Biotecnología

BAC, o cromosoma artificial bacteriano, es un Vector de clonación usado para clonar fragmentos de ADN (de 100 a 300 kb de tamaño; media de 150 kb) en Escherichia coli, basado en el plásmido factor-F encontrado de modo natural en la bacteria E. coli.

Es uno de los tipos de vectores de clonación conocidos como "vectores de alta capacidad", que incluye cósmidos, BACs, PACs y YACs (cromosoma artificial de levadura), por contraposición con plásmidos, vectores derivadores de fago lambda, fagémidos y fásmidos, que son de baja capacidad.

Los BACs son muy utilizados como vectores de clonación para la construcción de genotecas genómicas, como en el Proyecto Genoma Humano. Su gran utilización se debe a su notable capacidad, su gran estabilidad y su bajo porcentaje de quimerismo.

Dado el gran tamaño de los BAC recombinantes las estrategias de introducción más eficientes han sido mediante electroporación.

Un BAC típico consta de:

• OriS: origen de replicación del factor F
• repE: control de la replicación del plásmido
• parA, B, C: control de la replicación
• CMr: cloranfenicol acetil-transferasa (CAT) (gen de resistencia a cloranfenicol)
• LacZ’: con un polilinker en su interior. Se usa para el ensayo de alfa-complementación.

Un cromosoma artificial bacteriano es una construcción de ADN, sobre la base de una fertilidad funcional plásmido, que se utiliza para la transformación y la clonación en bacterias, por lo general de E. coli. F-plásmidos desempeñan un papel crucial, ya que contienen los genes de partición que promueven la distribución uniforme de plásmidos después de la división celular bacteriana. Habitual insertar tamaño del cromosoma artificial bacteriano es 150-350 kpb. Un vector de clonación similar llamado un PAC también se ha producido a partir de la bacteriana P1-plásmido.

BAC se utilizan a menudo para secuenciar el genoma de los organismos de proyectos del genoma, por ejemplo, el Proyecto Genoma Humano. Un pequeño fragmento de ADN del organismo se amplifica como un inserto en el BAC, y luego secuenciados. Por último, las partes secuenciados se reordenan in silico, lo que resulta en la secuencia genómica del organismo.

Componentes genéticos comunes

 oriS, repE - F para la replicación del plásmido y la regulación del número de copias. Para y parB para la partición de ADN de plásmido F a las células hijas durante la división y asegura el mantenimiento estable de la CAV. Un marcador seleccionable para la resistencia a los antibióticos; algunos BAC también tiene lacZ en el sitio de clonación para la selección azul/blanco. T7 y SP6 de fagos para la transcripción de los genes insertados.

Contribución a los modelos de la enfermedad

Enfermedades hereditarias

BAC ahora se están utilizando en mayor medida en el modelado de enfermedades genéticas, a menudo junto con ratones transgénicos. BAC han sido útiles en este campo como genes del complejo pueden tener varias secuencias reguladoras aguas arriba de la secuencia de codificación, incluyendo diversas secuencias promotoras que regirán el nivel de expresión de un gen. BAC se han utilizado para un cierto grado de éxito con los ratones en el estudio de enfermedades neurológicas tales como la enfermedad de Alzheimer o como en el caso de aneuploidía asociada con síndrome de Down. También ha habido casos en los que se han utilizado para estudiar los oncogenes específicos asociados con cánceres. Ellos se transfieren a través de estos modelos de enfermedades genéticas por electroporación/transformación, transfección con un virus o microinyección adecuado. BAC también se pueden utilizar para detectar genes o grandes secuencias de interés y, a continuación utilizan para mapear ellos en el cromosoma humano utilizando matrices de BAC. Se prefieren los BAC para este tipo de estudios genéticos debido a que acomodan secuencias mucho más grandes sin el riesgo de reordenación, y son por lo tanto más estable que otros tipos de vectores de clonación.

Enfermedades infecciosas

Los genomas de varios virus grandes de ADN y virus de ARN se han clonado como BACs. Estas construcciones se conocen como "clones infecciosos", como la transfección del constructo de BAC en las células huésped es suficiente para iniciar la infección viral. La propiedad infecciosa de estos BAC se ha hecho el estudio de muchos virus, tales como los herpesvirus, poxvirus y coronavirus más accesibles. Los estudios moleculares de estos virus ahora se puede lograr utilizando enfoques genéticos para mutar el BAC mientras reside en bacterias. Tales enfoques genéticos se basan en cualquiera de vectores de abordaje lineales o circulares para llevar a cabo la recombinación homóloga.

El cromosoma artificial de levaduras o YAC (Yeast artificial chromosome) forma parte de los vectores de clonación de alta capacidad siendo, de hecho, el de mayor capacidad (200 kb - 3.000 kb). Fueron descritos por primera vez en 1983 por Murray y Szostack.

Es un vector que pretende imitar las características de un cromosoma normal de una levadura (eucariota), portando un centrómero y telómeros terminales. Esto permite clonar en levaduras (microorganismos eucariotas) secuencias de ADN de hasta un millón de pares de bases o más, al comportarse como un cromosoma propio de la levadura.

Son utilizados en construcción de genotecas genómicas, siendo muy extendido su uso en los primeros años del Proyecto Genoma Humano. Sin embargo, son más inestables que otros vectores como BACs (cromosoma artificial bacteriano), que han acabado imponiéndose.

Los YAC tienen un origen de replicación relajado en procariotas, por lo que aparecen muchas copias en cada bacteria (gran utilidad para producir masivamente el vector), pero un origen de replicación estricto en levaduras, apareciendo sólo una copia por célula de levadura.

Un YAC típico tiene:

• ARS1: secuencia de replicación autónoma
• CEN4: centrómero del cromosoma IV, permite la segregación del plásmido durante la división celular
• TELs: secuencias teloméricas.
• HIS3, TRP1, URA3: marcadores de selección en levadura confieren prototrofía para histidina, triptófano y uracilo
• SUP4: cambia la mutación sin sentido ámbar (UAG) por la incorporación de tirosina. Identifica las células que incorporan el vector, ya que las células huésped que portan esta mutación ámbar, de color rosado, pasan a tener un fenotipo blanco. (Prototrofo para ade).

El primer cromosoma artificial

Un equipo internacional ha sintetizado un cromosoma funcional de la levadura.

Science

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Cromosoma sintético, representado como una cinta larga. Las posiciones de los cambios introducidos por los científicos (en relación con el cromosoma natural) se indican con alfileres y puntos blancos, y las secuencias eliminadas, con bandas ocres. [Ilustración de Lucy Reading- Ikkanda]

¿Cuál es el genoma mínimo necesario para que un organismo sea viable? ¿Qué genes o combinaciones de genes pueden eliminarse sin que ello resulte letal? Responder a estas preguntas ofrecería la posibilidad de diseñar y construir a la medida todo tipo de fábricas biológicas: microorganismos (bacterias, levaduras) optimizados para realizar funciones como la producción de una molécula de interés terapéutico a bajo coste (cuanto más corto es el genoma, menor coste energético conlleva su replicación), nuevas moléculas de interés biológico o químico, o biocombustibles. Un equipo internacional liderado por Srinivasan Chandrasegaran, Joel Bader y Jef Boeke, de la Universidad Johns Hopkins en Baltimore, ha dado un paso importante en la búsqueda del genoma mínimo.

Los biólogos han sintetizado un cromosoma reducido (le suprimieron sus regiones silenciosas y no codificantes) de la levadura Saccharomyces cerevisiae y han demostrado que, una vez introducido en la levadura, este resulta funcional: cualesquiera que sean las condiciones de cultivo, la levadura equipada con el cromosoma sintético funciona de igual modo que las levaduras naturales. Pero sobre todo, han introducido en el cromosoma sintético secuencias genéticas adicionales que les permiten manipular cada gen no esencial del cromosoma de forma independiente.

De los aproximadamente 6.000 genes que componen el genoma de la levadura, unos 5.000 no son esenciales: su eliminación individual no es letal para el organismo. Sin embargo, la supresión simultánea de muchos de estos genes puede resultar fatal, aunque se desconoce cuántos y cuáles de ellos. Esto es lo que debe determinar de forma sistemática el nuevo dispositivo, ya que proporciona los medios para observar el efecto directo de la extinción de uno o más genes no esenciales sobre la viabilidad del organismo y su multiplicación.

Cada gen no esencial fue flanqueado por una secuencia que hacía desencadenar su rápida evolución o bien provocaba su eliminación. Una vez se ha acelerado la evolución de un gen, el enfoque permite seleccionar las variantes génicas más adaptadas para un propósito determinado. Los biólogos han observado así que ciertas combinaciones de variantes retardan el crecimiento de las levaduras, mientras que otras lo aceleran de forma extraordinaria.

No es la primera vez que se sintetiza un genoma para introducirlo después en un microorganismo. En 2010, el equipo del Instituto J. Craig Venter, de Estados Unidos, reconstruyó el genoma completo de una bacteria, Mycoplasma mycoides, y transfirió esta copia sintética a otra especie bacteriana, Mycoplasma capricolum. Como consecuencia, las bacterias de esta especie se transformaron en Mycoplasma mycoides. El estudio demostró que, en los organismos procariotas (cuya información genética no se halla encerrada en un núcleo) existe la posibilidad de hacerse con el control de una célula mediante el empleo de un genoma sintético.

S. Chandrasegaran y sus colaboradores han ido más allá. En primer lugar, han demostrado que la estrategia puede aplicarse también en organismos eucariotas (con núcleo). Por otro lado, han ofrecido un enfoque sistemático para optimizar el genoma introducido. El trabajo representa un paso importante hacia el desarrollo de un genoma con una estabilidad controlada y constituye una proeza técnica en la síntesis y ensamblaje de una cadena larga de ADN.

Su estudio representa la primera fase de un programa más amplio, el proyecto Sc2.0, puesto en marcha por J. Bader y J. Boeke, cuyo objetivo es construir un genoma sintético entero de la levadura.