Candidatus Chloracidobacterium thermophilum1 2 es una Acidobacteria recientemente descubierta en el Parque Nacional Yellowstone. Hasta ese momento sólo se conocían cinco filos bacterianos con miembros capaces de realizar la fototrofia basada en la clorofila. Con este descubrimiento, un sexto filo, Acidobacteria se incorpora a la lista. La bacteria crece en presencia de luz y oxígeno a una temperatura de entre 50 y 66 °C junto a las cianobacterias en la superficie de las alfombras microbianas que dan a los manantiales de Yellowstone su colores anaranjados, marrones, amarillos y verdes. Sorprendentemente, presentanclorosomas, lo que es inédito entre las bacterias aerobias fotosintéticas. Los clorosomas contienen dos tipos de bacterioclorofilasque le permiten una gran versatilidad a la hora de competir con las cianobacterias.
Un nuevo miembro photoheterotrophic anoxigénica del phylum Acidobacteria, chloracidobacterium thermophilum thermophilum cepa B, se aisló de un cultivo de enriquecimiento de cianobacterias derivado de tapetes microbianos asociados con Octopus Spring, Parque Nacional de Yellowstone, WY. C. thermophilum es un bacilo gram-negativo (diámetro, ~ 0,8-1,0 m; longitud variable, ~ 2.5 micras), que forma cultivos en suspensión líquidos marrón verdoso. Es un microaerófilo moderadamente termofílica y crece en un medio definido a 52 ° C (Topt; rango de 44 a 58 ° C) en el rango de pH 5.5 a 9.5 (pHopt = ~ 7,0). El contenido de ADN G + C era 61,3% en moles, y el análisis filogenético basado en la secuencia 16S rRNA mostró que C. thermophilum pertenece a la subdivisión 4 (Acidobacteriaceae) de la Acidobacteria. C. thermophilum es incapaz de sintetizar ácidos de cadena ramificada aminoácidos, L-lisina, y vitamina B12, que son necesarios para el crecimiento.Aunque el organismo carece de genes / enzimas para la fijación de carbono autótrofos, se requiere de bicarbonato. El crecimiento fue estimulado por otros aminoácidos y 2-oxoglutarato. Las células producen clorosomas que contienen una mezcla diversa de bacterioclorofila (BChl) derivados de c, y, además, sintetizan BChl aP, Chl APD y Zn-BChl A'p que se producen en el tipo-1 centros de reacción homodiméricas. Los carotenoides incluyen equinenona, cantaxantina, el licopeno, γ-caroteno y β-caroteno. C. thermophilum produce ácido iso-diabólica como su principal ácido graso y sintetiza tres hopanoides (diploptene, bacteriohopanetetrol y bacteriohopanetetrol éter ciclitol). Con base en su fenotípicas y genotípicas propiedades, el nombre chloracidobacterium thermophilum thermophilum gen. nov., sp. noviembre se propone para este aislado; el tipo de cepa es C. thermophilum cepa BT (ATCC BAA-2647 = 30199 JCM).
Clorosomas se SAC-como, orgánulos captadores de luz que contienen característicamente un gran número de bacterioclorofila (BChl) c , d , o correosmoléculas. Estas estructuras de antena se producen en chlorophototrophs pertenecientes a algunos miembros de la Chlorobi y Chloroflexi filos y también se encuentran en un miembro recientemente descubierto del phylum Acidobacteria , "Candidatus chloracidobacterium thermophilum thermophilum. "" Ca .Chloracidobacterium thermophilum thermophilum "es el primer organismo aerobio descubierto poseer clorosomas como antenas captador de luz para el crecimiento fotótrofas. Clorosomas fueron aisladas de " Ca . Thermophilum chloracidobacterium thermophilum "y sometidos a electrones microscópico, espectroscópico y análisis bioquímicos. Los clorosomas de " Ca .Chloracidobacterium thermophilum thermophilum "tenía un tamaño promedio de ~ 100 por 30 nm. Crio-microscopía electrónica mostró que los BChl c moléculas formadas dobladas o torcidas, estructuras laminares con una separación de aproximadamente 2,3 nm lamelar. A diferencia de los Bchls en los clorosomas de la bacteria de azufre verde Chlorobaculum tepidum , no se observaron nanotubos cilíndricos concéntricos. Clorosomas de " Ca . Chloracidobacterium thermophilum thermophilum "contenía un homólogo de CSMA, la BChl una unión a proteína placa base; CsmV, una proteína lejanamente relacionada con CSMI, CSMJ y CsmX de C.tepidum , lo que probablemente se une un solo clúster [2Fe-2S]; y cinco polipéptidos únicos (CSMR, CSMS, GSC, CSMU, y NADH deshidrogenasa homólogo de tipo II). Aunque " Ca . Chloracidobacterium thermophilum thermophilum "es un aerobio, la transferencia de energía entre los Bchls en estos clorosomas se inactivó muy fuertemente en presencia de oxígeno (medida por extinción de la emisión de fluorescencia). Los análisis combinados mostraron que los clorosomas de " Ca .Chloracidobacterium thermophilum thermophilum "poseen una serie de características únicas, pero también comparten algunas propiedades con las que se encuentran en clorosomas miembros anaeróbicos de otros phyla.
El acidobacterium " Candidatus chloracidobacterium thermophilum thermophilum "es la primera organismo conocido que sintetiza clorosomas en condiciones óxicas ( 4 , 5 , 22 ). Por otra parte, también es el primer organismo clorosoma-sintetizar que no es un GSB o un FAP. Debido a estas propiedades únicas, clorosomas de "Ca . Thermophilum chloracidobacterium thermophilum "fueron aislados y analizados con el objetivo de determinar si podrían tener propiedades inusuales para mejorar la recolección de luz bajo condiciones óxicas.
MATERIALES Y METODOS
Las condiciones de cultivo. " Ca . Chloracidobacterium thermophilum thermophilum "se cultivó en un tamponadas-HEPES, sales de medio mínimo suplementado con fuentes de carbono reducidas orgánicos y amoníaco como fuente de N como se ha descrito previamente ( 5 , 21 , 22 ). Los cultivos se incubaron a 53 ° C con agitación moderada y se recogieron 5 días después de la transferencia a un medio fresco, cuando BChl c absorción fue máxima. C. tepidumy C. aurantiacus 396-1 se cultivaron en condiciones anóxicas como se ha descrito previamente ( 16 , 38 ).
Aislamiento clorosoma. clorosomas de C. tepidum se aislaron como se ha descrito previamente ( 66 , 67 ). Para el aislamiento de clorosomas de " Ca .Chloracidobacterium thermophilum thermophilum "y C. aurantiacus Y-396, las células fueron cosechadas en tampón de aislamiento clorosoma (CIB) que contiene 2,0 M NaSCN, mM Tris-HCl 10 (pH 7,5), EDTA 5 mM, 1,0 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo y ditiotreitol 2,0 mM, se incubaron con lisozima (3 mg ml -1 ) durante 20 min, y se sometió a 3 pases a través de una (~ 4 ° C) celda de presión francesa enfriada a 138 MPa. Las células intactas y los desechos se sedimentaron por centrifugación a baja velocidad (2.000 × g ), y el sobrenadante resultante se recogió y se llevaron a 30% (peso / vol) de sacarosa. Un gradiente de sacarosa paso se generó con 45% (peso / vol) de sacarosa en CIB, seguido por la fracción sobrenadante de baja velocidad, 20% (peso / vol) de sacarosa (peso / vol) y 5% (peso / vol) de sacarosa, tanto en el CIB. Los gradientes se centrifugaron durante 18 h a 250,000 × g . La fracción clorosoma apareció como una capa marrón verdoso oscuro y en la parte superior del gradiente. Esta banda se recogió y se diluyó 3 veces en tampón de clorosoma (10 mM K-fosfato y NaCl 150 mM; pH 7,5); clorosomas se sedimentaron por ultracentrifugación de alta velocidad a 220.000 × g . Este último paso se repitió una vez más, y el sedimento resultante se clorosoma dividió en alícuotas y se almacenó a 4 ° C para microscopía electrónica o almacena a -80 ° C para otros análisis.
Microscopía electrónica y crio-electrón microscopía. clorosomas aislados se tiñeron negativamente con 1% (peso / vol) de acetato de uranilo y se visualizaron en un JEOL 1200 EXII (Peabody, MA) o un Philips CM120 (Eindhoven, Países Bajos) microscopio electrónico de transmisión. Por microscopía electrónica de las células delgadas seccionado, cosechado " Ca . Células chloracidobacterium thermophilum thermophilum "se fijaron con una de osmio-tetraóxido de potasio tándem permanganato de fijación como se ha descrito previamente ( 29 ). Después de la fijación, las células se tiñeron en bloque con 1% (/ vol en peso) de acetato de uracilo y deshidratado con 25%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, y 100% (vol / vol) de etanol y con acetonitrilo. Células deshidratadas fueron embebidos en resina de Spurr según los protocolos estándar y se dejaron polimerizar en un 60 ° C horno durante la noche. Las imágenes fueron tomadas en un microscopio JEOL 1200 EXII electrónica de transmisión (Peabody, MA). Para crio-microscopía electrónica, alícuotas de clorosomas purificadas se aplicaron a las redes de carbono holey con una fina capa de carbono y se desplome-congelado en etano líquido a 83 K con un sistema de vitrificación Vitrobot (FEI, Eindhoven, Países Bajos). La microscopía electrónica se realizó con un microscopio Tecnai G2 Polara electrones (FEI, Eindhoven, Países Bajos), que estaba equipado con un filtro de energía Gatan a 115.000 × magnificación y una temperatura de la muestra de 80 K. Las imágenes fueron grabadas en el modo de imagen-cero pérdida , utilizando un ancho de ranura de 20 eV, con una cámara de dispositivo de carga acoplada-exploración lenta en underfocus 1-m, tener la transferencia de contraste de fase óptima a 300 kV para más detalles con una periodicidad de aproximadamente 2 nm. Para la tomografía, de doble eje serie de inclinación de una muestra de clorosoma teñidas negativamente se registraron en un microscopio electrónico de Tecnai G2 Polara con una ampliación de 63.250 ×, con ángulos de inclinación de -66 ° a + 58 °, con un incremento de 2 °. Las tomografías se calcularon utilizando software IMOD ( 31). Para producir las tomografías finales, los volúmenes derivados de las dos inclinaciones de un solo eje fueron alineados entre sí y se combinaron y sin ruido con 20 iteraciones por difusión anisotrópica no lineal ( 12 ).
Electroforesis en gel de poliacrilamida. clorosoma proteínas se analizaron por electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) en presencia de dodecil sulfato de sodio (SDS) usando un sistema tampón Tris-Tricina ( 55 ). El gel de apilamiento fue 3% de monómero y 3,3% reticulante, y el gel de resolución era 15% de monómero y 3,3% reticulante. Brevemente, las muestras que contienen ~ 20 g de BChl c se incubaron a 98 ° C en 1 × tampón de carga (tampón de 0,1 M Tris-Cl [pH 6,8], 8% [vol / vol] glicerol, 2% [peso / vol] SDS , 5% [vol / vol] mercaptoetanol, y trazas de azul de bromofenol) durante aproximadamente 2 min y 16 h para electroforesis a voltaje constante. Las proteínas se visualizaron mediante tinción de plata ( 3 ) o tinción de azul de Coomassie. El formaldehído en la etapa de fijación inicial en el protocolo de tinción de plata a veces se omite (ver Resultados y Discusión).
Amino-terminal secuenciación y análisis de espectrometría de masas de proteínas clorosoma. clorosoma proteínas separadas por SDS-PAGE se transfirieron a una membrana de PVDF en un aparato de electrotransferencia semiseca Bio-Rad utilizando una mM Tris 25, glicina 192 mM, 20% (vol / vol) metanol, y 0,1% (peso / vol) SDS tampón de transferencia de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de la transferencia electroforética, blots fueron enjuagados con agua destilada, y las proteínas transferidas se visualizaron por tinción con Ponceau S (0,1% [peso / vol] Ponceau S en 5% [vol / vol] de ácido acético). Las bandas se escindieron y se secuenciaron en las Proteómica y Espectrometría de Masas, Huck Institutos de Ciencias de la Vida, de la Universidad Estatal de Pennsylvania, Hershey, PA. Para los análisis de huellas dactilares tríptico péptido masa, geles SDS-PAGE se tiñeron con plata, y las bandas visualizados fueron extirpados y analizados en la Proteómica y Espectrometría de Masas, Huck Institutos de Ciencias de la Vida de la Universidad Estatal de Pennsylvania, University Park, Pensilvania. Los péptidos producidos por la digestión con tripsina se identificaron utilizando el motor de búsqueda MASCOTA (Matrix Science).
Absorbancia y fluorescencia de emisión de la espectroscopia. espectros de absorbancia de temperatura ambiente se midieron con un espectrofotómetro GENESYS 10 (Thermo Electron Corp., Rochester, NY). Los espectros de emisión de fluorescencia se midieron con un espectrofluorómetro modelo 8000C SLM-Aminco, modificado por OLIS, Inc., para la adquisición de datos informatizado y equipadas con un Dewar de nitrógeno líquido cuando sea necesario para la adquisición de espectros a 77 K. Los datos fueron analizados utilizando Igor-Pro ( Wavemetrics, Inc., Lake Oswego, Oregón). Para las mediciones de la emisión de fluorescencia, fracciones celulares y clorosoma se descongelaron y se diluyeron con 10 mM de tampón Tris-HCl, pH 7,2, a una absorbancia de 0,1 en la Q ymáximo para BChl c . Excepto para las mediciones registradas en condiciones óxicas, se añadió ditionito de sodio (concentración final, 25 mM), y las muestras se incubaron en la oscuridad durante ~ 2 h antes de las mediciones.
Espectroscopia EPR-banda X. de electrones de baja temperatura espectroscopía de resonancia paramagnética (EPR) se realizó usando un espectrómetro de banda X Bruker ECS-106 equipado con un criostato helio líquido Oxford y controlador de temperatura. Spectra son los promedios de 8 exploraciones grabadas en las siguientes condiciones: frecuencia, 9,48 GHz; ganar, 20.000; modulación de amplitud, 10 G a 100 kHz; de potencia y temperatura, como se indica en la leyenda de la figura. Las muestras contenían 9,2 mg BChl c ml -1 y se redujeron con ditionito 50 mM en glicina 100 mM, pH 10.
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