Terapia Génica II
Problemas
Alcanzar el objetivo de las terapias génicas eficaces para las enfermedades humanas ha sido un año difícil.Algunos de los problemas que quedan por resolver son:
- cómo evitar una respuesta inmune en el paciente, que puede interferir con la terapia génica de dos maneras:
- El vector provoca la inflamación .
- El vector provoca anticuerpos que destruyen el vector cuando se administra de nuevo.
- cómo obtener el gen en las células que no se dividen como el hígado, los músculos y las neuronas;
- cómo obtener el gen a ser replicado (en la división de las células) y se expresa de forma indefinida, pero
- minimizar el riesgo de que se inserta cerca de un proto-oncogén que podría activar la producción de un cáncer. (Esto ocurrió en varios niños pequeños tratados con un vector retroviral basado en el virus de la leucemia murina. [ Enlace ])
- ¿Cómo obtener el gen a expresar , según sea necesario ; es decir, la forma de llevar el gen bajo controles fisiológicos normales de manera que su producto es producido dónde, cuándo, y en las cantidades necesarias.
Virus adeno-asociado (AAV) - Una solución posible?
Virus adeno-asociado recibe su nombre debido a que se encuentra a menudo en las células que están infectadas simultáneamente con adenovirus. Sin embargo, por sí misma parece ser inofensivo.A diferencia de adenovirus, AAV
- no estimula la inflamación en el huésped;
- puede entrar en las células que no se dividen;
- integra con éxito en un punto en el genoma de su huésped - en el cromosoma 19 en los seres humanos.
- (Sin embargo, los vectores AAV hacen provocar una fuerte respuesta inmune para que puedan ser usados solamente una vez).
- uno que lleva el gen deseado (por ejemplo, para el factor VIII o la adenosina desaminasa , o en el caso ilustrado aquí, eritropoyetina ) en las células del huésped;
- los otros genes que llevan a los componentes de los factores de transcripción necesarios para convertir ese gen en.
La estrategia en acción.
En la edición de 01 de enero 1999 Ciencia , James M. Wilson y sus colegas informaron de los resultados de la utilización de esta estrategia tanto en ratones y monos rhesus. Se inyectaron sus animales de experimentación con dos vectores.Vector 1
Esta pieza de ADN contenía (entre otras cosas):- el ADN de virus adeno-asociado ( AAV )
- un gen que codifica una proteína que contiene dos dominios:
- una porción de la molécula (" p65 ") que se necesita para activar la transcripción de genes , pero que por sí mismo no puede unirse al ADN
- una parte (" FRB ") que se une el fármaco rapamicina .
- un gen que codifica otra proteína con dos dominios:
- una porción de la molécula (" ZFHD1 ") que se une específicamente a la secuencia de ADN en el promotor de la eritropoyetina gen, pero que por sí misma no puede activar la transcripción del gen;
- una parte (" FKBP12 ") que también se une a la rapamicina.
- promotores (no mostrados) que permiten la expresión continua (transcripción y traducción) de los dos genes. Pero tenga en cuenta que, por sí mismos, los dos productos génicos están inactivos.
Vector 2
Esta pieza de ADN contenía (entre otras cosas):- el ADN de virus adeno-asociado ( AAV );
- 12 promotores idénticos (cajas verdes) del gen de la eritropoyetina;
- el gen de la eritropoyetina ( EPO ) en sí.
El Experimento
Los animales experimentales fueron inyectados (en sus músculos esqueléticos) con muchas copias de ambos vectores. El músculo esquelético fue elegido porque las fibras musculares son multinucleadas. Una vez a través de la membrana plasmática, hay muchos núcleos que los vectores pueden entrar y por lo tanto muchas oportunidades para integrarse en el ADN del huésped.Más tarde, los animales fueron inyectados con la rapamicina . Esta pequeña molécula es un inmunosupresor y actualmente está siendo probado en los receptores de trasplante para ayudarles a evitar el rechazo del trasplante . Fue utilizado aquí debido a su capacidad para unirse simultáneamente a los dominios FRB y FKBP12 de los dos productos génicos de vector 1. El trímero resultante es un activo factor de transcripción para el gen de la eritropoyetina.
Los Resultados
En los ratones
- inyecciones de los dos vectores tenían - por sí mismos - ningún efecto sobre la producción de EPO ni en el número de glóbulos rojos ( hematocrito ), pero
- cada vez que estos animales se les dio una inyección de la rapamicina , se
- rápidamente comenzó a producir EPO (con niveles cada vez mayor tanto como 100 veces) y
- el número de glóbulos rojos (hematocrito aumentó aumento del 42% al 60%).
- La cantidad de EPO producida estaba directamente relacionada con la cantidad de rapamicina dado.
- Incluso después de 5 meses, una sola inyección de rapamicina produjo un fuerte aumento en el nivel de EPO en la sangre.
En los monos
Los resultados fueron similares a los de los ratones, pero el efecto se disipó después de 4 meses.Así que aquí es un sistema donde un gen introducido en un animal puede ser entonces
- encendido por el animal dando una molécula pequeña. (En los seres humanos, la rapamicina se puede administrar por vía oral en forma de pastilla.)
- puede tener su salida regulada por la cantidad de la pequeña molécula administrada.
Curado insulino-dependiente diabetes mellitus (DMID) en ratones y ratas
Los investigadores en Seúl, Corea informaron en la edición del 23 de noviembre de 2000 la naturaleza que han utilizado un vector de tipo AAV para curar- ratones con DMID heredada (el equivalente de animales de diabetes mellitus tipo 1 en los seres humanos).
- ratas con IDDM inducida por la destrucción química de sus secretoras de insulina de las células beta .
- AAV
- el ADN complementario (ADNc) que codifica una versión sintética de la insulina
- un promotor que es activo solamente en células del hígado y se enciende por la presencia de glucosa
- el ADN que codifica una secuencia señal (de modo que la insulina puede ser secretada)
- un potenciador para elevar la expresión de este gen artificial.
Los resultados:
Ambos grupos de animales ganaron el control de su nivel de azúcar en la sangre y mantienen este control por más de 8 meses. Cuando se administra glucosa, se procedió a sintetizar la insulina sintética que luego trajo su glucosa en la sangre de regreso a los niveles normales.Curar la hemofilia B en ratones
Los investigadores del Instituto Salk informaron (en la edición de los 30 de marzo 1999 Actas de la Academia Nacional de Ciencias ) trabajan con ratones- cuyos genes para el factor IX de coagulación habían sido " eliminado "y
- por lo tanto estaban sujetos a la hemorragia no controlada, como pacientes humanos con hemofilia B .
- AAV
- ADNc para el factor IX (el gen perro)
- secuencias promotoras y potenciadoras específicas del hígado
En trabajos posteriores, la inyección de células madre embrionarias con el funcionamiento genes de factor IX en el hígado de los ratones sin los genes les curados.
El tratamiento de la ELA
ALS ( un miotrófica l ateral s clerosis) es una enfermedad humana en la que las neuronas motoras se degeneran. (A menudo se llama "la enfermedad de Lou Gehrig" después de que el jugador de béisbol que murió de la misma.)Una enfermedad similar se puede crear en ratones transgénicos que llevan genes humanos mutantes (para la superóxido dismutasa ) asociados a ALS.
Los investigadores del Instituto Salk han desacelerado hasta la progresión de la enfermedad en estos ratones mediante la inyección de sus músculos esqueléticos con un vector de AAV que contiene el gen para el factor de crecimiento similar a la insulina 1 ( IGF-1 ). El vector
- invadido las células musculares
- trasladado a las neuronas motoras unidos a ellos y
- a través de sus axones hasta los cuerpos celulares .
Perspectivas
Es un gran salto de los ratones a los humanos, pero estos resultados indican que el principio de la terapia génica para los trastornos de un solo gen es válida.Y algunos los primeros ensayos en humanos parecen prometedores.
- Una inyección intravenosa de un vector de AAV que contiene el cDNA de factor IX ha producido niveles funcionales de factor IX en varios hombres con hemofilia B .
- El 18 de agosto de 2003, los médicos en Nueva York inyectaron 3,5 x 10 9 copias de un vector de AAV que lleva un gen para la síntesis de GABA en el cerebro de un paciente con la enfermedad de Parkinson. Fue el primero de una fase I de ensayos clínicos de este procedimiento. Para el año 2007, los pacientes de Parkinson varios más habían sido tratados con estas inyecciones sin efectos secundarios dañinos y una cierta mejora en sus síntomas.
- Varios pacientes con una carencia hereditaria de un gen funcional necesaria para sintetizar 11- cis retinal - y por lo tanto destinados a ser ciego - han tenido un nivel útil de la visión restaurada en un ojo inyectado con un vector de AAV que contiene el gen (el otro ojo era el control no tratado). Probablemente el hecho de que
- el vector se inyecta directamente en el ojo y así no diluyó en todo el cuerpo como una inyección intravenosa sería;
- células de la retina rara vez se dividen por lo que no se perdería el vector. (El vector utilizado tenía los genes necesarios para la integración en el ADN de la célula huésped eliminado por lo que no podría ser duplicado en la fase S , y en las células en división, eventualmente desaparecerá.)
- el interior del ojo es un sitio inmunológicamente privilegiado
- Varios niños que sufren de inmunodeficiencia combinada grave ligada al cromosoma X han tenido sus sistemas inmunológicos restauran después retroviral terapia génica. [ Enlace al debate ]
- Algunos pacientes con hemofilia A han mostrado una mejora modesta cuando se inyecta con sus propias células que anteriormente habían sido recolectadas y transformadas in vitro con un plásmido que contiene el gen del factor VIII.
- Varios agentes de terapia génica - utilizando vectores adenovirales - están en ensayos clínicos y han mostrado alguna promesa.Entre estos:
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