BIOLOGIA CELULAR

 Microscopia electronica de barrido

     En el microscopio electrónico de barrido, un campo magnetico permite enfocar los rayos catódicos (electrones) y obtener una imagen tridimensional, por el examen de la superficie de las estructuras, permitiendo la observación y la caracterización de materiales orgánicos e inorgánicos, proporciona aumentos de 200.000 diámetros.
        Von Ardenne, en 1.938, construyó el primer Microscopio Electrónico de Barrido (MEB); posteriormente, en Inglaterra, se construyó el primer MEB Ambiental, con el cual se pueden observar muestras hidratadas.Descripción del Equipo
El MEB consta de las siguientes partes:
1. Cañón de electrones (e-).
2. Filamento de tungsteno o de hexaboruro de lantano-LaB₆.
3. Anodo.
4. Columna en vacío.
5. Lentes condensadores (centran y dirigen el rayo de electrones).
6. Lentes Objetivas (controlan la cantidad de electrones del haz).
7. Detectores para colectar y medir electrones (producción de imagen).
8. Bobinas de barrido (obligan al haz a barrer la muestra).
9. Control de aumento.
10. Generador de barrido.
11. Colector de electrones (electrones  se atraen y se aceleran).
12. Escintilador (convierte la energía cinetica de los e- en luz visible).
13. Amplificador.
14. Pantalla (imagen).
15. Bombas de vacío.
Diagrama de funcionamiento
        La muestra es colocada en un pequeño espacio, al cual se le hace vacío después de cerrada la puerta. La puerta tiene tres palancas que el operador usa para: subir y bajar la muestra, rotar la muestra y acercarla o alejarla.
        Un haz delgado de electrones, es producido en la parte superior del microscopio por medio del calentamiento de un filamento metálico (10-30 KV). El rayo de electrones primarios sigue un recorrido a traves de la columna de vacío del microscopio, esto, con el propósito, de evitar la dispersión de los electrones. El trayecto del haz de electrones es enseguida modificado por un conjunto de bobinas deflectoras que lo hacen recorrer la muestra punto por punto y a lo largo de líneas paralelas (barrido), y a su vez atraviesa las lentes condensadoras o electromagneticas que le permiten ser reenfocado o centrado hacia la muestra. Posteriormente, el diámetro del haz de electrones puede ser modificado al pasar por las lentes objetivas que controlan la cantidad de electrones dentro de este. Cuando los electrones primarios golpean la muestra, son emitidos electrones secundarios por el propio especimen.  Estos electrones secundarios son atraídos por un colector donde se aceleran y se dirigen al escintilador, donde la energía cinetica Es convertida en puntos de mayor o de menor luminosidad, es decir, en luz visible. Esta luz es dirigida a un amplificador donde se convierte en senal electrica, la cual pasa a una pantalla de observación donde la imagen  es formada línea por línea y punto por punto. Los circuitos que dirigen las bobinas de barrido (que obligan al haz a barrer la muestra), son las mismas que dirigen la parte de colección de electrones y que producirán la imagen.
Resolución del Equipo
        El MEB tiene una resolución de 10 nm y una profundidad de foco de 10 mm, mucho menor que el microscopio electrónico de transmisión. La ventaja del MEB es que proporciona imágenes tridimensionales, ya que éste específicamente examina la superficie de las esructuras.
Preparación de las muestras
        Se debe tener en cuenta el material a observar y guiarse por parámetros específicos para cada muestra. Los siguientes pasos son utilizados en general  y guían acerca de lo necesario en cada uno.
Limpieza
Reactivo: solución salina
Objetivo: Remoción de contaminantes de la muestra
Comentarios: En muestras como dientes y huesos es necesario limpiar la muestra con una bomba de aire. Para epitielio intestinal se utilizan enzimas (quimiotripsina) que degradan el moco intestinal. En esperma de mamíferos es necesario lavar con solución salina y posteriormente centrifugar suavemente.
Relajación
Reactivo: Cloruro de magnesio, cloretano, hidrato de cloral y anestésicos locales como lidocaína.
Objetivo: Permitir que organismos marinos o de agua fresca, que utilizan el encogimiento y extensión para movilizarse, no se contraigan y pueda observarse toda la superficie de éste.
Comentarios: Se aplica gradualmente hasta que cese el movimiento del organismo.
Fijación
Reactivo: Glutaraldehído, formaldehído, permanganato y acroleína.
Objetivos: Permitir que cese la actividad biológica de la célula y preservar la estructura celular. Mantener la integridad de la superficie. Evitar cambios autolíticos, debido a que al haber remoción del organismo se presnetan cambios en temperatura, pH y concentración de oxígeno y nutrientes.
Comentarios: Se puede utilizar vapor de osmio, específicamente cuando se observan esporas de hongos. Es importante tener en cuenta la concentración del fijador y de la muestra, debido a que diversos estudios muestran que a una mayor concentración de éste, se dificulta la observación de lamuestra.
Deshidratación
Reactivo: Etanol o acetona.
Objetivo: Remover agua de los tejidos
Comentarios: Se utiliza más comúnmente etanol, debido a que la acetona, puede danar el secador en el SPC.
Secado de punto crítico
Reactivo: CO₂ líquido y gaseoso.
Objetivo:  Remoción total del agua de la muestra
Comentarios: Este paso se basa en lo siguiente: el CO₂ a temperatura baja es líquido y a temperatura alta es gaseoso. Cuando la muestra sale deshidratada por el etanol, se coloca en el secador de punto crítico (SPC), allí, la muestra se purga con CO₂ líquido hasta que el etanol haya sido reemplazado, posteriormente se sella la cámara y se calienta hasta que la temperatura llegue a 31ºC, de esta forma el CO₂ líquido se evapora y la muestra queda totalmente seca. Este procedimiento reduce de tamano la muestra.
Montaje de la muestra
Objetivo Utilizado: Porta muestra o stub
Objetivo: Colocar la muestra asegurada para permitir la colocación en el rociador de oro.
Comentarios: Para asegurar la muestra en el stub, se utiliza una cinta doble faz (tejidos) o carbono cemento conductivo CCC (dientes).
Recubrimiento con oro (sputter)
Elementos:  Oro, paladio o carbono
Objetivo: Permitir que el haz de electrones primarios choquen contra la muestra recubierta con un material conductor para que estas sean eléctricamente conductivas.
Comentarios: Este pocedimiento se realiza con un rociador o Sputter coater. Se coloca la muestra en la cámara, se sella y se programa el tiempo de recubrimientoen el cual el oro cae uniformemente, se hace vacío y automáticamente el timer se enciende y la muestra se recubre totalmente según el tiempo programado, aproximadamente son 2 minutos. Cuando el tiempo ha finalizado, lentamente empieza a ingresar aire a la cámara y de esta forma, la muestra está lista para colocarla en el MEB. El stub con la muestra recubierta no se debe tocar  con los dedos, por lo tanto es necesario utilizar pinzas.
Almacenamiento
Objeto utilizado: Cámara libre de humedad
Objetivo: Mantener la muestra totalmente seca para posterior observación.
Aplicaciones

• Obtención de imágenes 3D.
• Caracterización  estructural.
• Estudio de características morfológicas y topográficas.
• Estudio de enfermedades del tallo piloso.
• Estudio de formación de biofilms.
• Interacción de microorganismos con células eucariotas.

Ventajas y Desventajas

• Mayor resolución.
• Mayor numero de señales, mayor información.
• Imágen de detalles profundos de la superficie de la muestra: 3D
• No da información acerca de viabilidad cell.
• Costos
• Destrucción de la muestra: fijación y secado.
• Personal especializado.

Fragmentación celular
    El fraccionamiento subcelular es un conjunto de métodos y técnicas que tienen como objetivo obtener fracciones puras o enriquecidas en un determinado componente celular, ya sea éste un orgánulo (mitocondrias, núcleos, peroxisomas, etc.) una fracción de membrana (membrana total, plasmática, dominio basolateral, dominio apical, etc.), complejos multiproteicos (citoesqueleto de actina, microtúbulos, poros nucleares, etc.).
Fases:

• Preanalítica: Obtención preparación preliminar de la muestra hasta llegar al laboratorio
• Analítica: o de aplicación de procedimientos. Toma y tratamiento de datos, recogida de resultados en un informe
• Postanalítica: Validación técnica del informe analítico.

Todo proceso de fraccionamiento subcelular tiene dos etapas :

• Rotura de las células o tejidos para obtener un lisado celular (o tisular) en el que la fracción deseada se encuentre en condiciones adecuadas para su purificación.
• Separación de la fracción deseada del resto de componentes de la célula o del tejido mediante algún criterio como puede ser una diferencia de densidad (centrifugación en gradientes o centrifugación diferencial), la presencia de algún antígeno (cromatografía de inmunoafinidad, inmunoprecipitación, etc.).

Técnicas de rotura de células y tejidos
    El primer paso en la purificación de la mayoría de las proteínas y estructuras subcelulares es la rotura de los tejidos o de las células para obtener un lisado celular en el que la proteína, el complejo multiproteico o la estructura subcelular se encuentre en condiciones que permitan su aislamiento. Esto se consigue empleando procedimientos mecánicos suaves conocidos generalmente como homogenización. Estos métodos producen la rotura de las membranas celulares, suavemente, con lo que se libera el contenido celular.
    Los procedimientos de homogenización más comunes son :

        La purificación de cada uno de los principales organelos subcelulares representó un gran logro en la Biología celular al hacer posible el estudio detallado de sus estructuras y funciones metabólicas.
        La purificación se inicia con la rotura de la pared celular, de la membrana plasmática, o de ambas. Las células deben estar suspendidas en una solución con pH y concentración de sales apropiada. Normalmente se emplea sacarosa isotónica (0,25%) o una combinación de sales similar a las de la célula.
        El proceso de fraccionamiento consta principalmente de las siguientes etapas:1. HOMOGENIZACION
       Se trata de romper las células con la ayuda de un émbolo rotatorio que se ajusta perfectamente a las gruesas paredes de un tubo de cristal especial, el homogenizador. Células anexas: primero se deben romper conexiones con otras células. Células no anexas: pueden separarse teniendo en cuenta forma, densidad o características que puedan marcarse. Existen dispositivos de homogenización en los que está calibrada la separación entre el émbolo y la pared de cristal para producir homogenizados con un tamaño de partícula determinado.Consiste en el procesamiento del  tejido y posteriormente de las células  con el fin de obtener una mezcla fluida en la cual estén todos los componentes celulares, para lo cual podemos recurrir a diversos métodos físicos.
Homogenizador de Esferas
Fragmentación celular por acción del choque de las esferas de vidrio con las células.

• Tamaño de esferas:
•  0.1 mm: Bacterias, esporas.
•  0.5 mm: Levaduras, micelio, microalgas, células animales no anexas, células tripsinizadas.
•  1.0, 2.5 mm: Cerebro, músculo, piel, hojas.

La cantidad de esferas debe ser al menos el 50% del volumen total de la biomasa-líquido.
  Homogenizador de émbolo y tubo
Potter, Potter-Elvehjem, Dunce, Ten Broeck.
Separación émbolo-pared del tubo calibrada según tamaño de partícula deseado.
Los tejidos deben ser previamente picados y se suspenden en un volumen exceso de medio (4-10 veces). Fraccionamiento de tejidos animales. Preferido en preparación de organelos subcelulares de tejidos frágiles como cerebro e hígado.  (Acción suave). Permite un mejor control de la temperatura generada por la fricción. No es eficiente en la fragmentación de microorganismos
Blenders   (Licuadora)
    Homogenización por uso de cuchillas. Proceso magnificado por uso de solventes orgánicos y/o detergentes. Cuchillas rotan a 6.000 – 50.000 rpm en un contenedor. Las muestras se pueden reducir hasta partículas de 4 micrones (análisis de citometría de flujo). Procesamiento de tejidos animales y vegetales. No adecuado para fraccionamiento de microorganismos. Homogenizados de plantas pueden sufrir oxidación enzimática.  
Homogenizador Rotor/Stator
Molinos de coloides – H. Willems. Homogenización rápida (10-60 seg.) y completa. Mecanismo de turbulencia ligera. Protección de organelos: menor velocidad y tiempo de exposición. Uso: tejidos animales y vegetales. Genera calor a niveles insignificantes. Formación de espuma y aerosoles
1.1. SHOCK OSMOTICO
        La células se hacen estallar al someterlas  a un medio hipotónico, lo cual hace que la membrana no resista la presión osmótica. Puede ocasionar el daño a las membranas de algunas organelas.No se recomienda porque en algunas Organelas se lesiona la membrana. Es utilizado para el aislamiento: Mitocondria y Cromosomas Mitóticos
1.2. MORTERO Y MANO
       Es un método convencional de rompimiento por fricción. Pueden emplearse materiales abrasivos como cuarzo, vidrio molido, arena, o materiales silíceos.  La masa celular contenida en un volumen de buffer se mezcla con un volumen de medio moledor (0.5 – 1). La fricción sobre las células genera calor que puede afectar la actividad que se desea estudiar. Actualmente se dispone de homogenizadores más sofisticados que emplean el mismo principio, pero que permiten controlar el nivel de fricción y la temperatura del proceso, son conocidos como potters. Los principales problemas de esta técnica son: la eficiencia baja cuando se usan pequeñas cantidades de medio moledor ó cuando es baja la concentración celular; la fricción genera calor y pueden presentarse alteración en las proteínas
1.3. SONICACION
       Consiste en la aplicación de ultrasonidos a una suspensión celular. La intensa agitación producida destruye las membranas celulares. Dependiendo de la frecuencia, intensidad y energía aplicada se pueden destruir asimismo las estructuras subcelulares e incluso solubilizar complejos proteicos. Se suele aplicar en frio para evitar el sobrecalentamiento de las muestras que podría provocar la desnaturalización de las proteínas. Se transmite una corriente eléctrica a un sistema mecánico que la convertirá en vibraciones de alta intensidad generándose ondas de ultrasonido que generan millones de  burbujas microscópicas, las cuales se expanden y colapsan contra las células causando la ruptura de su membrana. Este fenómeno llamado cavitación puede incrementarse adicionando al medio finísimas esferas de vidrio.
Ultrasonificación
Generación de intensas ondas sónicas en medio líquido. Se transmite una corriente eléctrica a un sistema mecánico que la convierte en vibraciones de alta intensidad generándo ondas ultrasónicas que forman millones de microburbujas que se expanden y colapsan contra las células: CAVITACIÓN.
Choque de ondas rompe membranas y aún enlaces covalentes. Mayor acción por adición de esferas de vidrio. El Sonicador tiene dos forma de operar, por Pulsos: Las Vibraciones de ultrasonido pueden transmitirse en una solución en un rango de 0,1 a 0,9 pulsos por segundo, permitiendo una adecuada sonicación sin generación importante de calor y Continuo: Puede ser usado de forma contínua por hasta 15 minutos. Con este sistema se puede lograr la ruptura de levaduras entre 3 y 10 minutos o de E.Coli con 40 segundos. Presneta los siguientes inconvenientes: alta generación de calor  de las muestras que se mantienen en congelamiento, los tejidos duros (piel o tendón) se deben macerar previamente; se pueden generar radicales libres, el daño por oxidación de radicales libres puede minimizarse adicionando cisteina, ditiotrteitol o algún otro componente -SH en el medio. Por Radicales Libres: Lesión en membrana celular, aberraciones, cromosómicas menores y cambios de tipo Fisiológicas. Uso en Transferencia de DNA plasmídico en Protoplasmos y células intactas; con expresión temporal de un gen testigo. Flexible: Protoplasmos, Células en Suspención y en fragmentos de tejido con la misma sencillez.
1.4. COMPRESION  - DESCOMPRESION. Picador / prensa de sólidos
        Se emplea la  prensa francesa, consiste en el paso de las células a gran presion por un pequeño orificio a una cámara con presión baja, lo cual ocasiona la ruptura de las células por descompresión.
         La filtración al pasar las células a través de orificios a presión de diámetros reducidos que provocan la rotura de las membranas celulares. Preparación de extractos de tejidos animales. El tejido es prensado por una placa metálica de tamiz mientras rotan cuchillas que barren lentamente sobre la superficie de la placa. Fragmentos resultantes de 0.3 – 0.5 mm. Es paso preliminar para someter a otros tipos de homogenizador.
Compresión / Expansión
“Prensa Francesa”.  (Asociarse a Tec. Congelamiento). Material celular difícil de fragmentar. No se usa con frecuencia. Mecanismo: paso de las células de una cámara con gran presión a otra con presión baja a través de un orificio. Repetidas a Alta Velocidad. Ruptura por descompresión. (Virus, Bacterias). Unidades con capacidad de 1-40 ml. Presión 20.000  - 40.000 libras por pulgada².
1.5. CONGELAMIENTO - DESCONGELAMIENTO
        Requiere de periodos prolongados de tiempo (hasta 36 horas) para el congelamiento y descongelamiento. El líquido al  congelarse a -56° C forma cristales muy finos que rompen la célula cuando esta se descongela rápidamente a 37°C. El líquido al congelarse (-56°C) provoca la formación de cristales muy finos que rompen la célula cuando se descongela rápidamente (37°C).
Tejidos animales y vegetales y masas microbianas pueden congelarse con nitrógeno líquido y molerlos en mortero común. Aparato fracturador: pulverizador de tejidos Bessman. Fragmenta 10 mg –10 g de tejido. Procedimiento largo (36 h).
1.6. Uso de detergentes que solubilicen las membranas celulares.
2. SEPARACION DE LOS ORGANELOS
        La separación puede ser llevada a cabo empleando la centrifugación. Manejando las variables  fuerza centrifuga y tiempo podemos separar primero los organelos de mayor tamaño como el núcleo. En centrifugaciones sucesivas de mayor fuerza gravitacional y mayor tiempo obtendremos las diferentes fracciones de nuestro interés. La  etapa final es la obtención del citosol que  es un líquido complejo el cual contiene los elementos del citoesqueleto yentre el 25 - 50% de las enzimas celulares.
        De acuerdo a la ley de Stokes, tambien podemos separar las organelas de acuerdo a sus densidades relativas con respecto a un gradiente de densidades. En la tabla No 1 se presentan  las densidades de algunas organelas típicas.
DENSIDADES DE ALGUNOS ORGANELOS TIPICOS

COMPONENTE                                                     DENSIDAD  (g/cm³)
RETICULO ENDOPLASMICO RUGOSO                           1,20
VESICULAS DE GOLGI                                                     1,14
MEMBRANA PLASMATICA                                              1,12

3. VERIFICACION DE LA PUREZA DE LOS ORGANELOS SEPARADOS
3.1. MORFOLOGIA
    Se verifica la pureza mediante microscopía electrónica
3.2. MARCADORES ENZIMATICOS:
    Cada organela presenta unas enzimas exclusivas, las cuales pueden ser empleadas como marcadores de su pureza. La tabla nos presenta algunos ejemplos de marcadores enzimaticos de algunos organelos.

ACTIVIDAD ENZIMATICA EN ALGUNOS ORGANELOSORGANELA                         ACTIVIDAD ENZIMATICA
MITOCONDRIAS                    CITOCROMO C
PEROXISOMAS                        CATALASA
LISOSOMAS                      FOSFATASA ALCALINA

3.3. METODOS INMUNOQUIMICOS 

        Se pueden obtener grados máximos de pureza en los organelos y macromoléculas mediante técnicas de separación como  la cromatografía de afinidad.