El cultivo celular es el proceso mediante el que células, ya sean células procariotas o eucariotas, pueden cultivarse en condiciones controladas. En la práctica el término "cultivo celular" se usa normalmente en referencia al cultivo de células aisladas de eucariotas pluricelulares, especialmente células animales. El desarrollo histórico y metodológico del cultivo celular está íntimamente ligado a los péptidos cultivares delcultivo de tejidos y el cultivo de órganos.- ...............................................................:http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Especial:Libro&bookcmd=download&collection_id=bdc0e02b417f21ab004e7ae31d0bfe4167df92b4&writer=rdf2latex&return_to=Cultivo+celular
Los cultivos de células in vitro consisten en un sistema formado por células provenientes de un órgano o un tejido, normal o tumoral, mantenidas en medios de cultivo de composición química definida y en condiciones de temperatura, pH, aireación y humedad controladas. De esta forma se aseguran su supervivencia y multiplicación, manteniendo todas sus funciones metabólicas de una manera semejante a las que tenían en el huésped.
El cultivo celular tuvo su origen en el siglo XIX, como un método para el estudio del comportamiento de las células animales libres de las variaciones sistémicas ocurridas dentro del organismo y bajo el estrés de un experimento. En la actualidad, pueden cultivarse en el laboratorio células procedentes de una amplia gama de tejidos y organismos diferentes.
Cuando el cultivo proviene de células que han sido disgregadas de un tejido original recién extraído, recibe el nombre de Cultivo Primario. Cuando este cultivo primario es sometido a procesos de transformación que le confieren capacidad ilimitada de multiplicación, recibe el nombre de Línea Celular.
Los cultivos de células animales también se pueden clasificar de acuerdo a su capacidad de adherencia o no a una superficie determinada, pudiendo crecer en forma de monocapa o en suspensión.
Así por ejemplo, las técnicas de cultivo celular permiten el estudio de las propias células, su metabolismo, el control del ciclo celular, la modulación de la expresión génica, el cultivo de virus, la clonación y el estudio de numerosos aspectos relacionados con el cáncer y su diagnóstico, por citar sólo algunos ejemplos.
Otra área de gran interés se centra en la biología del desarrollo, mediante la búsqueda de modelos experimentales que permitan explicar cómo el gran número de células presentes en organismo maduro derivan de una sola célula a partir de la fertilización. Por ello las líneas celulares que conservan la capacidad de diferenciarse in vitro son objeto de un intenso estudio.
Hay cierto tipo de investigaciones que no pueden realizarse sin el cultivo de células, por ejemplo, el trabajo con animales transgénicos, que conduce a que organismos maduros expresen genes nuevos, se basa totalmente en las técnicas de cultivo celular para la inserción de genes extraños en las células receptoras.
Aplicaciones
Este servicio pone a disposición de la comunidad universitaria, así como a otras instituciones públicas y privadas, la posibilidad de cultivar todo tipo de células animales, tanto cultivos primarios como líneas celulares establecidas y realizar diferentes técnicas que permitan su estudio y caracterización a nivel molecular y celular.Los objetivos de esta unidad son:
- • Facilitar a los usuarios el uso y aprovechamiento de las instalaciones de que dispone, poniendo a punto y manteniendo los aparatos y técnicas en cultivos para el máximo aprovechamiento de los usuarios.
• Velar por el cumplimiento de las normas de trabajo de la Unidad de Cultivos para evitar en todo momento la contaminación de los cultivos derivada del uso colectivo de las instalaciones.
Además, se ofertan una serie de servicios opcionales, entre los que se incluyen:
- • Preparación de medios de cultivo, tampones, etc. bajo condiciones de esterilidad.
• Entrenamiento en técnicas básicas de cultivos celulares.
• Adquisición y puesta en marcha de una línea celular catalogada.
• Mantenimiento de stocks frescos de líneas celulares en nitrógeno líquido.
• Aislamiento de cultivos primarios de células endoteliales.
• Mantenimiento de líneas celulares.
• Mantenimiento de líneas no inmortalizadas con bajo número de pases.
• Estudios de citotoxicidad.
• Ensayo de morfogénesis de células endoteliales sobre matrigel.
• Ensayo de Wound-Healing.
• Obtención de medios acondicionados por las células.
• Valoración de actividades proteolíticas por zimografía
• Ensayos específicos de actividades enzimáticas concretas.
• Servicio fotográfico.
• Ensayos de detección de micoplasmas.
Equipamiento
El equipameinto del laboratorio comprende:
- • Agitador giratorio NEW BRUNSWICK SCIENTIFIC, TC-8 LINE.
• Agitador magnético SELECTA, ASINCRO.
• Agitador magnético STUART SCIENTIFIC, SM11.
• Agitador vortex HEIDOLDH, Reax 2000.
• Autoclave MATACHANA, 211 LE 1M.
• Balanza de precisión SARTORIUS, BP110S.
• Balanza de precisión SARTORIUS, BP410.
• Baño de incubación con termostato HAAKE W19
• Bidestilador MILLI-Q185 PLUS
• Bomba de aspiración DINKO, D-95.
• Cabinas de flujo laminar vertical HOLTEN, HB 2448.
• Cámara fotográfica NIKON, F-601M.
• Centrífuga HERAEUS, BIOFUGE 13
• Congelador LIEBHERR –20ºC.
• Equipo de contaje y distribución celular Beckman Coulter Z2
• Contenedor de nitrógeno líquido AIR LIQUID, GT 140.
• Descalcificador ASTRA, CV-30.
• Esterilizador ultravioleta SELECTA.
• Fluorímetro para placas BIO-TEK, FL600.
• Frigorífico LIEBHERR, RS3610 GSD300.
• Horno de secado HERAEUS INSTRUMENTS, T6200.
• Incubadores de CO2 HERAEUS, 51 008 331.
• Lámpara articulada LEICA, CLS 100.
• Lavador de microplacas DASLAB, DG-34.
• Lavadora de laboratorio MIELE, MIELABOR G.
• Lector de microplacas WITTAKER, Microplate reader 2001.
• Lupa LEICA, MZ6.
• Máquina de hacer hielo SCOTSMAN AF-20-AS, AF20 ASB 0600.
• Osmómetro crioscópico GONOTEC, Osmomat 030.
• pH-metro CRISON, MICROPH 2000.
• Ultracongelador –80ºC REVCO, ULT 1786-3-V12.
El cultivo de células de insecto consiste en la manutención de líneas celulares de insecto en condiciones controladas de laboratorio. Se trata de un cultivo celular especial, cuya principal aplicación consiste en el cultivo de baculovirus de cara a la expresión y purificación deproteína recombinante.
Los artrópodos se han convertido en el centro de atracción de los científicos debido a su importancia en medicina y agricultura. Han desempeñado un papel fundamental como huésped intermediarios, vectores de agentes patógenos que causan enfermedades al ser humano y los animales. Las infecciones por arbovirus ha generado el interés en el desarrollo de cultivos de células de los insectos de importancia médica con el fin de estudiar la relación virus-vector a nivel celular (Sudeep et al., 2005). En la agricultura, los daños causados por plagas y el fracaso de los insecticidas para su control ha estimulado a desarrollar a gran escala, cultivos de células de insectos y nuevas herramientas para su control. El estudio de las células de insectos ha generado grandes cambios a nivel científico lo que ha conllevado a una expansión muy rápida en muchas áreas de la biología, incluyendo la inmunología, endocrinología, toxicología, bioquímica, virología y la evolución. Específicamente, esta revisión busca hacer una búsqueda literaria sobre la utilización de los cultivos de células de insecto y su proyección en las distintas áreas.
Historia del cultivo de células de insectos
El cultivo de células de insectos comenzó hace 30 años a partir de la disociación física de los ovarios inmaduros de Antherea eucalypti, una polilla hembra (Grace, 1962). Este avance fue el resultado de un arduo trabajo, experimentación y fases de desarrollo lo que logró establecer la creación de una línea de células de insectos. En China, años antes de Grace (Gaw 1958; Vlak 2007) Goao y sus colegas utilizaron una variedad detejidos de mariposa de seda, lo cual mostró un crecimiento exitoso de virus en este cultivo (Vag 1958; Vlak 2007). Goao y Grace establecieron numerosas líneas de células de insectos como lepidópteros, dípteros, ortópteros y coleópteros (Li y 2007 Bonning, Lynn 2007; Vlak 2007). La principal motivación de esa época, para el establecimiento de líneas de células de insectos fue el estudio de la fisiología de insectos y la producciónin vitro de los Baculovirus para el control biológico de plagas de insectos. Pero, en 1980 el cultivo de células se trasladó a la corriente principal de la biotecnología, donde fue posible modificar genéticamente los Baculovirus. Desde este periodo han aparecido numerosas investigaciones de líneas celulares de insectos para la producción a gran escala y con técnicas que permiten su replicación en medios de cultivos de suspensión que originalmente eran de anclaje dependiente. Actualmente la transfeccion de células de insecto con Baculovirus (IC-BEVS) se ha convertido en una plataforma tecnológica importante para la fabricación de partículas virales, proteínas recombinantes que van desde los pesticidas biológicos hasta las vacunas humanas, además son utilizadas para la terapia génica. IC-BEVS es un sistema versátil ya que puede expresar productosde los genes de casi cualquier organismo, desde bacterias hasta los humanos y en cualquier localización celular.
Células de insectos vs Células de mamíferos
Para la elaboración de nuevos medios de cultivo y el diseño es necesario tener conocimiento del metabolismo de las células de insectos (CI) , pero se presenta una escases de información sobre el metabolismo de CI y solo existen aproximaciones cuantitativas (Bernal et al, 2009; Carinhas et al, 2010;. 2011). El metabolismo de las CI tiene diferencias marcables en relación con el cultivo de células de mamíferos (Neermann y Wagner, 1996). Ambas líneas celulares son capaces de crecer en medios de cultivo que solo contienen glucosa como carbohidrato (Landureau, 1969; Reuveny et al., 1992), pero las CI presenta una mayor tasa de consumo en comparación con las células de mamíferos. Sin embargo, líneas celulares de insectos son capaces de utilizar otro tipo de carbohidrato como la fructuosa o la maltosa (Bédard et al., 1993; Reuveny et al., 1992) lo que genera un mayor espectro en las fuente de energía y de las técnicas utilizadas. Pero en las CI existen desventajas tales como la incapacidad de generar un patrón correcto de glicolisacion muy parecido al de las células de los mamíferos.
Aplicaciones de las células de insectos
Las células de insectos (IC) son una alternativa para la bioproducción pues constituye una proyección para la creación de proteínas, vacunas y vectores para la terapia génica, esta versatilidad se genera por que pueden ser cultivadas muy fáciles en los medios de suero y libre de proteínas. Además, los baculovirus han sido utilizados para la producción de una amplia variedad de recombinación biológica de proteínas para su uso como bioinsectisidas, vacunas y proteínas terapéuticas (Chen 200 y harper 2006). La producción de proteínas recombinantes se genera mediante un sistema de células de insectos infectada por Baculovirus. Estas líneas celulares transformadas han surgido como estrategia para la producción continua de proteínas recombinantes. Se utiliza un gen que identifica una pequeña fracción de las células transformadas de forma estable, y los genes de resistencia a antibióticos se utilizan como marcadores seleccionables y se contrasfectan con el heterologo de interés. Esto es útil ya que las células de insectos no se ven comprometidas por las infecciones de los virus. El sistema de células de insecto de Baculovirus es una tecnología bien establecida en producción de proteínas heterologas, aplicables en la investigación científica para el desarrollo de vacunas y diagnósticos. Según Stefan 2011, los arbovirus formar un importante grupo de patógenos virales significativos en la medicina que se transmiten a los seres humanos y animales a través de vectores artrópodos, sobre todo mosquitos, garrapatas, y pocas vacunas por arbovirus son actualmente disponibles, lo que produce una urgente necesidad de vacunas que sean eficaces contra arbovirus altamente patógenos como el dengue, la fiebre del valle, el virus de la fiebre catarral ovina etc.
La transferencia de genes ha surgido recientemente como una nueva y poderosa estrategia terapéutica (Liu., et al 2011) con adenovirus asociados (AVV), este patógeno en el ser humano se puede utilizar para proporcionar a largo plazo genes de expresión. La producción recombinante de adenovirus asociados (rAVV), se puede lograr mediante la cotransfeccion con 3 plasmidos que contienen el gen terapéutico flaqueado (Rep78, Rep68, Rep52, Rep40) de estructura VP1, VP2, VP3 por terminaciones invertidas (RTI, 145 Pb) ubicados en cada extremo del genoma, que son necesarios para la replicación y encapsidadcion del genoma viral. La producción a gran escala de rAVV es un reto en la aplicación de terapia clínica, pues presenta desventajas en cuenta a la trasfeccion y difusión, y no son fáciles de escalar a altas densidades en cultivo de células en suspensión. Existe un método novedoso para la producción de rAAV basado en sistemas de baculovirus en células de insectos, derivados de Autographa califórnica que se ha utilizado ampliamente en la producción de proteínas. Liu., et al 2011, utilizó un cultivo de células de Spodoptera frugiperda Sf21 (cultivadas a 27°C en matraces que contenían medio TNM-FH (Sigma, St. Louis, MO, USA) con suplemento 10% FCS, células 3T3 mantenidas en medio DMEM (Gibco, San Diego, CA, EE.UU) con suplemento de suero fetal bovino al 10% a 37°C en 1 atm con 5% de CO2 con tres Three plasmids, pFBDLSR, pFBDVPm11 y pFBGFPR), iniciando con bajas densidades de células a altas densidades en un periodo corto, lo que generó de manera eficiente la producción de rAVV, asociados con el numero de baculovirus unidos a la célula de insecto. Este sistema de cultivo alimento-lote (Fed-batch), es un método rápido y económico para la producción de rAAV.
Otra aplicación, son los anticuerpos monoclonales (mAb) utilizados para la detección de cáncer como parte de la inmunoterapia del diagnostico del cáncer. Las mAb han sido desarrolladas y su uso se ha establecido en células de mamíferos, pero las exigencias están creciendo rápidamente y los organismos transgénicos solo ofrecen cantidades limitadas con un alto costo y no están garantizadas de estar libres de patógenos.
Los Baculovirus en cultivo de células de insectos expresa grandes cantidades de proteínas recombinantes con procesamiento post-traduccional en células eucariotas que logran un montaje correcto y el plegamiento de proteínas glicolisadas, que son esenciales para las actividades biológicas, la estabilidad y longevidad. El anticuerpo monoclonar C017-1A se une a una glucoproteina de superficie, asociada a la regresión de la metástasis del cáncer, el patrón de glucolisacion de una mAb determina su unión y la interaccion entre Fc de inmunoglubolina G esenciales para la actividad antitumoral. Song, 2010, caracterizó las estructuras de N-glicanano y la biofuncion de anticolorectal cáncer anticuerpo monoclonal CO17-1A producida en baculovirus-celulas de insectos, donde las células de insectos infectadas con Baculovirus se establecieron utilizando el vector para la expresión de mAb C017-1A. Los patrones de glicolisacion de insectos y las funciones in vitro de las celulas mAb se observaron mediante tecniacas como la cromatografía liquida de alta presión (HPLC), la prueba ELISA y fluorescencia de células de clasificación (FACS). Estos resultados muestran que la glicolisacion de mAbls es específica con las estructuras de insectos y son biofuncionales a la actividad anti-tumoral.
Nuevos métodos de cultivo de insectos y la producción a gran escala
Los métodos de cultivo por free-batch (alimento por lote) o perfusión han sido los mas atractivos o alternativos para el cultivo de lotes a gran escala. Tradicionalmente en cultivo de células se han utilizado medios de suplementos generalmente con suero fetal bovino (FBS) para apoyar el crecimiento celular de baculovirus y la producción de proteína recombinante. Este suero tiene desventajas, que incluye altos costos, la variabilidad de lote a lote que afecta el rendimiento de las células, la dificultad para su procesamiento y purificación y la contaminación potencial por agentes patógenos tales como Micoplasma, virus y partículas proteicas infecciosos. Por lo tanto se dado una necesidad del desarrollo de sueros libres para su uso en cultivo de células de insectos, donde el suero ejerce un efecto promotor sobre la producción de proteína recombinante. Un estudio realizado por Yamaji 2006, utilizó medios de cultivo libre de suero después de la infección del Baculovirus con una producción eficiente de proteínas recombinantes en células de insectos inmovilizadas. Este estudio investigó dos fases de cultivo de células inmovilizadas dentro de BSPs en matrices de agitación y un bioreactor de 2.5 l de tanque agitado, lo que revela que las células inmovilizadas intensifican el cultivo de células y la producción recombinante de proteínas en medios de proteínas-libre-basal. Este es un método prometedor de producción recombinante de proteínas: un cultivo en dos pasos, en el cual las células primero crecen y el virus-infectante se desarrolla en un medio que contiene suero y la proteína recombinante se produce en un sistema basal libre de proteínas después de la sustitución del medio en días post-infeccion.
Este método, facilitaría la reducción de costos, purificación. Sin embargo, implica la separación de las células en el curso del cultivo, que puede ser una desventaja para la producción a gran escala, pero que se puede solucionar mediante el cultivo de células inmovilizadas.
Las IC han sido utilizadas para la producción a gran escala, ya sea de un gen específico o de proteínas recombinante. Yamaji et al 2008 investigó sobre la producción de un fragmento Frab del anticuerpo catalítico 6D9 en células transformadas de lepidópteros, desarrollado para generar un alto nivel de expresión de las proteínas secretadas por las células transformadas de lepidópteros. El vector de expresión pIE1/153A (ca 11.000 pares de bases) utiliza el promotor de Bombyx mori actina citoplasmática, a partir de la expresión de gen extraño estimulada con la B. mori (VAN (BmNPV) IE-1 transactivador y el potenciador BmNPV HR3), luego de estos se emplea un promotor de actina B.moria para la expresión del fragmento Fab de anticuerpos, donde resultó que las células que presentaron mayores concentración de Fab fragmentos fueron eficiente por incubación en presencia de G418 y blasticidina. Los altos rendimientos de más de 300g/ml del fragmento Fab fueron producidos por el método de cultivo de agitación de las células recombinantes de insectos.
También se ha utilizado la producción de Bionanocapsulas en cultivo de células de insectos inmovilizadas usando partículas porosas de soporte de la biomasa. Donde las partículas L, compuestas de proteína L del antígeno de la hepatitis B de superficie del virus, son candidatos a un gen especifico y un desarrollo de administración de drogas. Shishido., et al 2007 utilizó células de insectos transfectados para la producción de la partícula L. Las L partículas son nano partículas huecas que consisten en la L proteína del antígeno de superficie del virus de la hepatitis B y la membrana del retículo endoplasmatico de fosfolispidos. Antes se utilizaba la producción de particula L en levaduras, pero generaba una ruptura celular y se requería una posterior purificación. Las celulas fueron inmovilizadas con éxito dentro de partículas porosas de biomasa (BSP) en un cultivo con frasco de agitación. Estas células inmovilizadas mostraron una alta productividad específica, comparable a las productividades máximas en cultivos estáticos y de frascos de agitación de células no inmovilizadas.
El uso de un medio de crecimiento de cultivo de células de insectos para aislar bacterias de caballos con pericarditis efusiva, fibrinosa ha sido publicado en un estudio preliminar por Jones et al., 2007. Dado a que la pericarditis es una entidad poco frecuente en los caballos, clasificada como efusiva, fibrinosa o constrictia. Los esfuerzos para aislar bacterias en los fluidos a menudo no son viables, y se han utilizado un Medio de cultivo de células de insectos (ICCGM) de mycobacterium kansasis de un perro con derrame pleural terapéuticamente intratable. Posteriormente una ICCGMA fue optimizado para mejorar el aislamiento de varias especies altamente exigentes tales como Baronella. Debido a que la ingestión de la oruga podría facilitar la transmisión de bacterias-insectos, se inoculo el ICCGM con equinos que tenían pericarditis, mostrando promisorios resultados.
- Estudio de hormonas de los insectos y biopesticidas.
Durante el desarrollo de los insectos, ecdisteroides y hormonas juveniles (JHs) interactúan para regular el crecimiento de las larvas, la metamorfosis y la reproducción, pero los mecanismos moleculares por las cuales las hormonas influyen en la actividad de los insectos aun sigue siendo desconocidas, por lo tanto se ha utilizado las líneas de células de insectos por su fácil uso y manipulación para aclarar las acciones e interacciones de las hormonas a nivel molecular. Soin et al., 2008 informa sobre la posible interaccion del JHs con el complejo receptor de EcR-US P en díptero (Drosophila melanogaster) y lepidópteros (Bombyx mori). Sin embargo, sus resultado no demuestra la verdadera actividad agonista o antagonista de JHs sobre el complejo receptor y por lo tanto el mecanismo de regulación de esta hormona aun sigue siendo desconocido. A pesar de que se conoce poco sobre las sus interacciones moleculares, actualmente se utiliza el nucleopoliedrovirus Anticarsia gemmatalis (AgMNPV) como un pesticida biológico para el control de la oruga del frijol terciopelo (A. gemnatilis), una importante plaga de la soja en Brasil. Por lo tanto se hace necesario el desarrollo de sistemas in vitro y la optimización de la producción en masa en los insectos criados con dietasartificiales para satisfacer la demanda real para el bioinsecticida. Los cultivos de células de insectos son un medio interesante para seleccionar sistemas de la replicación viral de apoyo, resultando útiles por las interacciones celulares virus-huésped y en la producción de Baculovirus. En una publicación por Castro et al., 2006, investigó la capacidad de infección de A gemmatalis a siete líneas celulares de lepidópteros para evaluar los efectos, la síntesis vírica y la producción. Los Baculovirus están atrayendo el interés como potenciales agentes de control biológico de plagas de insectos. Esta producción viral requiere un huésped vivo, el cual puede ser insectos o cultivo de células. Por lo tanto, la identificación de AgMNPV es relevante para el desarrollo de una estrategia de producción en masa de estos biofertilizates.
- Técnicas para la cuantificación de virus en células de insectos
Aun faltan por estudiar las técnicas de deteccion y cuantificación de virus viables en cultivo de células de insectos. En la tinción de insitiuimunofluorescente se han desarrollado técnicas para visualizar y cuantificar la infección de virus en células de Culicoides quienes transmiten el virus de la lengua azul (BTV) a ovinos, bovinos y otros rumiantes. Mecham et al., 2009 probó una técnica inmunológica in situ tinción fluorescente en combinación con un sistema de imagen de detección de infrarrojo.
Las células infectadas se fijaron, permeabilizaron y se hiceron reaccionar con un anticuerpo-virus monoclonal especifico y marcadas con fluorescencia de anticuerpo secundario. La replicación del virus en las células infectadas se visualizó y se cuantificó midiendo la fluorescencia en una cámara infrarroja. La sensibilidad con este método comparable con otras técnicas estándar de cultivo tales como tinción con inmunoperoxidasa resulta ser más eficiente.
Todas estas aplicaciones evidencian que los cultivos de células de insectos pueden tener una gran versatibilidad y viabilidad a la hora de desarrollar producción a gran escala, sin embargo, falta por estudiar técnicas de identificación viral en células de insectos y la regulación hormonal de estos organismos.
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