mutaciones que les permiten reprimir la apoptosis y sobreviven. La quimioterapia como la radiación ionizante se han desarrollado para activar estas vías PCD reprimidos por hiper-estimulación para promover PCD normal.

Las mutaciones de p53 en la apoptosis

Funciones P53 como un supresor tumoral que está implicada en la prevención del cáncer y se encuentra naturalmente en las vías de apoptosis. P53 hace que las células para entrar en apoptosis y alterar la división celular por lo tanto, la prevención de esa célula se vuelva cancerosa. En la mayoría de los cánceres es la vía de p53 que se ha convertido mutado resulta en la falta de capacidad de terminar células disfuncionales. La función de p53 también puede ser responsable de un período de vida limitado en el que las mutaciones del gen p53 hace que la expresión de formas dominante-negativas productoras de animales de larga vida. Por ejemplo, en un experimento utilizando C. elegans, el aumento de la vida útil de los mutantes de p53 se encontró que depender de aumento de la autofagia. En otro experimento utilizando Drosophila la mutación de p53 tuvo efectos tanto positivos como negativos en la vida adulta, que llegó a la conclusión de un vínculo entre la diferenciación sexual, PCD y el envejecimiento. La determinación de la p53 están afectando vida será un área importante para la investigación futura.

Apuntando al apoptosoma para la terapia del cáncer

La inhibición de la apoptosis es una de las características clave de cáncer por lo que encontrar maneras de manipular y superar esta inhibición para formar las caspasas apoptosoma y activar son importantes en el desarrollo de nuevos tratamientos contra el cáncer. La capacidad de causar directamente la activación de apoptosoma es valiosa en terapias contra el cáncer debido a que los genes cancerosas infectadas son incapaces de ser destruido causando una continuación del cáncer a formar. Al activar el apoptosoma por un estímulo externo apoptosis puede ocurrir y deshacerse de las células mutadas. Numerosos enfoques para lograrlo se están realizando actualmente incluyendo biomoléculas recombinantes, estrategias antisentido, terapia genética y la química combinatoria orgánica clásica apuntar reguladores de apoptosis específicos en el enfoque para corregir la muerte celular excesiva o deficiente de las enfermedades humanas.

En general, la regulación de proteínas anti-apoptóticas conduce a la prevención de la apoptosis que puede ser resuelto por los inhibidores y la regulación a la baja de proteínas anti-apoptóticas conduce a la inducción de la apoptosis que se invierte por activadores que son capaces de unirse y modificar su actividad. Una molécula diana importante en las terapias basadas en la apoptosis Bcl-2 es para el diseño de fármacos. Bcl-2 fue el primer oncogén encontrado que causa cáncer de inhibición de la apoptosis. Se sobreexpresa en los tumores y es resistente a la quimioterapia. Los científicos han encontrado que los depresores de unión a Bcl-2 proteínas anti-apoptóticas les inhibe y deja activadores directos libre para interactuar con Bax y Bak.

Otra molécula objetivo para la terapia del cáncer involucra la familia de las caspasas y sus reguladores. La inhibición de la muerte celular bloquea la actividad caspasa en las enfermedades humanas incluyendo enfermedades neurodegenerativas, accidentes cerebrovasculares, ataques cardíacos y daño hepático. Por lo tanto, los inhibidores de caspasas son una herramienta farmacológica prometedora proporcionar tratamientos para enfermedades humanas accidente cerebrovascular y otros. Hay varios inhibidores de caspasa que se encuentran actualmente en la etapa preclínica que han demostrado evidencia prometedora de revertir los efectos de algunas enfermedades neurodegenerativas. En un reciente estudio, los investigadores desarrollado un inhibidor reversible de la caspasa-3 llamado M-826 y probado en un modelo de ratón en el que bloqueó daño del tejido cerebral. Además, se ensayó en un ratón con la enfermedad de Huntington y el inhibidor impidió la muerte de neuronas estriado revelar efectos prometedores para el estudio adicional de este inhibidor de la caspasa.

Complejo apoptosoma ha revelado nuevos objetivos potenciales para la terapia molecular

La formación del apoptosoma Apaf1/caspase-9 es un evento crucial en la cascada apoptótica. La identificación de nuevos fármacos potenciales que impiden o estabilizar la formación del complejo apoptosoma activo es la estrategia ideal para el tratamiento de la enfermedad caracterizada por la apoptosis excesiva o insuficiente. Recientemente se ha encontrado taurina para prevenir la apoptosis inducida por isquemia en los cardiomiocitos a través de su capacidad para inhibir la formación de Apaf1/caspase-9 apoptosoma sin la prevención de la disfunción mitocondrial. El posible mecanismo por el cual taurina inhibe la formación del apoptosoma fue identificado como siendo capaz de reducir la expresión de la caspasa-9, un componente fundamental de apoptosoma. Sin embargo, hay estudios que muestran Aparf1 y la caspasa-9 tienen funciones independientes distintos del apoptosoma alterando así sus niveles podría alterar la función celular, así. Así que a pesar de los datos alentadores experimentales varios problemas siguen sin resolverse y que limitan el uso de drogas experimentales en la práctica clínica.

El descubrimiento de los inhibidores de apoptosoma proporcionará una nueva herramienta terapéutica para el tratamiento de la enfermedad mediada por la apoptosis. De particular importancia son los nuevos compuestos capaces de inhibir la estabilidad apoptosoma y la actividad, actuando sobre intracelulares interacciones proteína-proteína sin alterar los niveles de transcripción de los componentes apoptosoma. Recientes estudios estructurales de apoptosoma pueden proporcionar valiosas herramientas para el diseño de terapias basadas apoptosoma.