Bioquímica del Metabolismo

Traducción: síntesis de la proteína

Contenido de esta página: proteínas de unión a GTP
iniciación de la síntesis de proteínas 
Elongación 
Terminación 
traducción eucariótica
Introducción: La cobertura de este tema será limitado. Detalles esenciales de la síntesis de proteínas se tratan en muchos cursos, y se presentan también en el libro de texto. Estas notas se centrarán enaspectos estructurales y de factores proteicos implicados en la iniciación, elongación y terminación de la síntesis de proteínas , muchas de las cuales son GTP vinculante  proteínas y otras proteínas que controlan el PIB / intercambio de GTP o actividad GTPasa de éstos de unión a GTP proteínas. Se pondrá énfasis en los mecanismos de traducción bacterianas. Cuanto más complejo proceso de la traducción de los mamíferos y su regulación se introducirá brevemente.

Proteínas de unión a GTP

Heterotriméricas proteínas G , y la familia relacionada de pequeñas proteínas de unión a GTP , se introducen en el apéndice de  señales celulares . Una proteína de unión a GTP tiene una conformación diferente dependiendo de si se ha unido a ella GTP o GDP. Por lo general, unido GTP estabiliza la conformación activa. La hidrólisis del GTP unido a GDP + P _i convierte la proteína a la conformación inactiva. La reactivación se produce por la liberación del PIB unido a cambio de GTP.

Proteínas de unión a GTP pequeños requieren proteínas de ayuda para facilitar el PIB / GTP intercambio o para promover la hidrólisis de GTP.

A g factor de intercambio de nucleótidos uanine (GEF) induce un cambio conformacional que hace que el sitio de unión de nucleótidos de una proteína de unión a GTP más accesible para el medio intracelular acuosa, donde GTP es generalmente presente en mayor concentración que el PIB. Así, un GEF provoca una proteína de unión a GTP para liberar PIB y se unen GTP (PIB intercambio / GTP).Una proteína GTPasa activación (GAP) hace que una proteína de unión a GTP para hidrolizar el GTP unido al PIB + P i . El sitio activo para la hidrólisis de GTP está en la proteína de unión a GTP, aunque el BPA puede contribuir un residuo del sitio activo esencial.

GEFs y BPA pueden regularse por separado. GEFs únicas y BPA interactúan con diferentes proteínas de unión a GTP.
Los miembros de la familia de pequeñas proteínas de unión a GTP tienen diversas funciones. En algunos casos, la diferencia en la conformación asociada con la sustitución de GDP por GTP permite una proteína de unión a GTP para servir como un " interruptor ". En otros casos, el cambio conformacional puede servir un papel mecánico o alterar la capacidad de la proteína que se unen a las membranas. F or una lista de algunas pequeñas proteínas de unión a GTP y sus funciones, consulte la sección sobre las señales celulares .
Iniciación de la síntesis de proteínas en E. coli requiere factores de iniciación SI-1, IF-2, y SI-3. La secuencia de eventos se resume en el diagrama de la p. 1323 de Bioquímica, tercera edición, por Voet y Voet ..
IF-3 se une a la subunidad ribosomal 30S , liberándolo de su complejo con la subunidad 50S.
SI-1 asistencias unión de la IF-3 a la subunidad ribosomal 30S. La unión de IF-1 también ocluye la Un sitio de dominio de la subunidad ribosómica pequeña, ayudando a asegurar que la iniciación aminoacil-tRNA, fMet-tRNA ^fMet , puede unirse sólo en el sitio P y que ningún otro aminoacil-tRNA se puede unir en el Un sitio durante la iniciación.
IF-2 es una pequeña proteína de unión a GTP . SI-2-GTP se une el iniciador fMet-tRNA ^fMet y ayuda a atracar con la subunidad pequeña del ribosoma.
A medida que el ARNm se une, IF-3 ayuda a posicionar correctamente el complejo tal que el tRNA ^fMet interactúa a través de apareamiento de bases con el ARNm codón de iniciación (AUG). Una región del ARNm aguas arriba del codón de iniciación, la secuencia de Shine-Dalgarno , pares de bases con el extremo 3 'del 16S rRNA . Esto posiciona la subunidad ribosómica pequeña en relación con el codón de iniciación.
A medida que la subunidad grande del ribosoma se une al complejo, GTP unido a IF-2 se hidroliza, que conduce a la disociación de la IF-2-PIB y disociación de IF-1.El subunidad ribosómica grande sirve como GAP (proteína activadora de GTPasa) para IF-2 .
Una vez que las dos subunidades ribosomales se juntan, el ARNm se enhebra a través de un canal curvado que se envuelve alrededor de la región "cuello" de la subunidad pequeña (ver ejercicio Chimeabajo).
Alargamiento requiere la participación de los factores de elongación EF-Tu (también llamado EF1A), EF-Ts (EF1B) y EF-G (EF2). Dos de ellos, EF-Tu y EF-G, son pequeñas proteínas de unión a GTP.
Ciclo de elongación: El siguiente diagrama, que muestra las posiciones de EF-Tu, EF-G y ARNt en relación con el ribosoma durante el ciclo de elongación, fue proporcionado por el Dr. Joachim Frank.

Colores: La subunidad grande del ribosoma es cian, la subunidad pequeña del ribosoma de color amarillo pálido, EF-Tu rojo, y EF-G azul. ARNt son grises (libre o complejo con EF-Tu), magenta (vinculante en el sitio), verde ( P en sitio), amarillo o marrón (en el proceso de salir).
Dr. Grupo de laboratorio de Frank en el Centro Wadsworth del Departamento de Salud del Estado de Nueva York, usa crio-ME y reconstrucción de imágenes 3D para determinar estructuras ribosomal y posiciones de EF-Tu y EF-G. Estructuras de EF-Tu y EF-G se basan en estudios de cristalografía de rayos X por separado. 

La secuencia de eventos , que se resumen en el diagrama de arriba y en la p. 1327, es el siguiente:

EF-Tu -GTP se une y ofrece una aminoacil-tRNA a la Un sitio en el ribosoma. EF-Tu reconoce y se une todo aminoacil-ARNt con aproximadamente la misma afinidad, cuando cada ARNt se une a la (cognado) amino ácido correcta. tRNAs para los diferentes aminoácidos han evolucionado para diferir ligeramente en estructura , para compensar las diferentes afinidades de unión de aminoácidos cadenas laterales, de modo que las aminoacil-ARNt tienen una afinidad similar para EF-Tu.

El tRNA debe tener el anticodón correcta para interactuar con el mRNA codón posicionado en el sitio A para formar un par de bases de la geometría apropiada.Universalmente conservadas bases de 16S rRNA interactúan con y detectan la configuración del surco menor del corto tramo de doble hélice formada a partir de las primera 2 pares de bases del complejo codón / anticodón . Un particular, conformación ribosomal se estabiliza por esta interacción, proporcionando un mecanismo para detectar si el tRNA correcto se ha unido. Corrección en parte implica la liberación de la aminoacil-tRNA antes de la formación del enlace peptídico, si la conformación ribosomal apropiado no es generado por esta interacción.El cambio en la conformación ribosomal asociada con la formación de un complejo codón-anticodón correcta conduce a posiciones alterados de residuos del sitio activo en el límite EF-Tu, con la activación de GTPasa EF-Tu actividad. El ribosoma por lo tanto funciona como GAP para EF-Tu.

Cuando EF-Tu entrega la aminoacil-ARNt al ribosoma, el ARNt inicialmente tiene una conformación distorsionada .Como GTP en EF-Tu se hidroliza a GDP + P i , EF-Tu sufre un cambio conformacional grande y se disocia del complejo. El ARNt conformación relaja, y el tallo aceptor se reposicionó para promover la formación de enlaces peptídicos. Este proceso se llama alojamiento . El alojamiento incluye la rotación de la monocatenario extremo 3 'del tallo aceptor de la A-tRNA sitio alrededor de un eje que divide el centro de peptidil transferasa de la subunidad ribosómica grande. Esto posiciona 'extremo con su ácido amino adjunta en el el 3 sitio activo , cerca de la 3 ' final de la P-tRNA sitio, y junto a la boca deltúnel a través del cual los polipéptidos nacientes salen del ribosoma. El diagrama de la derecha es del archivo a ser explorado por Chime continuación . Para imágenes que representan el movimiento de rotación propuesto, véase la fig. 5B en un sitio web mantenido por AE Yonath.

EF-Ts funciona como GEF para reactivar EF-Tu. Interacción con EF-Ts causa EF-Tu de liberar su PIB enlazado. Tras la disociación de EF-Ts, EF-Tu une GTP, que está presente en el citosol en mayor concentración que el PIB.

La diferencia en la conformación de EF-Tu, dependiendo de si el PIB o GTP ocupa su sitio de unión de nucleótidos, es evidente a partir de estructuras cristalinas para ser visto a continuación. En dos de los cristales, PIB N P , un análogo no hidrolizable de GTP, está presente en el sitio de unión de nucleótidos de EF-Tu.

Ejercicio del Estudio: Los estudiantes deben trabajar en grupos de 3 , con uno de los 3 archivos asignados a cada estudiante en el grupo . Utilice colores y muestra exactamente como se especifica en las instrucciones, por lo que las imágenes pueden ser comparados. Cada estudiante debe ver y comparar los 3 estructuras observando pantallas preparadas por otros miembros del grupo:

1. EF-Tu límite con el PIB
2. EF-Tu con el análogo de GTP GDPNP
3. EF-Tu con el análogo de GTP GDPNP y Phe-tRNA ^Phe .

EF-Tu-PIB

EF-Tu-GDPNP

EF-Tu-GDPNP-aa-tRNA

Pregunta:  ¿Tiene sustitución de GTP (GDPNP) para el PIB, o la unión de aa-tRNA, tienen un mayor efecto en la conformación de EF-Tu?

Transpeptidación (formación del enlace peptídico) implica el ataque nucleofílico del amino N del aminoácido que está vinculado a la hidroxilo 3 'de la adenosina terminal de la tRNA en el sitio en el carbonilo C del aminoácido (con polipéptido naciente adjunto) en éster vinculación con el tRNA en el sitio P . La reacción se promueve por la geometría del sitio activo que consiste únicamente de residuos de la 23S rRNA de la subunidad ribosómica grande.  No proteína se encuentra en el sitio activo. (Ejercicio de revisión Chime en la subunidad grande del ribosoma .) El 23S rRNA puede ser considerado un "ribozima ". Como parte de la reacción de un protón ( H + ) se extrae de la N. amino atacar Este H + es entonces donado a la hidroxilo del tRNA en el sitio P como el enlace éster se escinde. Se ha propuesto que un anillo N de un muy conservadas de adenosina en el sitio activo podría actuar como un catalizador de la mediación de este H +transferencia. Sin embargo, sobre la base de la evidencia estructural y mutacional reciente se ha concluido que el sitio activo adenina es esencial sólo como parte de la estructura del sitio activo que posiciona los sustratos correctamente.  H + shuttling se atribuye en lugar adyacente a la ribosa 2 ' hidroxilo grupo de la P-sitio de peptidil-tRNA, junto con ribosa hidroxilos de residuos de sitio activo de ARNr y moléculas de agua estructurados que colectivamente forman una red H-enlazado en el sitio activo. Para ver un diagrama de la figura 5 de la opinión por Rodnina et al .

El polipéptido naciente (un aminoácido más largo) está ahora vinculada a la A-sitio de ARNt. Sin embargo, la translocación se ha producido ya en parte, debido a la anterior rotación de la monocatenario extremo 3 ' de la A-tRNA sitio hacia el sitio P, que posiciona la fracción aminoacil para la catálisis. El ARNt descargado en el P sitio se desplazará hacia la E web (salida) durante la translocación.

La translocación del ribosoma en relación con el mRNA implica la proteína de unión a GTP- EF-G . Como se muestra anteriormente en el diagrama del ciclo de elongación, el tamaño y la forma de EF-G son comparables a la del complejo de EF-Tu con un aa-tRNA. Estudios estructurales y simulaciones de dinámica molecular indican que EF-G-GTP de unión en el entorno de la web A provoca unmovimiento de trinquete de la subunidad pequeña ribosomal contra la subunidad grande. El tRNA con polipéptido naciente unido se empuja desde el sitio A al sitio P, mientras que el tRNA ahora descargado que estaba en el sitio P se desplaza hacia el sitio E. Dado que los tRNAs están vinculados al ARNm por codón-anticodón emparejamiento de bases, el ARNm se mueve con relación al ribosoma.

Colores: La subunidad grande del ribosoma es cian, la subunidad pequeña del ribosoma amarillo pálido, EF-G azul y ARNt verde o amarillo. ARNm se representa como un collar de cuentas.  Esta cifra fue proporcionada por el Dr. Joachim Frank, del Centro Wadsworth del Departamento de Salud del Estado de Nueva York.

Además, se ha postulado que la translocación es espontánea después de la formación del enlace peptídico porque el tRNA desacilado en el sitio P tiene una mayor afinidad para el sitio E, y la peptidil-ARNt en el sitio A tiene una mayor afinidad por el sitio P.
La interacción con el ribosoma , que funciona como GAP (proteína activadora de GTPasa) para EF-G , provoca EF-G para hidrolizar GTP unido a su PIB + P _i . EF-G-PIB a continuación, se disocia del ribosoma. Un dominio de EF-G parece funcionar como su propio GEF (factor de intercambio de nucleótidos de guanina) para regenerar EF-G-GTP.
El codón-anticodón continuado de base de pelado de la tRNA en el sitio E está postulado para tener un papel en la prevención potencialmente graves marco turno errores, por ejemplo, tal como ocurriría si los tRNAs eran capaces de desplazar lateralmente por un par de bases. Normalmente, el tRNA vacío se libera desde el sitio E sólo después de la unión de la correcta aminoacil-tRNA en el sitio A causa una disminución de la afinidad para tRNA en el sitio E.
Explora debajo de la fracción 30S de un ribosoma bacteriano, complejado con un corto mRNA de ingeniería genética, y con tRNA ^Phe en cada uno de los A, P, y E (salida) sitios. Debido a la limitada resolución, proteínas y visualización rRNA sólo como columna vertebral. Archivo AP-1GIX: Estructura resuelto por MM Yusupov, GZ Yusupova, A. Baucom, K. Lieberman, TN Earnest, JHD Cate y HF Noller en 2001. La información estructural para la co-cristalizado subunidad 50S está en un archivo de datos separado (1GIY).

Opciones de visualización recomendados: Por separado seleccionar y mostrar cada uno de los siguientes como palos con color CPK : cadena de b (ARNt en un -sitio) cadena de c (ARNt en P -site) Ahora seleccione la cadena de 1 (uno) y pantalla como bola y se pegan con CPK color. Este es un pequeño fragmento de ARNm . Arrastre yun zoom para ver codón / anticodón apareamiento de bases entre el ARNm y ARNt en los sitios A y P. Tenga en cuenta la proximidad deaceptor se deriva de un sitio web & P-ARNt. Ahora seleccione la cadena d (ARNt en E -site), pantalla como palos con color CPK . Seleccione proteína , pantalla como columna vertebral con el color de la cadena . Seleccione una cadena (16S rRNA), y la pantalla columna vertebral .  Pregunta: ¿Qué componentes de la subunidad 30S ribosomal interactúan principalmente con ARNm y ARNt enlazado a sitios de A & P: rRNA o proteína?

C O N S P

Terminación de la cadena requiere la participación de liberan factores RF-1, RF-2, y RF-3. RF-3 es una pequeña proteína de unión a GTP. El proceso se resume en la p. 1335.
RF-1 y RF-2 reconocen y se unen a STOP codones. Uno u otro se une cuando se alcanza un codón de parada.
RF-3-GTP facilita la unión de RF-1 o RF-2 al ribosoma . Una vez que los factores de liberación ocupan el sitio A en el ribosoma, la ribosomal peptidil transferasa cataliza la transferencia del grupo peptidil al agua (hidrólisis). La hidrólisis de GTP en RF-3 , con el PIB + P _i , provoca un cambio conformacional que resulta en la disociación de liberar factores.
Un factor de reciclaje ribosomal ( RRF se requiere), con EF-G-GTP y IF-3 , para la liberación de tRNA no cargado desde el sitio P, y la disociación del ribosoma de mRNA con la separación de las dos subunidades ribosomales.

Sitios web con animaciones que representa la traducción de proteínas:

• Animación de alargamiento proteína  desde el laboratorio de J. Frank, del Centro Wadsworth, basado en Cryo-EM y observaciones de rayos X de las estructuras del ribosoma, factores de elongación, y ARNt.
• Animación de los ribosomas en la traducción desde el laboratorio de V. Ramakrishnan, basado en estructuras cristalinas de los ribosomas y diversos factores proteicos.

Traducción eucariótica.
La traducción del ARNm está altamente regulada en organismos eucariotas multicelulares, mientras que en procariotas regulación se produce principalmente a nivel de la transcripción.

• Hay regulación global de la síntesis de proteína, por ejemplo, en relación con el ciclo celular o en respuesta a las tensiones celulares, tales como el hambre o la acumulación de proteínas desplegadas en el retículo endoplásmico. Mecanismos incluyen la regulación por la señal activada por fosforilación o desfosforilación de factores de iniciación y elongación. 
• La traducción de mRNAs particulares puede ser inhibida por los pequeños de cadena simple de microARN moléculas de aproximadamente 20-22 nucleótidos de longitud. Los microARNs se unen a través de apareamiento de bases de 3 'regiones sin traducir de ARNm junto con un complejo de proteínas RISC (complejo de silenciamiento inducido por ARN), inhibición de la traducción y en algunos casos la promoción de la degradación del ARNm .
  • La expresión específica de tejido de determinados microRNAs genoma codificado es un mecanismo de regulación esencial controlar embrionaria de desarrollo .
  • Algunas formas de cáncer se asocian con la expresión alterada de microRNAs que regulan la síntesis de proteínas relevantes para la progresión del ciclo celular o apoptosis.

Proteína factores que median y traducción de control son más numerosos en eucariotas que en procariotas. Factores eucariotas se designan con el prefijo " e ".

• Algunos factores son altamente conservadas a través de reinos. Por ejemplo, el factor de elongación eucariótico eEF1A es estructural y funcionalmente similar a la procariota EF-TU (también llamado EF1A).
• En contraste, eEF1B , el equivalente eucariótico del factor de intercambio de nucleótidos de guanina EF-Ts , es relativamente complejo , que tiene múltiples subunidades que están sujetos a la fosforilación reguladora.

I nitiation de la síntesis de proteínas es mucho más complejo en eucariotas, y requiere un gran número de factores proteicos. Algunos factores de iniciación eucariotas (por ejemplo, eIF3 y eIF4G ) sirven como andamios , con múltiples dominios que se unen otras proteínas durante el montaje de complejos de iniciación grandes. Normalmente un pre-iniciación complejas formas, incluyendo varios factores de iniciación junto con la subunidad pequeña ribosomal y el iniciador cargado ARNt, Met-tRNA _i ^Met . Esto entonces se une a un complejo separado que incluye mRNA y otros factores de iniciación incluyendo los que interactúan con el 5 'methylguanosine tapa y el 3 'cola poli-A , estructuras únicas para mRNA eucariota. Dentro de este ARNm se piensa complejo para ser circularizado a través de interacciones entre los factores que se asocian con la tapa 5 'y con un poli-A proteína de unión. Un diagrama simplificado del complejo de iniciación eucariótico una vez que ha alcanzado el codón de iniciación se encuentra en el WormBook .
Después de que los complejos de iniciación ensambla, se transloca a lo largo del ARNm en un proceso llamado de exploración , hasta que se alcanza el codón de iniciación. La exploración se facilitó por el factor de iniciación eucariótico eIF4A , que funciona como una helicasa dependiente de ATP a relajarse estructura secundaria de ARNm, mientras que la liberación de las proteínas unidas. Una breve secuencia de bases adyacentes a AUG codón de iniciación puede ayudar en el reconocimiento del sitio de inicio. Después de que el codón de iniciación se reconoce , no es la hidrólisis del GTP y la liberación de factores de iniciación, como la subunidad ribosómica grande se une el complejo y el alargamiento comienza.
Para un resumen diagramas , consulte Voet y Voet p. 1324, y en la Figura 1 del artículo por Hinnebusch (requiere una suscripción a TIBS).

Algunos mRNAs eucarióticos tienen lo que se llama un sitio de entrada del ribosoma interno ( IRES ), lejos del 'extremo tapado 5, en el que la iniciación puede ocurrir sin el proceso de escaneado.