BIOLOGIA CELULAR

 Microscopio de campo claro

1.1. Introducción
    El microscopio es un instrumento básico para el estudio de la Biología, ya que nos permite percibir detalles de organismos y estructuras que no podrían ser observados directamente, por simple inspección ocular (5).
    Para observar elementos tan pequeños es necesario disponer de lentes de aumento. Estas lentes se conocen desde tiempos de Arquímedes, pero la óptica como disciplina se comenzó a desarrollar en el siglo XIII con el monje franciscano Roger Bacon (6).
La utilidad de cualquier tipo de microscopio, no sólo depende de su capacidad de aumento sino, más importante, de su capacidad para resolver detalles (1).
P    ara el estudio del material biológico se dispone de varios tipos de microscopios, lo cuales se pueden clasificar básicamente de acuerdo al tipo de fuente luminosa que usan, siendo el microscopio óptico de campo claro,  el de uso más generalizado (4).
Este es un microscopio compuesto que utiliza dos sistemas de lentes; el primero produce una imagen amplificada del objeto, y el segundo agranda la imagen formada por el primero (5).

De acuerdo con la radiación que utilizan, se clasifican en:
• Ópticos o luminosos:
     - Campo claro
     - Campo oscuro
     - Contraste de fases
     - Fluorescencia
     - Ultravioleta
• Electrónicos
    - Barrido
    - Transmisión

1.2. Microscopio de campo claro.
   Para formar una imagen a partir de un corte histológico usa luz visible, por esto la muestra debe ser lo bastante fina como para que los haces de luz puedan atravesarla. También se usan métodos de tinción, según las necesidades, con el fin de aumentar los detalles en la imagen (3).
    El campo del microscopio está intensamente iluminado, mientras que los objetos observados aparecen más oscuros. En general con este microscopio se pueden alcanzar los 1000 aumentos, pudiéndose llegar con ciertas modificaciones a 2000 y 3000 aumentos (5).
    El ojo humano no logra distinguir objetos de menos de 50 micras de diámetro ni consigue resolver dos líneas separadas por menos de 100 micras (es decir, las ve como una sola línea) Fig 1 (6).

1.3. Curso de la luz en el microscopio
    El condensador proyecta un cono de luz sobre las células que están siendo examinadas en el microscopio. Después de atravesar a las células, ese haz luminoso, en forma de cono, penetra en el objetivo; el objetivo proyecta una imagen aumentada en el plano focal del ocular, que nuevamente la amplia. Por fin la imagen provista por el ocular puede ser percibida por la retina del ojo como una imagen situada a 25 cm de la lente ocular. La ampliación total dada por un microscopio es igual al aumento del objetivo multiplicado por el aumento del ocular (1).

Figura 1. Mecanismo óptico del microscopio de campo blanco. El lente que se encuentra mas cercano al espécimen se denomina objetivo, tiene una distancia focal corta y, forma una imagen real y aumentada que es el objeto del segundo sistema de lentes denominado ocular . El condensador tiene la función de condensar la luz sobre el espécimen (6).

1.4. Sistema mecánico
    Este sistema sostiene al sistema óptico y aloja los elementos necesarios para la iluminación y enfoque del preparado. (6).
  
- Pie: brinda apoyo y estabilidad al aparato (6).
  - Vástago: soporta la platina, tubo y tornillos de ajuste macro y micrométrico (6).
- Tornillo de Ajuste: provocan el desplazamiento del tubo o la platina en sentido vertical, lo que permite el enfoque (6).

     
Pie y Tornillo de ajuste - Tubo: en su extremo superior se halla el ocular, y en el inferior el objetivo. Se trata de un cilindro metálico cuyo interior se encuentra pintado de negro, lo que evita la reflexión de la luz. Normalmente tiene una longitud de 170 mm (6). 
-  Platina: es una plataforma horizontal sobre la cual se coloca y sujeta el preparado a observar, tiene un orificio central que permite el paso de la luz y un venier que posibilita la relocalización de los detalles de interés. (6)
      Platina -  Subplatina: sostiene al condensador y se ubica por debajo de la platina (6). 
 

1.5. Sistema óptico
Se compone de un sistema óptico de observación y un sistema óptico de iluminación; los cuales constan de:
1.5.1. Sistema óptico de observación
- Objetivo: está formado por un sistema de pequeñas lentes ubicadas muy cercanas una de la otra, la que se halla en el extremo distal del objetivo se denomina lente frontal. Los objetivos pueden ser objetivos a seco (no hay ninguna sustancia interpuesta entre la lente frontal y el preparado), u objetivos de inmersión (entre la lente frontal y el preparado se coloca una sustancia cuyo índice de refracción es muy similar al del vidrio) (6).
 
- Ocular: es un tubo cilíndrico con un diafragma fijo en el centro y una lente en cada extremo, la superior se denomina lente ocular y la inferior lente colectora (6).

  Objetivo Y Ocular

1.5.2. Sistema óptico de iluminación
- Condensador: concentra el haz de luz sobre el plano del objeto que se encuentra en la platina. Debajo de él se encuentra el diafragma iris que regula la cantidad de luz que llega al condensador (6).
- Fuente de Luz: es una lámpara que está ubicada en la parte inferior del aparato, en caso de no poseerla debe ubicarse una fuente de luz externa (lámpara incandescente común) aproximadamente a 30 cm. del espejo (6).

      Condensador y fuente de luz

1.6. Características de los objetivos
• Escala de reproducción: relación lineal que existe entre el tamaño del objeto y su imagen, por ejemplo, 4:1, 40:1, 65:1, etc (6).
• Poder definidor: es la capacidad del objetivo de formar imágenes de contornos nítidos (6).
• Limite de resolución: es la menor distancia que debe existir entre dos objetos para que puedan visualizarse por separado. Fig 2 y 3 (6).
• Poder de resolución: es la capacidad de mostrar la imagen en sus detalles más finos. Está en relación inversa con el límite de resolución (6)
 
Figura 2. Comparación de limites de resolución entre microscopio óptico, electrónico y ojo humano. Las principales unidades de medidas usadas en biología celular son el micrómetro y el nanómetro. El cuadro arriba muestra una equivalencia entre esas unidades, comparándolas también con el milímetro. Las flechas indican los limites aproximados de resolución del ojo humano, del microscopio óptico y del microscopio electrónico. (7)
 
 

Figura 3. Tamaños relativos de células

• Poder de penetración: es la propiedad de permitir la observación simultánea de varios planos del preparado. Es inversamente proporcional a la escala de reproducción o aumento (6).
• Distancia focal: es la distancia de la lente frontal al preparado colocado en la platina, cuando está enfocado. Disminuye cuando aumenta la escala de reproducción del objetivo (6).
• Aumento total: Debemos notar que el ocular también tiene un aumento, por lo tanto el aumento total de la imagen que observamos es el producto entre el aumento del objetivo y el del ocular. Ejemplo: si tenemos colocado el objetivo cuya escala de reproducción es 40:1 y nuestro ocular tiene un aumento de 10x, entonces el aumento total será 40 x 10 = 400 (6).
• Apertura numérica (AN): La apertura numérica, es decir la capacidad de reunión de la luz de objetivo (1), también se encuentra grabada en la manga del lente, siendo de 0,30 para el objetivo de x10, de 0,65 para el de x40 y de 1,30 para el de x100 (4).

1.7. Consideraciones para el uso del microscopio de campo blanco
1.7.1. Imagen
Se debe tomar en consideración que la imagen de un microscopio óptico se encuentra siempre “cabeza abajo” y si se mueve la preparación hacia un lado se observa que se desplaza en sentido opuesto, estas características se encuentran siempre presentes en un microscopio óptico y debemos acostumbrarnos hasta encontrarlo normal (1).

1.7.2. Enfoque.
El enfoque de una preparación debe iniciarse siempre con el objetivo de menor aumento (lupa o 10X) ya que estos quedan siempre mas alejados de la platina; se debe subir la preparación con el tornillo micrométrico hasta el tope siempre mirando por un lado del microscopio para evitar que choque el objetivo con la preparación, después mirando a través del ocular se empieza a bajar lentamente la platina hasta localizar el foco, es decir donde la preparación se observa nítidamente  (1).
La mayor parte de los microscopios actuales están parfocalizados, lo que indica que al quedar en foco la lupa, los demás objetivos quedaran también  enfocados, y solo se requiere de un pequeño ajuste del tornillo micrométrico para ver nítidamente la imagen (1)

1.7.3. Empleo del objetivo de inmersión en aceite (x100)
Se deben utilizar preparaciones teñidas completamente secas.  Para esto se pone una pequeña gota de aceite de inmersión sobre la porción que se va a examinar.  Preferencialmente se deben utilizar aceites sintéticos que no se secan, en vez de aceite de madera de cedro que se seca rápidamente (4).

1.7.4. Determinación de la posición de los objetos observados
El círculo luminoso que se observa a través del ocular se denomina campo microscópico  y los objetos que se observan en el se pueden localizar en relación con las manecillas del reloj (4).

1.7.5. Inversión de las imágenes
Las imágenes son invertidas por los lentes.  De esta manera los objetos que aparecen en el fondo del campo microscópico se encuentran realmente en la parte mas alta y los objetos que se encuentran en el lado izquierdo del campo microscópico se encuentran realmente en el lado derecho (4).

1.8. Preparación de la muestra
 Ya que los microorganismos son transparentes es difícil distinguirlos con este tipo de microscopía y es por lo que se suelen teñir.  (2).

1.8.1. Observación microscópica
Para observar una muestra al microscopio óptico podemos recurrirá a:
- Preparación húmeda. Se realiza colocando una gota de la suspensión de microorganismos entre un porta y un cubreobjetos. Se observa directamente (2).
-  Preparación fijada. Se coloca una suspensión homogénea de microorganismos en una gota de agua sobre el
portaobjetos y se fija (mediante calor o agentes químicos) y después se tiñen mediante diferentes técnicas. Estas preparaciones se observan sin cubreobjetos y, habitualmente, con objetivos de inmersión (2)

1.8.2. Tinciones
Son técnicas que permiten observar microorganismos en función de la capacidad de los mismos para retener (o no) determinadas sustancias colorantes, lo que depende de la carga de la célula y del colorante.

Estos colorantes pueden ser de distintos tipos:
- Catiónicos. Son sustancias que tienen carga positiva. Penetran en el interior de las células y las tiñen. Ejemplos: Azul de metileno, Cristal violeta, Safranina (2).
- Aniónicos. Con carga negativa. No penetran en el interior celular, de modo que no tiñen las células, sino el entorno. En este caso se habla de tinción negativa. Ejemplos: Eosina, Nigrosina (2)
- Liposolubles. Se mezclan con los lípidos celulares y los tiñen.
Ejemplo: Negro sudán  (2).

Por otro lado las tinciones pueden realizarse siguiendo distintos métodos.
- Simples. Utilizan un solo colorante. Se basan en el hecho de que las células tienen una composición química diferente a la de su entorno, de modo que ambos se comportan de forma diferente frente a un  colorante. El colorante tiñe las células (Azul de metileno, Safranina) o no (Nigrosina) (2).
- Diferenciales. Se basan en el hecho de que distintos tipos de células tienen distinta composición química, y por lo tanto reaccionan de forma diferente frente a una tinción, lo que permite clasificar los microorganismos en diferentes grupos, según su capacidad de tinción. En este apartado están dos tinciones de importancia taxonómica y médica: la tinción de Gram y la de ácido-alcohol resistencia (de Ziehl-Neelsen). Estas tinciones utilizan más de un colorante (2).
- Selectivas. Se basan en el hecho de que distintas estructuras celulares tienen distinta composición química, de modo que se tiñen selectivamente con ciertos colorantes. Ej; tinción de esporas, de flagelos, de paredes celulares, de corpúsculos metacromáticos. Pueden utilizarse uno o más colorantes (2).

Imágenes Microscopio de campo claro
 
Figura 4. Células sanguíneas, Células de Traquea y micorrizas VA.

Un microscopio simple (de un lente o varios lentes), es un instrumento que amplifica una imagen y permite la observación de mayores detalles de los posibles a simple vista. El microscopio más simple es una lente de aumento o un par de anteojos.
El poder de resolución del ojo humano es de 0,2 mm es decir que para ver dos objetos separados estos deben estar como mínimo a esa distancia.
El microscopio aumenta la imagen hasta el nivel de la retina, para captar la información.
La resolución depende de la longitud de onda de la fuente luminosa, el espesor del espécimen, la calidad de la fijación y la
intensidad de la coloración.
Teóricamente la máxima resolución que se puede alcanzar es de 0,2 um dada por una luz con longitud de onda de 540 nm, la cual pasa por un filtro verde (muy sensible por el ojo humano) y con objetos condensadores adecuados. El ocular aumenta la imagen producida por el objetivo, pero no puede aumentar la resolución.
Existen distintos microscopios ópticos generales y de investigación que se diferencian en factores tales como la longitud de onda de la iluminación del espécimen, la alteración física de la luz que incide en la muestra y procesos analíticos que se aplican a la imagen final.

2. Tipos de microscopios

Microscopio de campo claro – Es descendiente de los disponibles a partir de 1800.

Compuestos por:
Fuente luminosa que ilumina la muestra
Condensador que enfoca los rayos de luz sobre la muestra
Platina sobre la cual se coloca la muestra
Objetivo que recibe la luz que atravesó la muestra
Ocular que recibe directamente la imagen formada por el objetivo
La muestra a observar debe ser fina para que pueda ser atravesada por la luz. Con este tipo de microscopio se deben utilizar métodos de tinción porque el campo claro de este no produce un nivel útil de contraste.
Microscopio de contraste de fase – Permite observar células sin colorear y resulta especialmente útil para células vivas.
Este aprovecha las pequeñas diferencias de los índices de refracción en las distintas partes de una célula y en distintas partes de una muestra de tejido. La luz que pasa por regiones de mayor índice de refracción experimenta una deflexión y queda fuera de fase con respecto al haz principal de ondas de luz que pasaron la muestra. Aparea otras longitudes de onda fuera de fase por medio de una serie de anillos ópticos del objetivo y del condensador, anula la amplitud de la porción fuera de fase inicial del haz de luz y produce un contraste útil sobre la imagen. Las partes oscuras de la imagen corresponden a las porciones densas del espécimen; las partes claras de la imagen corresponden a porciones menos densas. Por lo tanto estos microscopios se utilizan para observar células vivas, tejidos vivos y cortes semifinos no coloreados.

Dos modificaciones del microscopio de fase son el microscopio de interferencia y el microscopio de interferencia diferencial.
Microscopio de campo oscuro – El objetivo recibe la luz dispersa o refractada por las estructuras del espécimen. Para lograrlo, el microscopio de campo oscuro está equipado con un condensador especial que ilumina la muestra con luz fuerte indirecta. En consecuencia el campo visual se observa como un fondo oscuro sobre el cual aparecen pequeñas partículas brillantes de la muestra que reflejan parte de la luz hacia el objetivo.
El efecto es similar a las partículas de polvo que se ven en el haz de luz emanado de un proyector de diapositivas en una habitación oscura. La luz reflejada por las partículas de polvo llegan hasta la retina del ojo y las hacen visibles.
La resolución de este microscopio no puede ser mejor que la del microscopio de campo oscuro porque emplea la misma fuente de longitud de onda, sin embargo puede detectar partículas individuales más pequeñas en las imágenes de campo oscuro, debido al contraste creado.
Es útil para observar autorradiografías, cristales en la orina y para detectar espiroquetas en particular el Treponema pallidum microorganismo causante de la sífilis.
Microscopio de fluorescencia – Una molécula que fluorece emite luz de longitud de onda que se encuentra dentro del espectro visible, cuando es expuesta a una fuente de luz ultravioleta. Se usa para revelar moléculas fluorescentes naturales, como la vitamina A y algunos neurotransmisores. Al ser escasas las moléculas autofluorecentes su aplicación más difundida es para revelar una fluorescencia agregada, como en la detección de antígenos o anticuerpos en procedimientos de coloración inmunocitoquímica. También se puede inyectar moléculas fluorescentes específicas en un animal o directamente en células y usarlas como marcadores. Estos métodos sirvieron para estudiar uniones intercelulares, trayectorias de las fibras nerviosas en neurobiología y en detección de marcadores del crecimiento fluorescentes en tejidos mineralizados.

Se insertan distintos filtros entre la fuente de luz ultravioleta y la muestra para producir luz monocromática o casi monocromática, o entre el espécimen y el objetivo permitiendo que la estrecha banda de longitudes de onda de fluorescencia llegue hasta el ojo o incida en una emulación fotográfica u otro procedimiento analítico.

Microscopio de barrido confocal – Se usa para estudiar la estructura de los materiales biológicos. Emplea un sistema de iluminación con rayo láser que es muy convergente y, en consecuencia produce un punto de barrido muy poco profundo. La luz que emerge del punto es dirigida a un tubo fotomultiplicador, donde es analizada. Se utiliza un sistema de espejos para mover el rayo láser a través del espécimen, iluminando un solo punto por vez. Se registran los datos de cada punto de la muestra recorrida con este rayo móvil y se guardan en una computadora. Luego se puede llevar la imagen a un monitor de alta resolución. Este método tiene la ventaja de que se pueden tomar imágenes de la muestra en cortes muy finos. Las regiones fuera de foco se restan de la imagen mediante un programa para dar una definición máxima a la imagen.

Es posible también crear imágenes múltiples a diferentes profundidades dentro del espécimen y realizar reconstrucciones tridimensionales.
Microscopio de luz ultravioleta – La imagen en el microscopio de luz ultravioleta depende de la absorción de esa luz por las moléculas de la muestra. La fuente de luz ultravioleta tiene una longitud de onda de 200 nm, por lo tanto puede alcanzar una resolución de 0,1 um. La microscopia ultravioleta no es muy diferente del funcionamiento de un espectrofotómetro pero sus resultados son registrados en fotografías. La muestra no se puede observar directamente a través del ocular porque la luz ultravioleta puede dañar la retina.
El método sirve para detectar ácidos nucleicos, proteínas que contienen determinados aminoácidos. Mediante longitudes de ondas específicas para la iluminación se puede obtener mediciones espectrofotométricas para cuntificar el DNA y el RNA de cada célula.
Microscopio de polarización – Este microscopio es una simple modificación del microscopio óptico, contiene un filtro polarizante llamado polarizador entre la fuente de luz y la muestra y se ubica un segundo polarizador, denominado analizador entre el objetivo y el observador.
Se puede rotar el polarizador y el analizador; la diferencia entre sus ángulos de rotación se usa para determinar el grado en que una estructura afecta el haz de luz polarizada. La capacidad que tiene un cristal o estructura cristalina de rotar el plano de la luz polarizada se denomina birrefringencia.
Exhiben birrefringencia el músculo estriado o esquelético y las inclusiones cristaloides de las células intersticiales testiculares.

3. Microscopia electrónica

Dentro de los microscopios electrónico tenemos el de barrido y el de transmisión.
La ventaja de los microscopios electrónicos frente a los ópticos esta en que la longitud de onda del haz de luz es aproximadamente 1/200, lo cual aumenta la resolución.
Microscopio electrónico de transmisión – La óptica es muy similar al óptico pero se diferencia en que usa un haz de electrones en vez de un haz de luz visible.

Este microscopio se basa en los siguientes principios:
- Una fuente, un filamento de tungsteno calentado que emite electrones (cátodo)

• Un ánodo, hacia el cual son atraídos los electrones
• Una diferencia de potencial entre el cátodo y el ánodo imparte un voltaje de aceleración entre 20.000 y 200.000 voltios a los electrones, que crea la haz
• El haz pasa por una serie de electroimanes que tienen las mismas funciones que las lentes de vidrio de un microscopio óptico

El condensador forma el haz y modifica el diámetro del haz que incide en el plano del espécimen. El haz que atraviesa la muestra se coloca en foco y se aumenta por medio de un objetivo y se aumenta aun más con una o más lentes proyectoras. La imagen final se visualiza sobre una planilla cubierta por fósforo. Las porciones de la muestra que han sido atravesadas por los electrones aparecen brillantes, las porciones que absorvieron o esparcieron los electrones por su densidad inherente o debido al agregado de metales pesados durante la preparación del espécimen aparecen oscuras. Se coloca una placa fotográfica o un detector de video por encima o por debajo de la pantalla del visor, con la finalidad de obtener un registro permanente de la imagen sobre la pantalla.
Las muestras se preparan sobre la misma base que la del microscopio óptico pero requieren métodos más finos.
Los preparados la restricción que tienen es que en cada paso se trabaja con especimenes de magnitud 3-4 órdenes menores o más finos que los utilizados para el microscopio óptico. Debido a la gran resolución de estos microscopios electrónicos la calidad de la fijación, es decir el grado de preservación de la estructura subcelular debe ser la mejor posible.
La preparación de rutina de los especimenes para la microscopia electrónica de transmisión comienza con la fijación con glutaraldehído, seguida de un lavado con un buffer y de una fijación con tetróxido de osmio.
Por lo general, se fijan para el microscopio electrónico de transmisión piezas de tejido no mayores de 1 mm3

El proceso de deshidratación es idéntico al empleado en la microscopia óptica
El tejido incluido en material plástico se secciona por medio de micrótomos especialmente diseñados, que usan cuchillas de diamante.
Debido al limitado poder de penetración de los electrones, el espesor de los cortes preparados para el microscopio electrónico de transmisión varia entre 50 nm y 150 nm. Estos cortes son demasiado finos para poder ser manipulados; se los hace flotar desde el filo de la cuchilla en la superficie de una bandeja llena de líquido, se recuperan y se colocan en rejillas de malla de cobre recubiertas por plástico. Estas rejillas tienen 50-400 orificios por pulgada o hendiduras especiales para observar cortes seriados.
Por lo general, la coloración de los cortes para microscopio electrónico de transmisión se realiza por medio del agregado a la muestra de materiales de elevada densidad, tales como iones de metales pesados. Estos iones de metales pesados se unen a los tejidos durante la fijación o la deshidratación o al sumergir las muestras en soluciones de tales iones después del corte. El teróxido de osmio que se emplea de rutina en el fijador se une a los componentes fosfolipídicos de las membranas, lo cual agraga densidad a la membrana.
A menudo se agrega nitrato de uranilo a las soluciones alcohólicas usadas en la deshidratación, con el fin de agregar densidad a los componentes de las uniones celulares y a otros sitios. La inmersión secuencial en soluciones de acetato de uranilo y citrato de plomo se usa rutinariamente para teñir los cortes antes de observarlos con microscopio electrónico de transmisión.
La congelación-fractura es un método especial de preparación de la muestra para microscopia electrónica de transmisión, de gran importancia en el estudio de membranas.
El material a examinar puede estar fijado o no; en el primer caso se elimina el fijador del tejido por medio de lavados, antes de procesarlo. Se infiltra el tejido con un crioprotector, como el glicerol y se congela rápidamente a unos –160 grados centígrados.
Microscopio electrónico de barrido – Se asemeja más que al microscopio electrónico de transmisión a los tubos de televisión de donde deriva la microscopia electrónica. Para analizar la mayoría de los tejidos se deja la muestra, se deshidrata por desecación de punto crítico, se cubre con una película evaporada de oro-carbón, se monta en un taco de aluminio y se coloca en la cámara de muestras del microscopio. En los tejidos mineralizados es posible eliminar todos los tejidos blandos con una lejía y analizar las características estructurales del mineral.
Se logra el barrido con el mismo tipo de rastreo que explora el haz de electrones a través de la superficie un tubo de televisión. Los electrones reflejados desde la superficie y los electrones forzados hacia el exterior de la superficie son captados por uno o más detectores y reprocesados para formar una imagen tridimensional en un televisión.
Se pueden tomar fotografías para registrar los datos o la imagen en una cinta de video. Se pueden usar otros detectores para medir los rayos X emitidos desde la superficie, la catodoluminiscencia de las moléculas del tejido por debajo de la superficie y los electrones de Auger emitidos en la superficie.
Muchos microscopios combinan las características de un microscopio electrónico de transmisión y de barrido, el cual permite microanálisis por rayos X con sonda electrónica.
Se pueden adosar detectores al microscopio para reunir los rayos X emitidos cuando el haz de bombardea el corte histológico, y mediante analizadores apropiados se construye un mapa que muestra la distribución en los cortes de los elementos que tienen número atómico mayor de 12, en concentración suficiente para producir rayos X en cantidad tal que se pueda analizar.