Metabolismo de los glúcidos
La glucógeno fosforilasa (EC 2.4.1.1), es una enzima clave en la degradación del glucógeno, escinde su sustrato mediante la adición de ortofosfato (Pi) para producir glucosa-1-fosfato. La ruptura de un enlace por la adición de un fosfato se conoce como fosforolisis.
- Glucógeno(n residuos) + Pi
glucosa 1-fosfato + glucógeno(n-1 residuos).- .......................:
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Gracias a los estudios del grupo de L.N.Johnson, de la universidad de Oxford, tenemos una visión bastante clara de las relaciones estructura-función en la glucógeno fosforilasa. Podemos encontrar unos buenos resúmenes de todos estos trabajos en Sprang, S.R et al.. Nature, 336 (1988), 215-221 y en Barford,D. y Johnson, L.N. Nature, 340 (1989), 609-616. Estos estudios se refieren a la glucógeno fosforilasa muscular del conejo.
La glucógeno fosforilasa es una enzima de estructura bastante compleja. Normalmente se presenta como un homotetrámero, pero la forma funcional se cree que es el homodímero, esto es, formada por dos subunidades iguales, cada una de 842 aminoácidos y un peso molecular de aprox. 96.000. Puede presentarse en dos formas, fosforilasa a, que aparece fosforilada en el residuo Ser 14, y fosforilasa b, que no está fosforilada. La fosforilasa a es mucho más activa y la fosforilación depende de una serie de señales químicas que recibe la célula, constituyendo un ejemplo clásico de regulación por modificación covalente.
Pero al mismo tiempo, la glucógeno fosforilasa es también una enzima alostérica. Cuando está en forma b (desfosforilada) la enzima presenta cooperatividad positiva en la fijación de los substratos, fosfato inorgánico y glucógeno (efectos homotrópicos). Pero además la enzima puede ser activada por AMP (débilmente por IMP) e inhibida por ATP, ADP, glucosa-6-fosfato y glucosa (efectos heterotrópicos). El sistema se aproxima bastante, aunque con ciertos matices, al modelo de Monod-Wyman-Changeux. Ha podido ser cristalizada tanto en forma R como en forma T por el equipo de L.N.Johnson citado arriba.
Vamos a estudiar las principales diferencias entre las formas R y T. Para ello cargamos en la pantalla izquierda la fosforilasa b, dímero, estado T, y en la pantalla derecha la fosforilasa b, dímero, estado R. Estamos viendo el dímero a lo largo del eje diádico de simetría. A efectos de recordar la situación, la forma R se carga en la pantalla derecha (inglés Right).
Seleccionamos residuos 14 y 43 en la forma T: y los mismos en la forma R: . Estos residuos son importantes: la Ser 14 es que se queda fosforilada en la fosforilasa a, creando carga electronegativa adicional que va a ser estabilizada por la presencia del residuo Arg 43 del otro monómero. En el estado T podemos observar, haciendo zoom sobre la molécula, que ambos residuos quedan muy separados, mientras que en la forma R son contiguos. Esto implica un reagrupamiento molecular bastante intenso en la transición de una a otra forma.
Una zona cercana a los residuos mencionados en el párrafo anterior y en la que son bastante apreciables los cambios es en las hélices a-7 (tower helix) y a-8. Vemos acontinuación dicha zona en el estado T: y en el estado R: A efectos de comparación con la imagen anterior, se mantienen en forma spacefill los residuos Ser 14 y Arg 43. Puede observarse como las cadenas laterales de los aminoácidos Tyr 262, Val 266, Leu 267, Asn 270, Asn 274, integrantes de la hélice a-7 interaccionan en el estado T: mientras que lo hacen de una forma mucho menos intensa en el estado R: Para mayor claridad, los residuos Ser 14 y Arg 43 pasan a color chain.
Otro lugar donde se aprecian cambios entre el estado T y el estado R son las proximidades del N-término de ambas cadenas, en las cercanías del centro alostérico: en el estado T: y en el estado R: . Puede apreciarse que el sitio alostérico está más "cerrado" en el estado R, debido a la unión del efector alostérico AMP: que se representa en colores verde y rojo.
La glucógeno fosforilasa es un magnífico ejemplo de la separación de sitios entre los substratos y los efectores alostéricos. Para ilustrar este concepto, cargamos en la pantalla izquierda la fosforilasa b, monómero, estado T, y en la pantalla derecha la fosforilasa b, monómero, estado R. A efectos de recordar la situación, como en el caso anterior, la forma R se carga en la pantalla derecha (inglés Right).
La enzima utiliza piridoxal fosfato como cofactor. Por lo tanto, éste se encontrará en las proximidades del centro catalítico. Así,
(a). Sitio del piridoxal fosfato: En la forma T: y en la forma R: . Según puede apreciarse, el centro catalítico de la enzima se encuentra en el interior del monómero. Los substratos de la enzima son glucógeno y fosfato; o bien, en la reacción inversa (la reacción es fácilmente reversible), glucosa-1-fosfato y glucógeno.
(b). Sitio del substrato: En la forma T: y en la forma R: . En la forma T, el centro catalítico está ocupado por un análogo de glucosa-1-fosfato (glucosa-1-metilen fosfato); en la forma R es un ion sulfato (SO42-) que actúa como análogo del fosfato. El ion sulfato procede del medio de cristalización, pero se comporta a efectos de fijación al centro catalítico como si fuera fosfato.
(c). Sitio alostérico principal: Para distinguirlo del sitio del substrato, haremos que los ligandos de este último pasen a color rojo y se muestran a continuación los ligandos del sitio alostérico: En la forma T: y en la forma R: En la forma R tenemos fijado el nucleótido AMP al sitio alostérico; en la forma T se trata de una segunda molécula de glucosa-1-metilen fosfato que ocupa el mismo lugar, pero que no puede provocar la transición de T a R.
(d). Residuos del sitio catalítico: Pasamos los ligandos del sitio alostérico a color verde y mostramos los aminoácidos implicados en el sitio catalítico: En la forma T, y en la forma R,
(e). Residuos del sitio alostérico: Pasamos a blanco los residuos del centro catalítico y representamos en color cpk normal los residuos del centro alostérico: En la forma T, y en la forma R: . Téngase en cuenta que los residuos implicados en el centro alostérico proceden de los dos monómeros y que el residuo de Ser 14 aparece alejado de este último en la forma T. Nótese además que el centro alostérico está situado en la superficie del monómero, a diferencia del centro catalítico, que está sepultado en el interior del mismo.
(f). Sitio del glucógeno:
En la forma T hay un otro ligando en la molécula, maltohexaosa, que ocupa el lugar de parte de la cadena de glucógeno cuya extensión será atacada en el sitio catalítico por el fosfato; para distinguirlo pasamos a color blanco los residuos del centro alostérico y la maltohexaosa se representa en color cpk:
La glucógeno fosforilasa puede ser fosforilada en el residuo de Ser 14 s expensas de ATP mediante otra enzima, la fosforilasa kinasa. La forma fosforilada recibe el nombre de fosforilasa a, y tiene un alto nivel de actividad. Una de las consecuencias de la fosforilación es que la enzima pasa a estar, prácticamente en su totalidad, en estado R. Como esta modificación es covalente, la enzima queda, por así decirlo, bloqueada en estado R; para volver al T requiere ser desfosforilada, lo que a su vez necesita otra enzima, una protein fosfatasa. Para verlo, compararemos la estructura de la fosforilasa a con la forma R de la fosforilasa b
Cargamos en la pantalla derecha la fosforilasa a, dímero, estado R, y en la pantalla izquierda la fosforilasa b, dímero, estado R. Recordemos que la pantalla derecha contiene a la fosforilasa a y la izquierda a la fosforilasa b. Podemos apreciar que las dos formas en pantalla son virtualmente idénticas.
Veamos el sitio alostérico de la fosforilasa a: y el de la fosforilasa b:
La serina fosforilada ocupa este sitio en la fosforilasa a: . No está fosforilada en la fosforilasa b:
La carga electronegativa del fosfato interacciona con dos cadenas laterales electropositivas; una, la de Arg 43 (que pertenece al otro dímero, ya que este sitio está en la zona de contacto) y la de Arg 69, que pertenece al mismo dímero. Para visualizarlos, en la fosforilasa a: y en la fosforilasa b:
En la fosforilasa b, por tanto, no hay fosfato en esta posición. Sin embargo está en forma R, que es activa gracias a la fijación del activador alostérico AMP al sitio que estamos estudiando:. Puede observarse que el AMP no ocupa exactamente el mismo sitio que el fosfato en la fosforilasa a, pero su efecto viene a ser el mismo. La fosforilación de serina 14 y la ocupación por AMP del sitio alostérico producen los cambios conformacionales que hemos visto más arriba, adquiriendo la enzima su configuración activa. Ahora bien, la fijación de AMP es más débil que la unión covalente de fosfato a serina; por tanto, es más fácil la inactivación de la fosforilasa b (por disociación de AMP) que la de fosforilasa a (que requeriría una protein fosfatasa).
Para comparar la fosforilasa a con el estado T de la enzima, cerramos la pantalla de la izquierda (fosforilasa b activa) y abrimos en la misma la estructura equivalente en estado T:fosforilasa b, dímero, estado T y obtenemos la visión equivalente del sitio alostérico: . Con ello podemos comparar las muy notables diferencias en el sitio alostérico en las formas R (la que presenta la fosforilasa a, pantalla derecha) y la forma T. En concreto, obsérvese la situación de la serina 14 en ambas ventanas: En la forma R, y en la forma T:
La glucógeno fosforilasa es el término de una cascada de activaciones que tiene su origen en una señal química extracelular (p.e., catecolaminas o glucagon) que en el interior de la célula sigue una trayectoria compleja: Activación de proteínas G - Activación de adenilato ciclasa - Protein kinasa A (activada por cAMP) - Activación de fosforilasa kinasa - Activación de fosforilasa por fosforilación. Los mecanismos moleculares de los distintos pasos de esta cascada no se conocen con un detalle comparable a la activación de la fosforilasa que acabamos de ver. No obstante, algo se conoce sobre la estructura molecular de las enzimas o sistemas mencionados, que pasamos a ver a continuación.
La fosforilasa kinasa cataliza la activación de la fosforilasa a expensas de ATP que fosforila al residuo Ser 14 según hemos visto antes. La fosforilasa kinasa es una enzima muy compleja, y su estructura cuaternaria es (abgd)4, es decir, un hexadecámero. Las subunidades a y b son de naturaleza regulatoria; la subunidad g es catalítica y la subunidad d es la calmodulina (lo cual da al sistema la posibilidad de ser activado asimismo por Ca++. Disponemos de la estructura molecular parcial de la subunidad g. Se trata del dominio catalítico propiamente dicho, y comprende los residuos 14-289 de la subunidad g. La subunidad completa consta de 386 residuos. Los que ocupan las posiciones 302-326 y 342-366 son dominios de fijación de calmodulina (que es la subunidad subunidad d de la fosforilasa kinasa). La estructura del dominio representado muestra, a su vez, un subdominio N-terminal a/b: y otro C-terminal de tipo todo- a:
Se representa asimismo en esta estructura un substrato peptídico de la fosforilasa kinasa, el péptido RQMSFRL: cuya Ser 4 puede ser fosforilada por la enzima:
La proteína ha sido cristalizada en presencia del otro substrato ATP, , cuyo fosfato g está adyacente al -OH de la serina del substrato; y presenta asimismo un ion Mn++, que forma parte d el complejo ATP-Mn++ que es el verdadero substrato de la enzima.
La calmodulina es una proteína pequeña, de secuencia muy conservada (es prácticamente idéntica en todos los vertebrados) que media las acciones del ion Ca++. Como hemos visto arriba, la subunidad d de la fosforilasa kinasa es la calmodulina. Cuando esta proteína fija Ca++, tiene lugar un cambio conformacional que se transmite a las proteínas con las cuales interacciona la calmodulina. Cada molécula es capaz de fijar cuatro iones Ca++, cada uno de loscuales se fija a un motivo estructural propio de todas las proteínas que fijan este ion, la llamada mano EF.
Vemos en pantalla las estructuras de Complejo Ca++-Calmodulina, a la izquierda, y Calmodulina libre de calcio, a la derecha. La comparación entre ambas nos muestra la magnitud del cambio conformacional inducida por el Ca++.
Hay cuatro iones de Ca++ fijados por molécula: . La unión tiene lugar al motivo en mano EF, . La mano EF consta de dos tramos en a-hélice separados por una zona sin estructura secundaria, en la que hay presentes varios aminoácidos dicarboxílicos:
Podemos comparar con los correspondientes residuos en la calmodulina libre de calcio:
Se trata asimismo de una enzima compleja en su estructura. Consta de dos subunidades regulatorias, cada una de las cuales fija dos moles de cAMP, y dos subunidades catalíticas, formando un complejo R4C2. La holoenzima así constituída es inactiva; pero cuando las subunidades regulatorias fijan cAMP, se disocia y las subunidades catalíticas, por separado, son capaces de fosforilar un gran número de proteínas, entre las cuales está la fosforilasa kinasa. No se ha obtenido todavía la estructura completa de la holoenzima, por lo cual veremos cada una de las subunidades por separado.
Vamos a ver las estructuras de la subunidad catalítica, monómero, a la izquierda, y de la subunidad regulatoria, monómero, a la derecha.
En la subunidad catalítica podemos ver la cadena principal (en azul) y un fragmento (res. 5-24) de un péptido inhibitorio natural, PKI, que aparece en rojo. En cuanto a los ligandos, hay un análogo de ATP (adenilil imidofosfato, AMP-PNP) fijado en el sitio del substrato: ; hay asimismo dos iones Mn++: . El péptido inhibitorio cierra el sitio activo de la enzima:
En la subunidad regulatoria aparecen fijadas dos moléculas de cAMP:
La adenilato ciclasa es asimismo una enzima compleja, integrada en la membrana celular. Su acción catalítica consiste en producir cAMP y PPi a partir de ATP. Se activa gracias a su interacción con una proteína Ga con GTP ligado; la activación de la adenilato ciclasa dura lo que tarda el GTP en hidrolizarse a GDP. Disponemos de un complejo cristalizado constituído por dos dominios de la adenilato ciclasa (C1A y C2A) y la subunidad Ga de una proteína G. En la pantalla izquierda tenemos el complejo adenilato ciclasa++, en el cual podemos distinguir el dominio C1A: , el dominio C2A: , y la subunidad Ga: .
El complejo ha sido cristalizado en presencia de los siguiente ligandos: (a) 3'-desoxiadenosina monofosfato, ocupando el sitio del AMP producto: ; (b) pirofosfato, producto de la reacción:; (c) forskolin, un potente activador de la adenilato ciclasa: ; y (d) la subunidad Ga está ligada a un análogo de GTP, en el que el fosfato g aparece sustituído por un átomo de azufre: . Hay asimismo (e) dos iones Mg++: , uno de ellos formando complejo con 3'-dAMP y otro con el análogo de GTP en la subunidad Ga.
Son proteínas heterotriméricas que participan ampliamente en procesos de transducción de señales. La fijación de un ligando al receptor de membrana induce el intercambio de GDP por GTP en la subunidad a, que entonces se disocia del complejo y puede activar, por ejemplo, a la adenilato ciclasa, tal como vimos arriba. Esta activación dura el tiempo que el GTP permanezca como tal ligado a Ga. Al tener ésta actividad GTPasa, el GTP termina por hidrolizarse a GDP, momento en el que se separa de la adenilato ciclasa y vuelve a reasociarse con las subunidades b y g. Presentamos aquí la estructura del trímero abg de proteína G .
Las subunidades son las siguientes; Ga: ; Gb y G g: . Todas ellas son en realidad fragmentos de la proteína original.
El complejo ha sido cristalizado con el ligando fisiológico de reposo, GDP: .
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