biología celular

citoesqueleto :

La citoqueratina, también llamada tonofibrilla, es una de las proteínas fibrosas que forman los filamentos intermedios del citoesqueleto intracelular en particular de células epiteliales (incluyendo mucosas y glándulas), así como en las uñas, pelo y en las plumas de los animales. Los monómeros de citoqueratina están ligados una a la otra por moléculas de filagrina. Su función principal es la organización de la estructura tridimensional interna de la célula (por ejemplo, forman parte de la envuelta nuclear y de lossarcómeros), forman una barrera rígida la cual evita la entrada de microorganismos. Esa misma barrera cumple la vital función de retener agua dentro de las células. También participan en algunas uniones intercelulares (desmosomas).

Irregularidades en la expresión de las proteínas de citoqueratina forman la raíz de condiciones atípicas, tales como eccema, ictiosis, soriasis y ciertos tipos de cáncermetastático.

Las citoqueratinas constituyen el principal componente del citoesqueleto de las células epiteliales, donde forman un gran grupo de filamentos intermedios cuyo diámetro oscila entre 8 y 10 nm. En la especie humana forman una compleja familia codificada por, al menos, 20 genes diferentes, cuyo peso molecular varía entre 40 y 70 kDa y su punto isoeléctrico oscila desde 5.2 a 7.8 (CREWTHER et al., 1983; STEINERT & ROOP, 1988).

Las citoqueratinas corresponden a un grupo de 19 proteínas que se caracterizan por su estabilidad y su baja solubilidad en tampones fisiológicos. Mediante métodos electroforéticos e inmunológicos con anticuerpos monoclonales, se han clasificado en 2 subfamilias: la primera comprende proteínas básicas relativamente grandes (56 a 67 kDa), numeradas de 1 a 8; mientras que la segunda está constituida por proteínas más pequeñas, más acídicas y son numeradas de 9 a 19.

Los dos grupos de citoqueratinas se comportan como heteropolímeros obligados, es decir, se requiere un miembro de cada grupo para la formación de un filamento de queratina, con excepción de la citoqueratina 19. Como consecuencia de esto, cada epitelio expresa por lo menos dos citoqueratinas diferentes. Por ejemplo, las queratinas 5 y 14 se encuentran juntas en todos los queratinocitos, la 1 y 10 están en los epitelios queratinizados, la 4 y 13 en epitelios estratificados no queratinizados y la 8 y 18 en epitelios simples. La queratina 19 aparece sola, en epitelios simples. Pero dependiendo de la complejidad del epitelio, el número y tipo de queratinas presentes puede variar (CREWTHER et al.; STEINERT & ROOP).

Se ha establecido que las citoqueratinas de bajo peso molecular (40 kDa) se encuentran en epitelios simples y glandulares, las de peso molecular intermedio en epitelios estratificados y las de alto peso molecular (~ 67 kDa) en epitelios queratinizados. Su expresión es afectada por factores ambientales y cambios patológicos (SAWAF et al., 1991).

El epitelio que tapiza la encía es un epitelio estratificado escamoso que puede tener distintos grados de cornificación, variando desde el epitelio ortoqueratinizado al paraqueratinizado y no cornificado (TEN CATE, 1994).

Las células epiteliales experimentan cambios morfológicos y composicionales a medida que migran desde la capa basal hacia la superficie y aunque, se han encontrado algunas queratinas en tejidos no epiteliales como los órganos linfoides, éstas todavía siguen siendo los mejores marcadores de la diferenciación epitelial.

En este trabajo se estudia la expresión de algunas citoqueratinas a nivel de epitelio gingival humano y de ratón.

MATERIAL Y METODO

Para este estudio se utilizaron cinco encías humanas y cinco de ratón. Las encías humanas sanas fueron obtenidas de piezas dentarias de pacientes adultos, con indicación de extracción. Las encías de ratón se obtuvieron de especímenes adultos normales, mantenidos en vivero, bajo condiciones controladas de luz, temperatura y alimentación.

Las muestras se fijaron en formol tamponado al 10%, se postfijaron en Dubosq Brasil y se procesaron por el método histológico corriente que consiste en deshidratación en alcoholes ascendentes, impregnación e inclusión en parafina, cuidando de no exceder los 60°C para no alterar los antígenos del tejido.

Se realizaron cortes seriados de 5 µm, algunos de los cuales se tiñeron con hematoxilina-eosina y azul de Alcián. Otros cortes se sometieron a la técnica de inmunoperoxidasa para identificar citoqueratinas en el epitelio de la mucosa gingival, utilizando los siguientes anticuerpos primarios:

- Anticuerpo monoclonal AE1, en una dilución de 1:200 (Sigma, producto N° C2562). Este anticuerpo es específico para identificar queratinas 1 - 10 - 13 - 16 - 18 - 19.

- Anticuerpos monoclonales antiqueratinas 18 y 19, en una dilución de 1:200 (Sigma, productos N° C7765 y C6930, respectivamente).

Para la técnica de inmunoperoxidasa, se procedió de la siguiente forma:

- Desparafinación de las muestras en baterías de xilol y posterior hidratación con alcoholes descendentes.

- Inhibición de la peroxidasa endógena del tejido con perhidrol al 3% (H₂O₂ al 3%).

- Digestión enzimática (tripsina al 0.1% en cloruro de calcio a pH 7.8).

- Bloqueo con suero de bovino no inmune diluido 1:20 (Dako).

- Incubación con el anticuerpo primario diluido 1:200 para todas las citoqueratinas utilizadas, en cámara húmeda.

- Incubación con el anticuerpo secundario (antisuero biotinilado) diluido 1:400 (Zymed).

- Incubación con estreptavidina-peroxidasa diluida 1:800 (Zymed).

- Revelado con diaminobenzidina (DAB).

- Tinción nuclear de contraste con hematoxilina de Harris.

- Deshidratación, aclaramiento con xilol y montaje con entellán (Merk).

Entre cada paso se hicieron lavados en buffer fosfato (PBS) a pH 7.2, excepto entre el bloqueo con suero no inmune y el anticuerpo primario.

Para asegurar la especificidad de la reacción inmune, se realizaron controles positivos y negativos. Para el control positivo se utilizaron cortes de tejidos que, se conoce, dan positiva la reacción con los anticuerpos primarios usados. Para el control negativo se utilizaron cortes adyacentes a los tratados con el anticuerpo primario y se sometieron a la misma técnica, con la excepción que el anticuerpo primario se reemplazó por suero de ratón no inmune (Dako). En estos casos no se observó reacción positiva.

RESULTADOS

El análisis histológico de las muestras indicó que la mucosa gingival humana está constituida principalmente por un epitelio paraqueratinizado, pero que en algunas zonas puede variar a ortoqueratinizado y hacia la zona del surco gingival pierde la cornificación, pasando a constituir un epitelio no queratinizado (Figs. 1, 2, 3). La mucosa gingival del ratón en cambio, presenta un epitelio queratinizado en toda su extensión, incluyendo parte del surco gingival (Figs. 4 y 5).

Fig. 1. Corte coronal de encía humana libre. Se observa el epitelio paraqueratinizado (puntas de flechas) y no queratinizado (flechas). H&E, azul Alcián. 40 X.

Fig. 2. Encía marginal con epitelio paraqueratinizado. H&E, azul Alcián. 100X.

Fig. 3. Encía humana marginal con epitelio ortoqueratinizado. H&E, azul Alcián. 200 X.

Fig. 4. Encía libre de ratón con epitelio ortoqueratinizado (punta de flecha). Dentina (D). Surco gingival (S). H&E, azul Alcián. 200 X.

Fig. 5. Encía marginal de ratón con epitelio ortoqueratinizado (puntas de flechas). Dentina (D). Surco gingival (S). H&E, azul Alcián. 200 X.

Los resultados obtenidos con el anticuerpo AE1 se resumen en la Tabla I. Este anticuerpo no se expresa en el estrato basal en ninguno de los tipos de epitelio, pero su expresión es intensa en el estrato poliédrico o espinoso, especialmente en las capas celulares inferiores de este estrato, en las distintas variedades del epitelio gingival. El estrato granuloso es fuertemente positivo en el epitelio ortoqueratinizado, lo mismo que el estrato superficial de células aplanadas del epitelio paraqueratinizado (Figs. 6, 7, 8).

Tabla I. Patrón de tinción de las células del epitelio gingival humano con anti-queratina AE1.
	Epitelios estratificados
	Ortoqueratinizado	Paraqueratinizado	No queratinizado
Estrato basal	---	---	---
Estrato poliédrico	+++	+++	++
Células profundas
Estrato poliédrico	+	++	++
Células superficiales
Estrato granuloso	+++
Estrato plano		+++	++
Estrato córneo	+
--- = tinción negativa; + = algunas células positivas y otras negativas
++ = todas las células positivas; +++ = todas las células fuertemente positivas

Fig. 6. Inmunoexpresión de citoqueratina AE1 en epitelio gingival humano paraqueratinizado. Se observa expresión positiva en las células inferiores del estrato poliédrico (puntas de flechas) y en el estrato plano y reacción negativa en el estrato basal. 200 X.

Fig. 7. Inmunoexpresión de citoqueratina AE1 en epitelio gingival humano ortoqueratinizado . Se observa expresión fuertemente positiva en las células inferiores del estrato poliédrico (puntas de flechas) y en el estrato granuloso (flechas) y reacción negativa en el estrato basal. 200 X.

Fig. 8. Inmunoexpresión de citoqueratina AE1 en epitelio gingival humano no queratinizado. La expresión es marcada en el estrato poliédrico (puntas de flechas). 200 X.

Con las citoqueratinas 18 y 19, el resultado fue negativo en todas las células de los distintos tipos epiteliales (Figs. 9 y 10).

Fig. 9. Inmunoexpresión de citoqueratina 18 en epitelio gingival humano paraqueratinizado. La tinción es negativa en todos los estratos celulares. 100 X.

Fig. 10. Inmunoexpresión de citoqueratina 19 en epitelio gingival humano ortoqueratinizado. Se observa tinción negativa en todos los estratos celulares. 200 X.

En el ratón, la expresión de citoqueratinas es similar a la observada en el epitelio ortoqueratinizado de la encía humana, existiendo una fuerte expresión en el estrato espinoso y en el estrato granuloso (Figs. 11 y 12).

Fig. 11. Inmunoexpresión de citoqueratinas AE1 en epitelio gingival de ratón ortoqueratinizado. Se observa tinción fuertemente positiva en el estrato poliédrico (puntas de flechas) y reacción negativa en el estrato basal. 100 X.

Fig. 12. Inmunoexpresión de citoqueratinas AE1 en epitelio gingival de ratón ortoqueratinizado. Se observa tinción fuertemente positiva en el estrato poliédrico (puntas de flechas) y reacción negativa en el estrato basal. 100 X.

Fig. 13. Distribución de citoqueratinas en el epitelio gingival de las diferentes zonas de la encía humana.