Las endonucleasas homing (adaptación al español del término inglés homing endonucleases)1 son un tipo especial de enzimas de restricción codificadas por intrones o inteínas, que actúan sobre el DNA de la propia célula que las sintetiza. Más concretamente, en el alelo opuesto al gen que las codifica. La palabra homingalude al movimiento o traslado de esos intrones o inteínas hacia dicho alelo.- ......................................................:http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Especial:Libro&bookcmd=download&collection_id=33a44df49b4f56b7bb2c2a8243fd6f8a5e4874db&writer=rdf2latex&return_to=Endonucleasa+homing
Una cortadora infrecuente es una enzima de restricción cuya secuencia de reconocimiento aparece escasas veces en un genoma. Un ejemplo es la enzima NotI, que corta tras el primer dinucleótido GC de una secuencia 5'-GCGGCCGC-3'. Las enzimas de restricción con secuencias de reconocimiento de 7 u 8 pares de bases se incluyen habitualmente en este grupo (las secuencias de reconocimiento con 6 pares de bases son mucho más frecuentes).
Por ejemplo, las enzimas cortadoras infrecuentes con sitios de reconocimiento de 7 nucleótidos cortan el genoma humano una vez cada 47 pb (16 384 pb), en promedio, mientras que las que tienen sitios de 8 cortan cada 48 pb (65 536 pb). Estas enzimas se utilizan en la secuenciación de genomas para cortar cada cromosoma en trozos cuyo tamaño medio tenga esos valores.
Un enzima de restricción (o endonucleasa de restricción) es aquella que puede reconocer una secuencia característica de nucleótidos dentro de una molécula de ADN y cortar el ADN en ese punto en concreto, llamado sitio o diana de restricción, o en un sitio no muy lejano a este. Los sitios de restricción cuentan con entre 4 y 12 pares de bases, con las que son reconocidos.- .............................:http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Especial:Libro&bookcmd=download&collection_id=34e30b30f347eb85087efc1634f9a389b21be057&writer=rdf2latex&return_to=Enzima+de+restricci%C3%B3n
Enzimas de Restricción y Electroforesis de DNA
Modificado de preparación de laboratorio por: Omayra Rivera Denizard e
Idaris de Jesús Maldonado
Enzimas de Restricción
· Las enzimas de restricción, también conocidas como endonucleasas, son enzimas que cortan los enlaces fosfodiester del material genético a partir de una secuencia que reconocen.
· Las mismas permiten cortar DNA de hebra doble, donde reconocen secuencias palindrómicas (secuencias que se leen igual en ambas direcciones).
· Son extraídas de organismos procarióticos (bacterias), donde actúan como un mecanismo de defensa, para degradar material genético extraño que entre en la célula. Las bacterias tienen la capacidad de metilar su DNA, lo cual sirve para distinguir entre el DNA extraño y el DNA propio. Las enzimas de restricción no pueden cortar DNA metilado, de este modo solo afectan el DNA extranjero y no el DNA bacterial.
· Existen 3 tipos de enzimas de restricción:
1. Tipo I y Tipo III:
a. Tienen actividad de restricción (cortan) y modificación (metilan).
b. Cortan a cierta distancia de la secuencia de reconocimiento, las Tipo I cortan lejos de la secuencia de reconocimiento, ya sea río arriba o río abajo. Las Tipo III cortan de 5-8 bases antes o despúes de la secuencia que reconocen.
c. Necesitan ATP para moverse a través de la molécula de DNA, desde el lugar de reconocimiento hasta el sitio del corte.
2. Tipo II:
a. Sólo tienen actividad de restricción.
b. Cortan de manera consistente y predecible dentro de la secuencia que reconocen.
c. Sólo requieren Mg++ como cofactor.
d. No necesitan ATP.
· Aplicaciones de las enzimas de restricción:
1. Hacer mapa de restricción de un plásmido o bacteriófago.
2. Fragmentar DNA genómico para separación de electroforesis y “Southern Blot”.
3. Generación de fragmentos para ser usados como sondas marcadas en “Southern”y “Northern” blotting.
4. Generación de fragmentos para ser subclonados en los vectores apropiados, creación de DNA recombinante.
· Las endonucleasas se nombran a partir de las bacterias de las que son extraídas, su nombre está dado según el género y la especie de la bacteria de donde se aisló por primera vez esta enzima. La primera letra representa el género de la bacteria, las próximas dos indican la especie, una cuarta letra indica la cepa, y un número al final indica la cantidad de enzimas que se han aislado de esa cepa. Ej:
Eco RI à E = género Escherichia
co = especie coli
R = cepa RV 13
I = primera endonucleasa aislada de esta cepa
· Las enzimas de restricción al cortar el DNA pueden producir 2 tipos de cortes:
1. Cohesivos o pegajosos:
 |  | ||||
 | |||||
GAATTC GGATCC AAGCTT
CTTAAG CCTAGG AACGAA
EcoRI BamHI HindIII
2. Abruptos:
 |
AATATT CCCGGG
TTATAA GGGCCC
SspI SmaI
· Existen varios factores que son críticos al trabajar con enzimas de restricción y que pueden afectar la actividad de las mismas:
1. Pureza del DNA – la reacción de enzimas es muy dependiente de la pureza, contaminantes como proteínas, fenol, cloroformo, etanol, EDTA, SDS, altas concentraciones de sal, etc. inhiben la endonucleasa.
2. Temperatura y pH – las enzimas son muy sensitivas a temperatura y pH en lo que respecta a su estabilidad y actividad.
3. DNAsas – Las DNAsas degradan el DNA en presencia de Mg++ .
4. Contaminantes con carga (-).
5. DNA contaminado con otro DNA.
6. Grados de metilación – algunas endonucleasas son inhibidas por metilación.
7. Tipo de molécula de DNA – si el DNA no tiene la secuencia que es reconocida por la enzima accesible, esta no puede cortar el material genético (ej. si el DNA está superenrrollado el lugar de restricción no va a estar accesible para la enzima).
8. Buffer adecuado – este provee el ambiente que necesita la enzima para trabajar en condiciones óptimas.
· Importante: Una unidad de enzima se define como la cantidad de enzima que se necesita para cortar 1µg de DNA en 1 hora.
· El buffer siempre debe añadirse como un 10% de la reacción total de digestión.
Electroforesis de DNA
· La electroforesis es cuando moléculas cargadas son forzadas a ir a través de una matriz debido a un flujo de corriente eléctrica.
· Una molécula de DNA cortada con enzimas de restricción genera diferentes fragmentos. Estos pueden ser separados en base a su tamaño utilizando un gel de electroforesis.
· El gel puede estar hecho de agarosa o poliacrilamida:
v La agarosa es un polisacáriso de galactosa y derivados de galactosa que se entrecruzan por puentes de hidrógeno. Se puede variar el tamaño de los poros ajustando la concentración de agarosa.
v Los geles de poliacrilamida son generados al mezclarse polímeros de acrilamida y bisacrilamida en una reacción catalizada por persulfato de amonio y TEMED. El tamaño de los poros depende de la concentración de acrilamida y bisacrilamida.
v La matriz de poliacrilamida posee poros mas pequeños que la de agarosa, permitiendo la separación de fragmentos mas pequeños.
· Los fragmentos de DNA migrarán a una razón inversamente proporcional al logaritmo de su tamaño o peso molecular.
v A mayor tamaño menor será la migración del fragmento y a menor tamaño mayor será la migración del fragmento.
· El movimiento de los fragmentos de DNA va a producir un patrón de bandas, donde cada banda corresponde a un fragmento de un tamaño particular.
v El tamaño de cada fragmento puede ser determinado utilizando un marcador o una escalera de DNA cuyos fragmentos tienen pesos moleculares conocidos.
v Este marcador sirve de control y migrará paralelo a las bandas de DNA que deseamos analizar.
· Una mezcla de diferentes moléculas puede ser separada en base a
v Tamaño de la molécula o masa.
v Forma o conformación del DNA (ej. DNA superenrollado migra mas que DNA lineal).
v Tamaño de los poros del gel.
v Magnitud de la carga neta de la molécula.
· Bajo condiciones fisiológicas los grupos fosfatos de los ácidos nucleicos son ionizados y migrarán al electrodo positivo (ánodo) cuando se colocan en presencia de un campo eléctrico.
v La carga neta del DNA es negativa (por la presencia de los grupos fosfatos) lo que permite que migre del clo que permite que migre del cátodo (electrodo negativo) al ánodo (electrodo positivo).
Protocolo
Digestión de DNA con Enzimas de Restricción:
1µL de buffer 10 X
1µl de enzima (EcoRI)
1µL de DNA
7µL de H2O
10µL de Volumen Total
Incubar a 37ºC por 30 hora
Preparación de muestras para la corrida:
DNA sin cortar
1µL de DNA sin cortar
9µL de H2O
2µL de loading dye
DNA cortado
10µL de digestión
2µL de loading dye
Corrida del Gel de Electroforesis:
1. Prepara el gel de electroforesis 1% agarosa, calentando una mezcla que contiene 1g de agarosa y 100 mL de buffer TBE 1X, hasta que se disuelva la agarosa, déjala enfriar hasta aprox. 55ºC ó hasta que puedas tomar el matraz con la mano sin quemarte.
2. Vierte la gel en un “gel holder” evitando la formación de burbujas de aire ya que estas pueden afectar la separación de las bandas del DNA. Inserta la peinilla y deja la gel en un lugar seguro sin moverla hasta que polimerice completamente.
3. Colocarlo en un tanque de electroforesis. Añada suficiente buffer de electroforesis TBE 1X hasta que cubra el gel.
4. Prepara las muestras de DNA, remueve la peinilla y coloca las muestras en las fosas usando una micropipeta.
5. Coloque el gel en la cámara de modo que la muestras migren del cátodo (atrae cargas -) al ánodo (atrae cargas +).
6. Conecte la cámara a un power supply y encienda a una razón de 10V por cada cm de gel.
7. Deje migrar las muestras hasta que la línea del tinte se encuentre donde usted desee y apague el equipo.
8. Deje teñir la gel en tinte. Destiña por 30 min en agua si fuera necesario.
9. Saque una fotografía del gel contra una fuente de luz UV.
10. Descarte el gel.
· El "loading dye"que se utiliza contiene bromofenol azúl y glicerol. El bromofenol azúl es un tinte que nos servirá para poder observar en la corrida por donde va el DNA, y el glicerol le da peso a la muestra evitando así que esta se salga de la fosa.
Resultados Esperados
Lamda DNA- 48502bp
Cortes con EcoRI Cortes con HindIII
21226 23130
7421 9416
5804 6682
5643 4361
4878 2327
3530 2027
564
pGLu- 7831bp
Cortes con EcoRI Cortes con HindIII
4069 5146
3762 2685
1Kb Ladder
12216
11198
10180
9162
8144
7126
6108
5090
4072
3054
2036
1636
1018
517
506
396
344
298
220
201
154
134
75
Quiz #1
Laboratorio Enzimas de Restricción y Electroforesis de DNA
1. Mencione 3 factores que afectan la actividad de las enzimas de restricción.
3pts
2. Las enzimas de restricción de tipo II reconocen secuencias de DNA específicas y cortan fuera de esas secuencias. Cierto o Falso.
1 pto
3. Mencione de que está hecho el gel de agarosa y el gel de poliacrilamida. 2pts
4. Mencione un ejemplo de una enzima que genere terminales cohesivos y una
que genere terminales abruptos. 2pts
5. Mencione 2 criterios para la separación de fragmentos en electroforesis. 2pts
Bono
Escriba la secuencia de DNA que reconoce la enzima SmaI
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