biología celular

La alfa actinina o actinina α es una proteína de unión a actina especialmente abundante en los sarcómeros del músculo esquelético. En las células eucariotas, la alfa actinina se asocia a la actina-tropomiosina en fases tempranas de la diferenciación, participando en el establecimiento de la red de microfilamentos. Además, la alfa actinina interviene junto con las cateninas y las cadherinas en la comunicación entre el exterior celular (esto es, con las estructuras de adhesión celular y el citoesqueleto.

La a-actinina, un homodímero con subunidades de 95-100 kDa de peso molecular, que juega un papel decisivo en el proceso de contracción de la célula muscular cardíaca (PELOUCH, 1995), fue inicialmente descrita en músculo esquelético (EBASHI & EBASHI, 1965) y posteriormente en músculo liso (BRETSCHER et al., 1979) y células no musculares (LANDON et al., 1985; DUHAIMAN & BAMBURG, 1984; IMAMURA & MASAKI, 1994). Esta proteína presenta diferentes isoformas las cuales se diferencian por su sensibilidad al calcio (SENGER & GOLDMAN, 1995) y por su localización ultraestructural. Así, en músculo liso, la a-actinina forma cuerpos densos que recuerdan a las bandas Z del músculo estriado (CHON et al., 1995), mientras que en las células no musculares, como describió LAZARIDES & BURRIDGE (1975), se sitúa a lo largo de las fibras de stress con una distribución periódica parecida a los sarcómeros musculares. En el músculo es quelético esta proteína forma parte de las bandas Zdonde interacciona con la actina (HENG et al., 1995), actuando como punto de anclaje para la preformación de filamentos delgados. La modificación de su expresión a lo largo de la maduración de la célula muscular tiene importantes implicaciones en la función contráctil de este tipo de células (PELOUCH et al.).

Dado que la estructuración del citoesqueleto de la célula muscular está directamente relacionada con el grado de maduración celular (FRANKE & SCHMID, 1982), diferentes estudios han examinado la modulación de la expresión de sus proteínas constitutivas. Así, análisis realizados sobre el patrón de expresión de las proteínas de filamentos intermedios en el miocardio a lo largo del desarrollo, han permitido determinar la utilidad de estas proteínas como marcadores del grado de diferenciación de la célula muscular cardíaca (FARRELL et al., 1989). Por otra parte, usando cultivos de células musculares, se ha podido demostrar la modulación de la expresión de la troponina T (VELEZ et al., 1992), el titín y la desmina (VAN DERVEN et al., 1992) en relación al grado de maduración celular. En este contexto, y utilizando miocardiocitos en cultivo y secciones criostáticas de corazón de pollo como modelos experimentales donde poder observar la expresión de proteínas durante el desarrollo, nos proponemos describir el patrón de expresión y la modificación en la localización ultraestructural de la a-actinina en la célula muscular cardíaca y determinar su posible utilización como marcador del grado de diferenciación muscular.

MATERIAL Y METODO

Inmunofluorescencia en secciones criostáticas de tejido

Huevos fértiles de pollo (White Leghorn), con una baja tasa de mutaciones espontáneas (ARANEGA et al., 1985), fueron incubados a 37.5^ºC con una humedad relativa del 80% para obtener embriones de los estadios 18HH, 29HH y 36HH (HAMBURGER & HAMILTON, 1951). Los corazones, congelados en nitrógeno líquido, tras ser embebidos en medio de congelación específico para tejidos OCT (Tissue Tek, Miles Laboratories, Naporville, IL), fueron cortados en secciones criostáticas (5-7µm) (criostato Bright FS/FAS, Huntingdon, UK) que fueron secadas durante 45min y fijadas en acetona a -4^ºC (5-10 min). Las secciones fueron incubadas con un anticuerpo monoclonal (mAb) específico para a-actinina (isoforma muscular no sensible al calcio) (1:20) (PRADOS et al., 1993) durante 45 min a temperatura ambien te. Después de lavar con PBS, se procedió a la segunda incubación con un mAb conjugado FITC frente a IgM de ratón (1:50) en una cámara oscura durante 60 min. Las preparaciones, lavadas con PBS y montadas en fluido acuoso (FA) a pH 7.2 (Difco Laboratories, Detroit, MI), fueron observadas al microscopio de fluorescencia (Nikon HFXIIA) y fotografiadas (cámara Nikon FX-35WA). Los controles negativos se realizaron omitiendo la primera incubación con mAb.

Obtención de miocardiocitos en cultivo

Los miocardiocitos fueron obtenidos siguiendo la técnica de COLE & PAUL (1966) modificada por ARANEGA et al. (1991). Los corazones de embriones de pollo de los estadios a analizar fueron cortados en piezas (2-4 mm²) e incubados en una solución de tripsina (0.5 g/l) y EDTA (0.2 g/l) (Sigma, St. Louis, CA) a una concentración de 1 ml de solución por cada 100 mg de tejido. El tejido fue digerido durante 18 h a 4^ºC. Después de retirar el sobrenadante, el tejido fue incubado a 36^ºC durante 30 min, añadiendo inmediatamente después 2 ml de medio Dubelcos modificado (Flow, Irvine, CA) suplementado con el 20% de suero fetal bovino (Flow). El tejido fue disgredado mediante repetidos pases por una pipeta Pasteur, colocando las células (10⁶ células/ml) en un frasco de cultivo y tratándolas con colágeno (6 mg/cm₂) (Sigma) (LEIGTHON et al., 1968). La contaminación por células no musculares se evitó añadiendo al cultivo cistina-b-D-arabinofuranoside 10µM (Sigma) los días 1 y 3 de cultivo (CLAYCOMB & MOSES, 1985). La viabilidad celular se determinó mediante microscopio invertido (Baush y Lomb, Photozoom SE-778, Rochester, NY), usando azul tripan (Sigma) como tinción vital.

Inmunofluorescencia de los miocardiocitos

Tras 4 días de cultivo en cámaras estériles montadas sobre portaobjetos (Chamber-slides, ICN), los miocardiocitos se lavaron con PBS y se fijaron con metanol a -20^ºC (3 min). Tras lavarlos con PBS a 4^ºC, se trataron con PBS más Tritón X-100 (0.4%) (Sigma) (3 min.), incubándolos a temperatura ambiente con el mAb frente a a-actinina (1:50) durante 45 min. Seguidamente se realizaron 2 lavados con PBS, procediendo a la segunda incubación (mAb-FITC)durante 60 min. La coloración del núcleo se realizó con yoduro de propidio (Sigma) (20µM/ml)(10 min.) en una cámara oscura y a temperatura ambiente. Las preparaciones fueron montadas con una solución de PBS al 10% y glicerol al 90% (Difco, Detroit, USA) y observadas mediante el microscopio de fluorescencia con un filtro para FITC.

RESULTADOS

Expresión de a-actinina en el corazón embrionario de pollo

El análisis del estadio 18 HHdel desarrollo cardíaco demostró una débil positividad para el marcaje de a-actinina (Fig. 1A). En este estadio el marcaje fue difuso no encontrando diferencias en la intensidad de expresión de esta proteína entre las diferentes cámaras cardíacas (datos no mostrados). Los análisis mediante inmunofluorescencia del estadio 29 HH del desarrollo cardíaco del pollo demostraron un cambio en el patrón de marcaje de la a-actinina; la intensidad de marcaje sufrió un aumento indicando un notable aumento de la expresión de la proteína (Fig. 1B). Además, este incremento fue más notable en el miocardio ventricular (Fig. 1C). En los estadios más avanzados del desarrollo cardíaco (36 HH)aparecieron unas características de marcaje similares a las encontradas en el estadio 29 HH,aunque la expresión de a-actinina fue mayor.

Fig. 1. Estudio mediante inmunofluorescencia indirecta de la expresión de a-actinina en criosecciones de corazón embrionario de pollo. A, Débil expresión de a-actinina en el miocardio de embrión del estadio 18 HH (x10). B, Marcaje del miocardio de un embrión del estadio 29 HH donde se observa un aumento en la expresión de a-actinina (x10). C, Detalle de la mayor expresión de a-actinina en el miocardio ventricular de un embrión del estadio 29HH (x20).

Patrón de marcaje de a-actinina en miocardiocitos en cultivo

El estudio del patrón de marcaje de a-actinina en miocardiocitos de pollo de diferentes estadios evolutivos, confirmó el progresivo aumento en la intensidad de marcaje conforme se desarrolla el corazón. Los análisis de los miocardiocitos de estadios tempranos del desarrollo (18HH),demostraron una débil expresión de esta molécula que marcó fundamentalmente la membrana celular (Fig. 2A). En este estadio el marcaje de a-actinina fue escaso en el citoplasma celular aunque aparecieron algunas zonas con mayor intensidad de marcaje (Fig. 2A). El análisis de los estadios posteriores del desarrollo cardíaco demostraron un aumento de la intensidad de marcaje en el citoplasma celular, observándose en el estadio 29 HH un patrón de marcaje caracterizado por la presencia de una expresión lineal de a-actinina a lo largo del eje longitudinal de la célula (Fig. 2B). Un patrón similar fue detectado en miocardiocitos del estadio 36 HH pero con un marcaje lineal más intenso. Estas zonas intensas de marcaje se caracterizaron por conectar con la membrana citoplasmática siguiendo la polarización del miocardiocito (Fig. 2C).

Fig. 2. Estudio mediante inmunofluorescencia indirecta de la expresión de a-actinina en cultivos de miocardiocitos obtenidos de corazón embrionario de pollo. A, Débil expresión de a-actinina en la membrana celular de miocardiocitos del estadio 18 HH y marcaje difuso en el citoplasma (x100). B, Aparición de un patrón de marcaje lineal de a-actinina en miocardiocitos del estadio 29 HH (x100). C, Miocardiocitos del estadio 36 HH mostrando un intenso patron de expresión lineal de la a-actinina que conecta con la membrana celular (x100).

DISCUSION

Nuestros resultados muestran que la a-actinina es una de las proteínas que se expresan en los estadios más tempranos del desarrollo cardíaco, apareciendo antes que otras de gran importancia para la función del sarcómero como son la actina, la miosina y la tropomiosina (WANG et al., 1988; GREGORIO & FOWLER., 1995).El estudio con miocardiocitos en cultivo del estadio 18 HHdemostró la preferente distribución de a-actinina en la membrana celular donde parece intervenir en la función de adhesión celular (KNUDSEN et al., 1995). Esta localización de la a-actinina juega un papel importante en el mantenimiento de la polarización de la membrana a través de su interacción con ella (DOS SANTOS et al., 1988).

En estadios más avanzados del desarrollo cardíaco (29HH) se observó un aumento significativo en la expresión de a-actinina, que interesantemente coincide con cambios en la expresión de proteínas de filamentos intermedios (VELEZ et al., 1990) como la vimentina y la desmina que aunque se coexpresan en este estadio, presentan un patrón de expresión inverso, disminuyendo la primera y aumentando la segunda. En periodos cercanos al estadio 29 HH también se produce un incremento en la expresión de tropomiosina (PRADOS et al., 1992) que pasan de sintetizarse en el citoplasma a integrarse en el citoesqueleto celular, hecho este también observado en la expresión de a-actinina (PRADOS et al., 1993). Este conjunto de modificaciones en la expresión de proteínas de la célula miocardiocítica sugiere que el periodo próximo al estadio 29 HH del desarrollo cardíaco es de enorme importancia en la maduración morfofuncional del corazón. De hecho, la principal modificación en la localización ultraestructural de la a-actinina fue observada en miocardiocitos del estadio 29 HH, donde además de la expresión en membrana apareció marcando intensamente el citoplasma celular. Estudios mediante microinyección celular de actina, vinculina y a-actinina marcadas con fluoresceina, sostienen la existencia de un equilibrio dinámico entre la fracción soluble de estas proteínas presente en el citoplasma y una fracción que se encuentra unida a membrana (GEIGER et al., 1984) así como la existencia de una intensa síntesis proteica (LI & LEMANSKI, 1990) que ha sido relacionada con un incremento en el número de proyecciones citoplasmáticas en este tipo de células. Nuestros resultados demuestran que la a-actinina en miocardiocitos del estadio 29 HH presenta un patrón de marcaje lineal de forma paralela al eje longitudinal de las células, lo que sugiere su presencia en las miofibrillas donde es necesaria como centro de organización de la preformación de filamentos de actina mediante sitios específicos de unión (MCGOUGHet al., 1994). Esta interacción, demostrada mediante estudios con calpaina (GOLL et al., 1991) y proteasa neutral activada por calcio (CAF) (YAMAGUCHI et al., 1982) que liberan a-actinina del disco Z sin alterar su habilidad para unir actina, parece ser también de gran importancia para la función dinámica de los miocardiocitos (GLUCK & BEN-ZE´EV, 1994), y depende de la expresión de ambas proteínas. Estudios recientes relacionan esta expresión con cambios en los niveles del factor de crecimiento básico derivado de fibroblastos (bFGF) (VELEZ et al., 1995;PARKER et al., 1990), aunque otros factores como el factor de crecimiento epidérmico (EGF), que regula las señales de crecimiento y diferenciación celular (HILL & STRAIN, 1989), pueden jugar un papel importante en la estructuración de citoesqueleto de la célula muscular (GAMIZ et al., 1993). Futuros estudios serán necesarios para dilucidar el papel de los factores de crecimiento en la modulación de la expresión de la a-actinina cardíaca durante el desarrollo.

El objetivo de este estudio ha sido analizar el patrón de expresión y los cambios en la distribución ultraestructural de la a-actinina a lo largo del desarrollo cardíaco de pollo. Nuestros resultados demuestran que esta proteína se localiza preferentemente en la membrana plasmática de los miocardiocitos de los estadios más tempranos, presentando una expresión difusa en su citoplasma. El cambio en la distribución del patrón de marcaje en el estadio 29 HH, en el que la a-actinina se expresa con mayor intensidad en el miocardio ventricular y adopta una disposición lineal a lo largo de las miofibrillas, sugiere una gran importancia de este estadio en el proceso de maduración morfofuncional del corazón. El patrón de distribución ultraestructural de la a-actinina unido al aumento progresivo de su expresión a lo largo del desarrollo cardíaco, confirma la importancia de esta proteína en el proceso de diferenciación de la célula miocardiocítica.