BIOLOGIA CELULAR

Citometria de Flujo

     La citometria de flujo (CMF) es una técnica de análisis celular multiparametrico  cuyo fundamento se basa en hacer pasar una suspensión de partículas  (generalmente células) alineadas y de una en una por delante de un haz de láser focalizado. La citometría de flujo es una tecnología (proceso) que permite la medida simultánea de múltiples características físicas de una sola célula. Estas medidas son realizadas mientras las células (partículas) pasan en fila, a una velocidad de 500 a 4000 células por segundo, a través del aparato de medida en una corriente de fluido (1).

EL CITOMETRO NECESITA UN SISTEMA COMBINADO DE :

• Fluidos, para introducir y restringir las células para análisis
• Optica , una fuente de excitación y un sistema colección para generar y recoger las señales luminosas. El sistema de excitación consiste en un láser, lentes y prismas para dirigir el rayo. El sistema de colección consiste en espejos ópticos y filtros para encaminar determinadas longitudes de onda hacia detectores ópticos determinados.
• Electrónica, para convertir las señales ópticas en señales electrónicas proporcionales y digitalizarlas para análisis computacional.

SISTEMA HIDRAULICO: Controles neumático y fluidos para establecer un flujo laminar que permita a la suspensión celular atravesar la cámara de flujo.

SISTEMA OPTICO: Láser (Argón con luz monocromática de 488nm , filtros , lentes y detectores.

SISTEMA ELECTROINFORMATICO: Convierte la luz dispersa en señales eléctricas y las procesa para su análisis.Sistema optico

 

El impacto de cada célula con el rayo de luz produce señales que corresponden a diferentes parámetros de la célula y que son recogidos por distintos detectores.
PARAMETROS
Características Morfológicas  de la célula : tamaño y complejidad del citoplasma
Características antigenicas  de la célula : Inmunofenotipo.
PARAMETROS FISICOS

• Su tamaño relativo (forward scatter-FSC)
• Su granularidad relativa o complejidad interna ( side scatter SSC).

FLUORESCENCIA RELATIVA (FL1, FL2, FL3)

• Determinación cuantitativa de características antigénicas, bioquímicas y biofísicas de células individuales (1,2).

OBJETIVOS PRINCIPALES DE
LA CITOMETRIA DE FLUJO

Identificar y enumerar subpoblaciones celulares únicas y definidas.

Seleccionar y separar físicamente subpoblaciones de células deseadas (por deflección electrostática ; esta tecnología de separación se llama "electronic cell sorting")

Medir capacidad funcional de subpoblaciones celulares definidas

COMO SE DETECTAN ESTAS CARACTERISTICAS
        El citómetro de flujo detecta como las células interactúan con un rayo láser en términos de cómo la célula :

desvía la luz incidente (parámetros FSC y SSC)

emite fluorescencia (parámetros FL1. FL2. FL3)(1).

LAS PROPIEDADES DE DISPERSION DE LA LUZ UNA CELULA NOS DA INFORMACION ACERCA DEL TAMAÑO CELULAR Y GRANULARIDADSEÑALES DE DISPERSION
Forward Scatter (FS) :luz dispersada frontalmente  en ángulo cónico pequeño (0-10 grados ) coincidente con luz incidente y es proporcional a tamaño de la partícula que produce la dispersión.

La luz es desviada a bajos ángulos entre 1 y 10 grados

Generalmente proporcional al tamaño celular

Detectada a lo largo del eje del rayo de luz incidente en dirección delantera

Side Scatter (SSC) : luz dispersada lateralmente es proporcional al la complejidad de la estructura celular.

Luz es desviada a altos ángulos

Proporcional a la granularidad de la célula y su complejidad

Detectado a 90 grados del eje de luz incidente.

FLUORESCENCIA
        Un fluorocromo es una  molécula química que absorbe la luz a una determinada longitud de onda (ENERGIA ) energía de excitación y emite a una longitud superior (MENOR ENERGIA)
Interacciona con la luz de excitación procedente de el láser. Se utiliza unido a anticuerpos específicos (monoclonales ) para antígenos de la célula. La cantidad de fluorescencia con la cual una célula se tiñe es proporcional a la cantidad de sitios de unión.
Cómo se obtiene la luz fluorescente.

Unión de sitios específicos con anticuerpos marcados con fluorocromos

El fluorocromo absorbe energía del láser

El fluorocromo libera energía absorbida por :

Vibración y disipación del calor.

Emisión de fotones a una mayor longitud de onda llamada  fluorescencia (1,2,3).

REACTIVOS FLUORESCENTES
Marcadores fluorescentes de unión covalente: Isoticianato de Fluoresceina, Picoeritrina, rodamina, rojo texas, cianinas.
Marcadores fluorescentes de unión no covalente: Hoechst, DAPI, Naranja de acrimina, yoduro de propidio, rh12.
Los marcadores fluorescentes son sensibles al medio ambiente .

Pequeñas moléculas orgánicas (FITC, biotina): unión covalente directa con grupos amino libres en anticuerpos

Proteínas fluorescentes (ficoeritrina, aloficocianina): se unen a anticuerpos a través de algunos reactivos.

REALIZACIÓN DE CITOMETRIA DE FLUJOSe hace en 3 etapas independientes :

Fase pre-citometría: preparación de los reactivos, preparación de las células, diseño del protocolo y coloración de las células con los reactivos fluorescentes.

Fase de citometría de flujo : involucra el procesamiento de las células marcadas y la recolección de los datos para cada una de las medidas (parámetros) realizados en cada célula individual.

Fase de análisis: análisis de los datos recolectados

        La mezcla de células teñidas con diferentes fluorocromos es forzada a pasar a través de una aguja creando una delgada fila de líquido que contiene las células. A medida que cada célula pasa en frente del láser, desvía el rayo incidente y las moléculas teñidas unidas a la célula van a ser excitadas y emiten luz fluorescente. Tubos fotomultiplicadores detectan tanto la luz desviada y las emisiones fluorescentes, la información es digitalizada y procesada por el computador. Los resultados son presentados a manera de histogramas o "dot-plots" (2).APLICACIONES DE LA CITOMETRIA DE FLUJO

• Hematología : tipificacion y conteo de células , reticulocitos y análisis de medula ósea .
• Farmacología :estudios de cinética celular
• Inmunología :subpoblaciones de linfocitos ,tipaje tisular
• Oncología :Diagnostico y pronostico ,monitores de tratamientos
• Microbiología :diagnostico bacteriano y virico ,estudios de sensibilidad a los antibióticos
• Genética : Cariotipo y diagnostico de portador y diagnostico prenatal.

INMUNOTIPIFICACIÓN
         Es el proceso para determinar marcadores expresados en la superficie celular.
Esta detección se hace empleando anticuerpos monoclonales antígeno-específicos marcados con un fluorocromo dirigidos al marcardor que queremos evaluar.
        Para esto, es necesario aislar previamente las células a analizar ( por ejemplo linfocitos, a partir de sangre total, por gradiente de ficoll ). Las células son luego estimuladas a producir los marcadores poniéndolas en contacto con un antígeno capaz de estimular su síntesis.
     Posteriormente estas son incubadas con una sustancia denominada brefeldina A (BFA) cuya función es impedir que las células expulsen las citoquinas que están sintetizando, haciendo entonces que se acumulen en su interior.Después las células son fijadas, permeabilizadas y finalmente marcadas con los anticuerpos específicos. Una vez realizado este último procedimiento, las células están listas para ser leídas en el citómetro (2, 5).ENSAYO DE CAPTURA DE SECRECION
Se ha utilizado para cuantificar la secreción de citoquinas a partir de linfocitos T
El procedimiento utilizado es :

Encapsulación de la célula en una microgota de agarosa con biotina

Incorporación de un anticuerpo dirigido contra la citoquina que queremos detectar

Unión no específica y retención del anticuerpo en la matriz de agarosa

Incorporación de un segundo anticuerpo que reconoce la unión antígeno- anticuerpo ya formada. Este segundo anticuerpo está marcado con un fluorocromo

Las microgotas se analizan en el citómetro, midiendo la fluorescencia emitida por el fluorocromo, que es proporcional a la unión antígeno-anticuerpo (6).

DETERMINACION DEL CONTENIDO CELULAR DE DNA
        Una suspensión de células es coloreada con un colorante fluorescente que se une estequiométricamente con el DNA. La cantidad de colorante unido es entonces proporcional a la cantidad de DNA. Las células coloreadas se introducen entonces en el citómetro y la luz fluorescente emitida es proporcionarle al contenido de DNA de cada célula.
         Este análisis nos da información además sobre la distribución de las célula en las diferentes fases del ciclo celular (G1, S, G2 o M). Sin embargo no es posible diferenciar G2 y M ya que en las dos se encuentra el mismo contenido de DNA. Se han desarrollado modelos matemáticos para establecer el porcentaje de células que se encuentran en cada fase. Esta información puede complementarse utilizando antígenos cuya expresión está restringida a un momento del ciclo celular en particular. Por ejemplo en las fases G1 y S tempranas hay un incremento en la excreción del antígeno celular nuclear proliferante (PCNA) : por otra parte el antígeno Ki-67 es una proteína nuclear que se incrementa linealmente a través de todo el ciclo celular alcanzando la concentración máxima en G2 y M. Al marcar estás proteínas con anticuerpos específicos unidos a un fluorocromo, podemos entonces establecer con mayor precisión la fase del ciclo celular en que se encuentra la célula.
        La medida del contenido de DNA también ha sido utilizada para determinar el grado de aploidía de células malignas y el porcentaje de estas que se encuentran en fase S. Algunos autores sugieren que esta información es útil para conocer el tamaño del tumor, el estado nodal y el estado de expresión de marcadores para ayudar a establecer el pronóstico del tumor (5,7).
APOPTOSIS
         La apoptosis es la muerte celular programada. Hay varias enzimas implicadas en este proceso celular. Dichas enzimas pueden ser determinadas por citometría de flujo al ser unidas a anticuerpos marcados con fluorocromos (por ejemplo la dipeptidilpeptidasa, calpaina, aminopeptidasa y catepsina D , las dos últimas implicadas en el proceso de apoptosis inducido por citoquinas y expresadas en la superficie celular) (7).
FAGOCITOSIS
        Marcando bacterias con un colorante fluorescente, se puede analizar el proceso de facocitosis de estas por parte de macrófagos y neutrófilos (7).
VENTAJAS DE LA CITOMETRIA DE FLUJO

Análisis de un número estadísticamente significativo de células ( 1000 a más de 100.000 células).

Múltiples marcajes de una sola célula.

Análisis de alto numero de partículas en corto tiempo (5.000 eventos /seg. ).

Alta sensibilidad y objetividad.

Medidas separadas de cada célula (no sólo el promedio).

Medidas cuantitativas : discriminación de las células según la cantidad de marcador.

Múltiples parámetros : define subpoblaciones complejas.

Miles de células por segundo (1).

DESVENTAJAS DE LA CITOMETRIA DE FLUJO

Poca información morfológica de la célula

No proporciona información de la localización celular en un tejido

Puede analizar solamente una cantidad limitada de material (10 millones de células / hora)

Necesita suspensión de células individuales (1).

Costos de la tecnología

Método destructivo.

Incapacidad de visualizar las células que se analizan.