Metabolismo

Metabolismo de los glúcidos

La β-galactosidasa, también llamada beta-gal y b-gal, es una enzima que cataliza la hidrólisis de galactósidos a monosacáridos (EC 3.2.1.23). Un galactósido está compuesto por un glicósido que contiene galactosa. Es decir, el hidrógeno del grupo hidroxilo del carbono 1 de la galactosa es sustituido por un resto orgánico. Dependiendo del enlace glicosídico entre la galactosa y el resto orgánico, los galactósidos se clasifican en α-galactósidos o β-galactósidos. El β-galactósido más común es la lactosa, un disacárido entre galactosa y glucosa (β 1,4 Galactosa-Glucosa).La enzima β-galactosidasa de 1024 aminoácidos fue secuenciada por primera vez en 1970 y su estructura fue finalmente definida en 1994. Su estructura consta de un homotetrámero con una simetría 2,2,2. La molécula tiene un peso de 464 kDa. La cadena polipeptídica se dobla sobre sus 5 dominios secuenciales y un segmento extendido en el amino terminal.² El primer dominio tiene una conformación de barril beta tipo rollo de gelatina, el segundo y el cuarto de fibronectina tipo III, el tercero un barril TIM y el quinto un barril beta tipo sándwich.³ El tercer dominio contiene el sitio activo que consiste de dos subunidades del tetrámero.El sitio activo de la β -galactosidasa hidroliza a un disacárido en presencia de iones de potasio monovalentes (K+) e iones de magnesio bivalentes (Mg2+). El enlace glicosídicodel sustrato es clivado por un grupo carboxilo terminal de un ácido glutámico presente en la enzima. Este clivaje se da por adición de moléculas de agua. En los humanos el nucleófilo de la reacción de hidrólisis es Glu-268 a diferencia de Glu-537 que es el nucleófilo en E-Coli.

La producción de b -galactosidasa o lactasa (EC.3.2.1.23), a partir de microorganismos como hongos, bacterias o levaduras utilizando suero lácteo como medio de fermentación , ha despertado gran interés, así como también el uso de esta enzima en la industria de alimentos (1-5). La lactasa causa la hidrólisis de la lactosa, hasta sus componentes principales glucosa y galactosa, produciéndose un producto de mayor dulzor, debido a las propiedades de los monosacáridos formados, lo que permite usar la lactosa como edulcorante. Los jarabes obtenidos de esta hidrólisis han servido de sustitutos del jarabe de maíz o sacarosa en las industrias de repostería, panadería, heladería y otras (6); además se ha comprobado que la adición de lactasa a productos lácteos como leche, yoghurt, crema agria y mantequilla, mejora el sabor sin que ocurra un incremento calórico significativo, incrementa el poder edulcorante, y favorece el consumo humano en individuos con intolerancia a la lactosa (4,6). La hidrólisis enzimática de la lactosa del suero, es una técnica sencilla que permite el aprovechamiento de este subproducto de la industria láctea, el cual se ha convertido en un grave problema de contaminación ambiental, debido a que generalmente se descarga a ríos y desagües (7). Se estima que cada kg de queso producido genera 9 kg de suero y que anualmente se producen a nivel mundial 9.000.000 t de queso; esto representaría aproximadamente 85 millones de t de suero, considerado como producto de desecho (8). En consecuencia la necesidad de reducir esta contaminación, prohibiendo la práctica de verter el suero a ríos y desagües, aunado al alto potencial nutritivo de este subproducto, han conducido a la realización de estudios tecnológicos para un mejor aprovechamiento del mismo, y dada la importancia que tiene la enzima lactasa en la industria de alimentos, en esta investigación se plantea la optimización del proceso de producción de b -galactosidasa de Kluyveromyces lactis crecida en suero de leche desproteinizado, a través de la Metodología de Superficie de Respuesta (MSR).

MATERIALES Y METODOS

Se utilizó el suero proveniente de la Planta de Lácteos de la Facultad de Ciencias Veterinarias UCV, ubicada en la ciudad de Maracay-Edo. Aragua. El cultivo usado en la fermentación fue la levadura Kluyveromyces lactis, cepa N° 30.841, donada por el cepario del Instituto Nacional de Higiene "Rafael Rangel". Las células de esta levadura fueron mantenidas en cuñas de 2% de agar y 1% de extracto de malta a 4ºC, con transferencias mensuales.

Preparación del suero desproteinizado

Para lograr separar las proteínas del suero se aplicó un tratamiento termoácido, el cual consistió en ajustar el pH a 4,6 con ácido acético y posteriormente aplicar calor (90°C por 15 minutos), para así precipitar las proteínas y además pasteurizar el medio. El suero se dejó reposar, luego se realizó una filtración al vacío utilizando papel de filtro (Wathman N°1) y se conservó refrigerado.

Análisis químicos del suero desproteinizado

Al suero desproteinizado se le determinó la humedad, acidez, pH y nitrógeno total, según los métodos descritos en el A.O.A.C (9). La lactosa se determinó mediante el método de Somoghy (10).

Producción de la enzima

.- Suplementación del medio de cultivo:

El suero fue suplementado con la adición de 0,15% de extracto de levadura y 0,1% de (NH₄ )₂ SO₄, según lo recomendado por Sánchez y Castillo (3).

.- Inóculo:

El medio usado para preparar el inóculo fue el suero desproteinizado y suplementado. Se colocaron 140 ml de este suero en fiolas de 500 ml, se le ajustó el pH a 5 y se esterilizó a 120°C x 10 min. Una vez enfriado se le agregó el contenido celular crecido, durante 24 horas a 30˚C en cuña de agar/extracto de malta, arrastrado con 10 ml de caldo extracto de malta; las fiolas se incubaron a 30°C por 18 horas, con agitación, esto garantizó una población microbiana alrededor de 10 ⁷ células/ml.

.- Condiciones del cultivo:

En el proceso de producción de la lactasa, se utilizó un fermentador marca New Brunswick modelo BioFlo 2000 modular con una capacidad de 2 l. Para lo cual 1350 ml de suero desproteinizado y suplementado se esterilizaron a 120°C x 10 min., en el mismo recipiente del fermentador, posteriormente se le agregó 150 ml de inóculo, obteniendo un volumen total de trabajo de 1,5 l. Las variables a considerar fueron: pH, temperatura, velocidad de agitación y tiempo de fermentación a una tasa de aireación de 0,5 vvm. Se utilizó un diseño factorial de dos niveles, para los cuatros factores antes mencionados, es decir un factorial 2⁴ . Con la finalidad de describir la naturaleza de la superficie de respuesta en la región del óptimo, se utilizó un diseño compuesto central ortogonal empleando cinco niveles de cada factor (-a , -1, 0, 1 y a ), como lo describe la literatura revisada (11); el cual básicamente consistió en un diseño factorial 2^k , donde k=4 (2⁴ =16), con ocho puntos estrellas 2k (2x4=8) y seis (6) repeticiones de los puntos centrales (N^o=6), dando un total de treinta (30) tratamientos, los cuales siguieron el orden establecido en la matriz de diseño codificada que se muestra en laTabla 1. En la Tabla 2 se muestran los valores reales de pH, temperatura (°C), velocidad de agitación (r.p.m.) y tiempo de fermentación (horas), para poder establecer las condiciones de trabajo para cada tratamiento, los rangos de las variables empleadas, se establecieron de acuerdo a la literatura revisada siendo los siguientes: temperatura: 27 – 35°C, pH: 4 –7, velocidad de agitación: 100 – 200 r.p.m y tiempo de fermentación: 12 – 24 horas.

TABLA 1

Matriz del Diseño Compuesto Central Ortogonal a utilizar en la optimización del proceso de producción de lactasa por Kluyveromyces lactis en suero desproteinizado

Tratamiento	X1	X2	X3	X4
1	1	1	1	1
2	1	-1	-1	1
3	-1	-1	1	-1
4	-1	-1	1	1
5	-1	1	-1	-1
6	-1	1	-1	1
7	-1	1	1	-1
8	-1	1	1	1
9	1	-1	-1	-1
10	1	-1	-1	1
11	1	-1	1	-1
12	1	-1	1	1
13	1	1	-1	-1
14	1	1	-1	1
15	1	1	1	-1
16	1	1	1	1
17	-a	0	0	0
18	a	0	0	0
19	0	-a	0	0
20	0	a	0	0
21	0	0	-a	0
22	0	0	a	0
23	0	0	0	-a
24	0	0	0	a
25	0	0	0	0
26	0	0	0	0
27	0	0	0	0
28	0	0	0	0
29	0	0	0	0
30	0	0	0	0

X1= Temperatura de fermentación. 1er. Factor

X2= pH. 2do. Factor

X3= Velocidad de agitación del medio. 3er. Factor

X4= Tiempo de fermentación. 4to. Factor.

a = 1,7178

TABLA 2

Tratamientos utilizados en el establecimiento del Diseño Compuesto Central Ortogonal para la optimización del proceso de producción de lactasa por Kluyveromyces lactis en suero desproteinizado

Tratamiento	Temperatura (° C)	pH	Velocidad de agitación (r.p.m)	Tiempo (h)
1	28,7	4,6	121	14,5
2	28,7	4,6	121	21,5
3	28,7	4,6	179	14,5
4	28,7	4,6	179	21,5
5	28,7	6,4	121	14,5
6	28,7	6,4	121	21,5
7	28,7	6,4	179	14,5
8	28,7	6,4	179	21,5
9	33,3	4,6	121	14,5
10	33,3	4,6	121	21,5
11	33,3	4,6	179	14,5
12	33,3	4,6	179	21,5
13	33,3	6,4	121	14,5
14	33,3	6,4	121	21,5
15	33,3	6,4	179	14,5
16	33,3	6,4	179	21,5
17	27,0	5,5	150	18,0
18	35,0	5,5	150	18,0
19	31,0	4,0	150	18,0
20	31,0	7,0	150	18,0
21	31,0	5,5	100	18,0
22	31,0	5,5	200	18,0
23	31,0	5,5	150	12,0
24	31,0	5,5	150	24,0
25	31,0	5,5	150	18,0
26	31,0	5,5	150	18,0
27	31,0	5,5	150	18,0
28	31,0	5,5	150	18,0
29	31,0	5,5	150	18,0
30	31,0	5,5	150	18,0

Ensayo de actividad enzimática y determinación de proteína

Los ensayos de actividad enzimática se realizaron según la metodología indicada por Sánchez y Castillo (3), utilizando ONPG como sustrato. La actividad enzimática fue definida como la cantidad de enzima necesaria para producir un m mol de ONP en 1 min., bajo las condiciones descritas. El contenido proteico del extracto enzimático se llevó a cabo mediante el método colorimétrico de Lowry et al.,(12), utilizando albúmina de suero de bovino.

Extracción de la enzima

Las células cosechadas por centrifugación (10.000 r.p.m por 10 min.) y lavadas con agua destilada, fueron resuspendidas en buffer fosfato de potasio 0,1 M pH 7, suplementado con 0,5 mM MgSO₄ y 0,1 mM MnCl_2; a esta suspensión se le adicionó tolueno al 2% (v/v) como solvente orgánico, durante 16 horas a 37 °C para causar la permeabilización de las células (13).

Purificación de la enzima

Se realizó una purificación parcial de la enzima, como lo describen Goncalves y Castillo (1) una vez incubada la suspensión con tolueno 2% (v/v), ésta se centrifugó a 10.000 r.p.m. x 20 min., descartándose el precipitado. Un volumen igual de acetona se adicionó al sobrenadante a 4°C, el precipitado formado se colectó por centrifugación a 10.000 r.p.m. x 20 min., y luego de la evaporación de la acetona residual fue disuelto en el buffer fosfato de potasio 0,1 M utilizado en la extracción. A esto se le denominó extracto purificado.

Efecto de la temperatura y el pH sobre la enzima

Se estudió el efecto del pH en un rango de 5 a 8 y de la temperatura en un rango de 30 a 60°C, sobre la actividad enzimática, a través de la metodología descrita por Sánchez y Castillo (3), utilizando también ONPG como sustrato.

Análisis estadísticos

La variable respuesta analizada fue la actividad enzimática de los extractos crudos obtenidos en los distintos tratamientos; esta variable se analizó siguiendo los pasos de la Metodología de Superficie de Respuesta:

.-Análisis de varianza:

Se utilizó para establecer si existen diferencias o no entre los tratamientos y también para determinar la variabilidad debida al error experimental.

.-Análisis de la regresión:

Para los efectos lineales, cuadráticos y cruzados de los factores que tuvieron influencia sobre la variable respuesta.

.-Establecimiento del modelo de regresión:

Para establecer el modelo de regresión de la variable respuesta, se consideraron los coeficientes de regresión estimados en el análisis de regresión.

.-Análisis canónico de la superficie de respuesta:

Para caracterizar la superficie en la vecindad inmediata del punto estacionario, es decir determinar si éste es un punto de respuesta máxima, mínima o punto de silla.

.-Análisis de Ridge:

En caso tal que el punto estacionario resultó ser un punto de silla, este análisis permitió estimar los niveles de cada factor para obtener la respuesta óptima.