Bioquímica del Metabolismo

F ₁ F _o ATP sintasa

Contenido de esta página:
H ⁺ flujo vinculados a la síntesis de ATP o hidrólisis 
Composición y funciones de los principales dominios de la sintasa de ATP
Binding mecanismo de cambio de 
estructura de la F ₁ y tallo central 
Evidencia para la rotación 
F _o subunidades y tallo periféricas

F 1 F o ATP sintasa de las mitocondrias, los cloroplastos y bacterias se representa esquemáticamente en la derecha. Cuando el H electroquímica + gradiente es favorable, F 1 F o cataliza la síntesis de ATP acoplada a H espontánea + flujo hacia el lado de la membrana donde F 1 sobresale. Por ejemplo, en la mitocondria, el pH y los gradientes eléctricos unidad H + transporte desde el espacio intermembrana al compartimiento de matriz. La teoría quimiosmótica se discute en otro lugar.

Si no hay ningún potencial de membrana o el pH gradiente existe para conducir la reacción hacia delante, la K eq favorece la reacción inversa, la hidrólisis de ATP (actividad ATPasa). En algunas bacterias , la reacción inversa tiene un papel fisiológico, proporcionando un mecanismo para la creación de ATP-dependiente de un gradiente de protones que impulsa otras reacciones. Inhibidores de F 1 F o , ese bloque H + transporte acoplado a la síntesis de ATP o hidrólisis, incluyen: oligomicina , un antibiótico DCCD (diciclohexilcarbodiimida), un reactivo que reacciona con grupos carboxilo en entornos hidrófobos, formando un aducto covalente.

Visto por microscopía electrónica con tinción negativa, la ATP sintasa apareció como " paletas "en la membrana mitocondrial interna, frente a la matriz (. V & V Fig 22-36 p. 827). Resolución microscopía Superior crioelectrónica tarde mostró cada piruleta tener dos tallos . Por ejemplo, ver la película en una página web de J. Rubinstein. Funciones de los principales subunidades se determinaron en estudios de partículas submitocondriales ( SMP ). Si las mitocondrias se tratan con ultrasonidos, se rompe la membrana interna y se vuelve a sellar como vesículas, con F 1 en la superficie exterior. Desde F 1 de las mitocondrias intactas enfrenta al espacio de la matriz interior, éstos SMP se dice que son de adentro hacia afuera .

• F ₁ , la cabeza de la piruleta, cuando extrae de SMP, cataliza la hidrólisis de ATP (la reacción espontánea en ausencia de una entrada de energía). Por lo tanto F ₁ contiene el catalizador dominio (s).
• Después de la eliminación del F ₁ , el SMP membrana que contiene F _o es permeable a H ⁺ . Adición de nuevo F ₁ restaura la baja permeabilidad normal H ⁺ . De este modo se estableció que F _oincluye un "protón canal . "
• Cualquiera de bloques oligomicina o DCCD el H ⁺ de fugas en las membranas agotados de F ₁ . Así oligomicina y DCCD inhiben las sintasa de ATP mediante la interacción con F _o .

ATP sintasa complejos de bacterias, las mitocondrias y cloroplastos son muy similares, con diferencias menores. Las mitocondrias se cree que han evolucionado a partir de bacterias aerobias simbióticas ingeridos por una célula huésped anaeróbico. La membrana limitante de la bacteria se convirtió en la membrana mitocondrial interna. Las mitocondrias contienen una pequeña cromosoma de ADN, pero los genes que codifican proteínas mitocondriales más se encuentran en el núcleo, consistente con la transferencia de algo de ADN al núcleo durante la evolución.

La composición de la subunidad de la ATP sintasa se ​​estableció por primera vez para E. coli , que tiene un operón que codifica genes para todas las subunidades. Subunidades del tallo se clasificaron inicialmente como parte de cualquiera de F ₁ o F _o , en función de si se co-purifican con extraída F ₁ .

F 1 subunidades fueron nombrados con letras griegas en orden decreciente de peso molecular. Están presentes con estequiometría un 3 , b 3 , g , d , e . Los unos y b subunidades (513 y 460 residuos de aminoácidos en E. coli), son homólogas entre sí. Mirando hacia abajo en la membrana, una y b subunidadesalternativo en torno a un anillo . (El g subunidad se discute a continuación.) Hay tres nucleótidos vinculante sitios catalíticos , situados en ab interfases pero predominantemente involucran residuos de los b subunidades. Cada una subunidad contiene un ATP fuertemente unido, pero es inactivo en la catálisis. Mg ++ se une con los nucleótidos de adenina en ambos unos y b subunidades.

• F _o subunidades fueron nombrados en letras romanas con la disminución del peso molecular. La estequiometría de estas subunidades en el E. coli es una , b ₂ , c ₁₀ .

Mamíferos mitocondrial F ₁ F _o es ligeramente más compleja que la enzima bacteriana, con algunas subunidades adicionales. Además, dado que se asignaron nombres basado en los pesos moleculares aparentes, algunas subunidades se les dio diferentes nombres en diferentes organismos .

• El bovina d subunidad resultó ser homóloga a la E. coli e subunidad. 
• El bovina e subunidad es única .
• A bovina subunidad llamada OSCP (oligomicina proteína atribución de sensibilidad) es homóloga a la E. coli d subunidad. 
• El bovino enzima tiene adicionales subunidades d y F ₆ .

Hay evidencia de que la ATP sintasa (F ₁ F _o ) puede formar un complejo con la translocasa de nucleótidos de adenina (ADP / ATP antiporter) y el portador de fosfato (P _i / H ⁺ symporter). Este complejo ha sido designado el Synthasome ATP .

El mecanismo de cambio de la unión de acoplamiento de energía fue propuesto por Paul Boyer. Compartió el premio Nobel de este modelo, que da cuenta de la existencia de 3 sitios catalíticos en F 1 .Para simplificar, sólo los catalíticos b subunidades se muestran en el diagrama de la derecha.

Se propone que una "forma irregular eje "vinculado a F _o gira con respecto a las 3 b subunidades, que están dispuestos en un anillo. La rotación está impulsado por flujo de H ⁺ a través de F _o . La conformación de cada b subunidad cambia secuencialmente, ya que interactúa con el eje de rotación. Cada uno de los 3 b subunidades está en una etapa diferente del ciclo catalítico en cualquier momento. Por ejemplo, la subunidad verde se muestra arriba secuencialmente cambia a:

1. una floja conformación en la que el sitio activo vagamente puede unirse ADP + P _i
2. una estrecha conformación en la que los sustratos están estrechamente ligada y ATP se forma
3. una abierta conformación que favorece la liberación de ATP. 

Este modelo se apoya en dos grandes líneas de evidencia:
1. La estructura cristalina de la F ₁ con el tallo central se determinó por John Walker, quien compartió el premio Nobel por ese logro. El g (gamma) subunidad se encontró para incluir un bucle helicoidal doblada que constituye un " eje "dentro del anillo de una y b subunidades. 

Muestra a la derecha es bovina F 1 , tratado con DCCD para producir cristales en la que más del tallo central se ordena, lo que permite la determinación de estructuras. (Estructura resuelto por C. Gibbons, MG Montgomery, AGW Leslie, y JE Walker, 2000, AP 1E79 ) .Colores de subunidades: una amarilla, b verde, g rojos, d azul, y e magenta. Tenga en cuenta la amplia base de del eje rotativo, incluyendo la parte de g , así como d y e subunidades. Recordemos que la bovina d subunidad , que se encuentra en la base del eje, es equivalente a la e subunidad de F bacteriana 1 .

En los cristales de F 1 no tratados con DCCD (1COW archivo PDB) , menos de la estructura de árbol se aclara, pero la unión del ligando se puede observar en las condiciones más naturales. Los 3 b subunidades se encuentran a diferir en la conformación y el ligando unido :

• Unido a uno b subunidad es un análogo no hidrolizable de ATP (supone que la conformación apretado).
• Bound a otro b subunidad es una molécula de ADP (supone que es la conformación suelto).
• La tercera b subunidad tiene un vacío sitio activo (que se supone la conformación abierta). 

Estos hallazgos son consistentes con el mecanismo de cambio de la unión , que predice que cada una de las tres b subunidades, que se ven afectados de manera diferente por el eje de rotación de forma irregular, estará en una etapa diferente del ciclo catalítico.
Los datos adicionales son consistentes con la existencia de una conformación intermedia entre las principales transiciones discutidos anteriormente . Esta conformación intermedia puede tener nucleótidos obligado en los tres sitios. Por un modelo, teniendo en cuenta la más a la izquierda imagen en el diagrama de arriba : la síntesis de ATP (en la subunidad verde) está asociada con la transición a una conformación intermedia que permite la unión de ADP + P _i a la adyacente, sitio previamente vacía (subunidad magenta) . Un cambio conformacional más lejos entonces se produce como ATP formado en el paso anterior se libera (de la subunidad cian).
Ver también los últimos artículos , especialmente el artículo de Kagawa et al.

Explore a la derecha de la estructura de bovino F 1 con cota ADP y AMPPNP.El no hidrolizable AMPP N P se utiliza como un sustituto de ATP, lo que hidrolizar durante la cristalización.

F 1 ATPasa

2. La rotación de la g eje con respecto al anillo de una y b subunidades se demostró por H. Noji, R. Yasuda, M.Yoshida y K. Kinoshita. b subunidades de una F bacteriana 1 eran atados a una superficie de vidrio, tal como se representa a la derecha. Un filamento de actina marcado fluorescente(mostrado en amarillo) se une al extremo sobresaliente de la g subunidad. La grabación de vídeo mostró los filamentos de actina fluorescente girando como una hélice. La rotación se encontró que era ATP-dependiente .  Los estudios que utilizan técnicas variadas han demostrado la rotación inducida por ATP que se produzca en discretos 120 o pasos , con pausas intermedias.Algunas observaciones indican que cada 120 o paso consiste en 80- 90 o y 30 a 40 o subetapas , con una breve pausa intermedia. Tales pasos secundarios son consistentes con evidencia de una conformación intermedia entre las principales transiciones, discutido anteriormente . Aunque el mecanismo de cambio de la unión es ampliamente aceptada, todavía se discuten algunos detalles del ciclo de reacción.

Ver vídeos mostrando F 1 rotación, en un sitio web que incluye detalles del enfoque experimental utilizado. Entonces ver a la derecha una animación basada en la variación observada en la conformación de F 1 subunidades atribuidas a la rotación de la g eje.

de rotación en F 1

La subunidad c de F o tiene una estructura de horquilla, con 2 transmembrana a -hélices y un bucle corto de conexión. (Estructura de la derecha determina mediante RMN por ME Girvin, VK Rastogi, F. Abildgaard, JL Markley, y RH Fillingame, 1998) .    La pequeña subunidad c (79 residuos de aminoácidos en E. coli), también se conoce como proteolipídica , debido a su hidrofobicidad.  Una una hélice de la subunidad c incluye un residuo de aspartato o glutamato cuyo grupo carboxilo reacciona con DCCD (Asp61 en E. coli). Mutación estudios han demostrado que este grupo carboxilo DCCD-reactiva, que se encuentra en el centro de la bicapa, que es esencial para H + transporte a través de F o .

Vista a la derecha una resolución baja, estructura parcial de la levadura F 1 con el tallo central y anexos F o subunidades c (D. archivo, A. Leslie, y J. Walker, 1999, archivo PDB 1T01) . Mostrar como columna vertebral y el color de la cadena . Pregunta: ¿Cuántas c subunidades, están en la F o c-ring? Visualizar el aspartato residuo cerca de la mitad de un segmento transmembrana de cada subunidad c. Una estructura de resolución atómica de la ATP sintasa completa , incluyendo F 1 y F o con periférica, así como los tallos centrales, ha no ha sidoalcanzado . Sin embargo las estructuras parciales o completas de los componentes individuales de proteínas, estudios de mutaciones, y la evidencia de las interacciones entre las subunidades, se han definido las funciones de la mayoría de las subunidades.

La imagen de la derecha, que representa a los modelos de mitocondrial y bacteriana estructura subunidad ATP sintasa, fue proporcionado por el Dr. John Walker. Tenga en cuenta que algunas subunidades equivalentes de diferentes organismos se asignan diferentes nombres.   La "propuesta de rotor "se compone de los anillos 10 subunidades c , más el centro del tallo (subunidades g , d , y e en la enzima mitocondrial, o g y e en E. coli ) . El E. coli e subunidad (mitocondrial d ) ayuda a conectar g de la corona de giro de las subunidades c. En algunas bacterias una porción de la e subunidad tiene un papel adicional en la inhibición de la rotación inversa que acompaña a la hidrólisis de ATP . Un separadapéptido inhibidor en las mitocondrias impide F 1 F o de hidrolizar ATP cuando no hay electroquímica H + gradiente para conducir la síntesis de ATP, por ejemplo, en condiciones anóxicas.  La "propuesta estator "consiste en la  3 una y 3 b F 1 subunidades, la una subunidad de F o , y un tallo periférico que conecta estos. El tallo periférico consiste en 2b , y d en E. coli , o subunidades b , d , F 6 , y OSCP en las mitocondrias de las especies bovina ..

Mitocondrial ATP sintasa            E. coli ATP sintasa

• El b subunidad incluye un anclaje de membrana , una transmembrana una hélice en E. coli y dos en mamíferos F ₁ F _o , que interactúa con el intramembrane una subunidad. A polar , un dominio helicoidal de b se extiende hacia fuera de la membrana.
• OSCP , que es homóloga a la E. coli d subunidad, interactúa con el extremo que sobresale de la b subunidad y con el extremo distal de un F ₁ una subunidad. Esta vinculación, junto con las interacciones de la subunidad b con residuos en la superficie de F ₁ , se postula para detener el círculo de unos y b subunidades, manteniendo que gire junto con el tallo central.

La una subunidad de F _o (271 residuos de aminoácidos en E. coli ) se prevé, por ejemplo, a partir de los diagramas de hidropatía, para incluir varios transmembrana un hélices.
Se ha propuesto que la intramembrane una subunidad contiene dos medio-canales o alambres de protones (cada uno de una serie de grupos protonables o moléculas de agua incrustadas), que permiten el paso de los protones entre las dos superficies de la membrana y el interior de la bicapa.
Los protones pueden ser transmitidos de un medio de canal o de protones cable a la otra sólo a través de la DCCD-sensible carboxilo grupo de un c-subunidad . Recordemos que el grupo carboxilo esencial de cada c subunidad (Asp61 en E. coli) se encuentra a medio camino a través de la membrana (véase más arriba ). Un esencial arginina residuo sobre uno de los transmembrana una subunidad a -hélices ha sido identificado como el grupo que acepta un protón de Asp61 y la pasa al canal de salida.

A medida que el anillo de 10 subunidades c gira , los carboxilos-c subunidad retransmiten protones entre las 2 a la subunidad medias canales. Esto permite H + gradiente impulsado H + flujo a través de la membrana para conducir la rotación. Se ha propuesto que la rotación del anillo de subunidades C puede ser el resultado de los movimientos giratorios concertadas de la hélice C de la subunidad que incluye el Asp61 DCCD-sensible y transmembrana hélices una subunidad que tiene los residuos que transfieren H + hacia o desde Asp61, como protones se pasan desde o hacia cada medio-canal. Ver también la Fig. 22-43 p. 832. Una página web del Dr. Mark Girvin proporciona enlaces a animaciones pertinentes a este mecanismo. Una página web del Dr. Joachim Weber incluye un diagrama de la E. coli F 1 F o complejo, basado en un compuesto de resuelto de rayos X, estructuras de RMN y de modelado, con dibujos animados que representan partes del complejo cuya estructura todavía no ha sido determinada . Una página web del premio Nobel John Walker contiene las películas que representan los cambios conformacionales en F 1 durante la rotación y la catálisis.