| | La clave de la transgénesis, la obtención de un organismo genéticamente modificado, está en extraer genes de interés de un organismo e introducirlos en otro, de modo de obtener un producto con características mejoradas. Pero ¿cómo se hace para "cortar" ADN de un organismo e insertarlo en otro? Los genetistas necesitaban herramientas para hacerlo, y así descubrieron las enzimas de restricción, las “tijeras moleculares” que cortan el ADN. De esta forma, es posible extraerlo del genoma de un organismo. También descubrieron las enzimas ligasas que "pegan" el fragmento de ADN aislado dentro del ADN del nuevo organismo. Ambos tipos de enzimas son esenciales en las técnicas de ingeniería genética (ver Cuadernos Nº 2, 4, 5, 54 y 67).
Las enzimas son proteínas que cumplen una función esencial en el metabolismo celular: son catalizadores biológicos (aceleradores de reacciones químicas) que hacen posible que las reacciones se lleven a cabo en un tiempo adaptado a las necesidades vitales del organismo (ver Cuaderno Nº 30). Entre sus características fundamentales se encuentra la de ser específicas, es decir que cada tipo de enzima actúa sobre un sustrato particular o una secuencia particular de una molécula, y no sobre otra. Esta especificidad enzimática resulta fundamental en la actividad de las enzimas de restricción que cortan secuencias particulares y determinadas del ADN.
Las enzimas de restricción
Las enzimas de restricción son proteínas cuya función es cortar las hebras de ADN. Se podría decir que son “tijeras moleculares” que cortan ADN. Lo hacen en forma específica. Esto significa que cada enzima reconoce un sitio particular del ADN, es decir que reconoce una secuencia particular de nucleótidos. Esa secuencia específica para cada enzima se denomina “sitio de restricción”. Una vez que la enzima reconoce estos sitios, se posiciona sobre la molécula de ADN y corta dentro o en torno de esa secuencia.
Acorde a como realizan el corte, las enzimas se pueden clasificar en:
| • | Enzimas que generan “extremos romos” (parejos) |
| • | Enzimas que generan “extremos cohesivos” (desparejos). Estos extremos “colgantes” de simple cadena pueden pegarse con otros extremos de cadena simple que tengan la secuencia complementaria. Las enzimas encargadas de unir los extremos de ambas cadenas se denominan ligasas. |
Ampliar Imagen
Las enzimas de restricción reconocen secuencias de 4, 6 o más bases y cortan generando extremos romos o extremos cohesivos.
Fuente: http://www.icampus.ucl.ac.be/
Ampliar Imagen
Los extremos, generados en diferentes moléculas de ADN, pueden sellarse con la enzima ADN ligasa y generar así una molécula de ADN nueva, denominada recombinante (ver Cuaderno Nº 4).
El origen de las enzimas de restricciónLas enzimas de restricción, conocidas también como endonucleasas, sólo cortan el ADN si reconocen en su interior una secuencia específica de nucleótidos. Estas enzimas fueron descubiertas en microorganismos. De hecho, se encuentran sólo en organismos procariotas (bacterias). Por esto, se les dio una nomenclatura asociada al organismo de donde provienen. Por ejemplo, las enzimas de restricción que se descubrieron en la bacteria Escherichia coli se denominan Eco. Existen diferentes tipos de enzimas Eco que se diferencian en la secuencia que reconocen y cortan. Para diferenciarlas se les agregan letras y números romanos, por ejemplo: Eco RI (Eco “erre” “uno”). Así, el sitio de restricción para EcoRI es la secuencia GAATTC, como muestra la ilustración anterior. Una vez que la enzima encontró ese sitio en el ADN, se acerca a la hebra de ADN y realiza el corte entre la G y la A. Al investigar otras especies de bacterias se descubrieron cientos de enzimas de restricción distintas y cada una reconoce una región específica.
Estas enzimas fueron descubiertas en la década del ’70 y hasta la fecha existen más de 250 enzimas de restricción. Se cree que la función natural de estas enzimas en las bacterias es protegerlas contra ADN de virus que podrían ingresar en sus células. De esta manera, la bacteria utiliza estas “tijeras moleculares” para cortar en pedacitos el ADN viral que la infecta. El ADN propio de la bacteria no se corta, pues lo tiene “protegido” contra sus propias enzimas de restricción.
Usos de las enzimas de restricción
Las enzimas de restricción tienen diferentes aplicaciones que son de gran importancia en investigaciones en biología molecular y en las técnicas que emplea la biotecnología moderna:
1. Hacer mapa de restricción de un plásmido o bacteriófago. El ADN se corta con varias enzimas de restricción, solas y en parejas, para determinar el número de sitios de corte y sus posiciones relativas en la molécula, el orden y la distancia entre ellos.
2. Fragmentar ADN para separación por electroforesis. Los fragmentos obtenidos después de la actuación de las distintas enzimas de restricción, se pueden separar por tamaños mediante la técnica de electroforesis y así estudiar los distintos fragmentos. Por ejemplo: para la técnica de Southern blotting (ver cuaderno Nº 67) o en las usadas para identificar polimorfismos de ADN en distintos individuos (RFLP, ver cuaderno Nº 69).
3. Generación de fragmentos para ser clonados en los vectores apropiados, y crear ADN recombinante. Se puede cortar una molécula de ADN con una enzima y, con el mismo tipo de enzima, cortar el fragmento de ADN de interés para clonar. Se unen con ligasas estas dos moléculas de ADN, generando así una molécula de ADN recombinante. Este vector recombinante puede usarse para transformar células que expresen el gen de interés clonado (si se usó un vector de expresión con el promotor adecuado) o puede usarse simplemente para tener clonado (“guardado”) ese fragmento de ADN de interés. Por ejemplo: para los proyectos de secuenciación de genomas.
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN.
Las enzimas son proteínas, es decir, cadenas de aminoácidos que llevan a cabo una función catalizadora. Significa esto que son usadas por los seres vivos para llevar a cabo transformaciones químicas dentro o fuera de la célula. La evolución hizo que aparecieran en diferentes especies de bacterias un tipo de enzimas que les permitirían distinguir entre el ADN propio y el extraño. Todas las enzimas llevan a cabo un trabajo notable, tanto por su efectividad como por su especificidad (capacidad para actuar sólo sobre un tipo de reactivo o sustrato), pero la labor que realizan las enzimas de restricción raya la perfección. Las bacterias las utilizan como mecanismo defensivo frente a los virus bacteriófagos, ya que cortan las cadenas de ADN en secuencias de bases nitrogenadas específicas. De esta forma, los genomas víricos son destruidos por algunas bacterias, antes de que comience su expresión (es importante destacar que previamente, estas bacterias protegen su propio ADN metilandolo). Las enzimas de restricción fueron descubiertas en la década de los 50, al comprobar que algunas bacterias resistían victoriosamente el ataque de los fagos, si bien, la importancia del descubrimiento no se valoraría debidamente hasta los años 70, cuando permitieron el arranque de la ingeniería genética.
Dado que algunas enzimas de restricción son capaces de cortar el ADN en secuencias concretas, que generalmente comprenden de 4 a 10 pares de bases, constituyen la herramienta ideal para cortar genes de cara a su posterior utilización como ADN recombinante.
Las enzimas de restricción se clasifican en tres grupos. Los grupos I y III no presentan utilidad como herramienta para la ingeniería genética, ya que realizan cortes en las dos hebras de ADN a distancias variables y no específicas (entre 25 y 7000 pares de bases respecto a la secuencia de reconocimiento). Sin embargo, las enzimas de tipo II son herramientas esenciales para la construcción de ADN recombinante y para el análisis de la estructura del ADN. Estas enzimas localizan y se unen a secuencias específicas de ADN, catalizando cortes en las dos hebras dentro mismo o en una zona próxima a la secuencia de reconocimiento. La longitud de la molécula de ADN es irrelevante, ya que los cortes que son provocados dan lugar siempre a la aparición del mismo conjunto de fragmentos.
Se conocen unas 400 enzimas de restricción de tipo II, con un total de 90 secuencias de reconocimiento diferentes. Las enzimas que, siendo distintas, poseen la misma secuencia diana, reciben el nombre de isoesquizómeros. Cada una de ellas fue localizada en una bacteria en particular, y su nomenclatura refleja su origen. De este modo la enzima HaeII y HaeIII, provienen de Haemophilus aegyptius, MboI y MboII de Moraxella bovis, etc.
Algunos ejemplos de secuencias que reconocen las enzimas de restricción, e indicados en rojo, los puntos de corte:
BamHI 5’-GGATCC-3’ EcoRI 5’-GAATTC-3’
3’-CCTAGG-5’ 3’-CTTAAG-5’
HindIII 5’-AAGCTT-3’ HpaII 5’-CCGG-3’
3’-TTCGAA-5’ 3’-GGCC-5’
XmaI 5’-CCCGGG-3’ TacI 5’-TCGA-3’
3’-GGGCCC-5’ 3’-AGCT-5’
PstI 5’-CTGCAG-3’
3’-GACGTC-5’
Una enzima de restricción típica de tipo II: la EcoRI.
La endonucleasa de restricción EcoRI es muy utilizada. Esta enzima reconoce y corta el ADN siempre que localiza la secuencia de bases 5’-GAATTC-3’, una secuencia palíndroma (como es característico de las enzimas del tipo II). Las secuencias de este tipo tienen la propiedad de que leyendo cualquiera de las dos cadenas en el sentido 5’-3’, se lee la misma de bases nitrogenadas. La enzima EcoRI hidroliza los enlaces fosfodiéster que unen las bases G y A de cada hebra, de este modo los cortes que crea son escalonados y dan lugar a la formación de fragmentos de ADN cuyos extremos tienen una corta región monocatenaria que resultará complementaria a las de los otros fragmentos. Los extremos pueden permanecer asociados por puentes de hidrógeno o desnaturalizarse (según sean las condiciones de salinidad, temperatura, etc.), produciendo entonces segmentos independientes, que se reasocian muy fácilmente, por lo que tales extremos reciben el nombre de extremos cohesivos o extremos “pegajosos”.
De este modo, los fragmentos de ADN obtenidos mediante el uso de EcoRI, podrán ser unidos con toda facilidad, no importando que sean de especies diferentes (por ejemplo, ADN bacteriano y ADN humano). Tal propiedad permite de hecho, la obtención de ADN recombinante.
La enzima EcoRI es una proteína formada por dos cadenas polipeptídicas idénticas, que realizan un corte secuencial del ADN. La enzima interactúa con un total de 10 pares de bases: seis que constituyen la secuencia diana, y cuatro de las regiones adyacentes. Parece ser que los pares de bases adyacentes influyen en la primera hebra que es cortada y sobre la velocidad global del corte que se realiza en la diana. Esto implica que la velocidad de actuación de EcoRI no es uniforme en todas las cadenas de ADN.
Existen otros tipos de enzimas de tipo II que reconocen una secuencia de nucleótidos específica, pero hidrolizan los enlaces fosfodiéster a una cierta distancia de la diana, y la secuencia de reconocimiento no es palindrómica. El resultado final es la formación de fragmentos con extremos protuberantes de cadena sencilla cuya longitud es de un solo nucleótido. Otras, sí reconocen secuencias palindrómicas específicas en el ADN bicatenario, pero cortan el enlace fosfodiéster situado en el centro de la diana, con lo que se originan fragmentos de ADN cuyos extremos están apareados, que reciben el nombre de extremos romos.
DIGESTIÓN con ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
Los sitios de restricción son secuencias específicas de una molécula de DNA que son dianas para el corte por una ENZIMA DE RESTRICCIÓN. En esta figura, una molécula circular de 6,8 kb (un plásmido) tiene dos sitios de reconocimiento para una enzima concreta y es atacada por moléculas de esa enzima. Cada molécula de enzima es capaz de cortar muchas moléculas de plásmido.
El producto de la digestión completa (el corte en ambos sitios o dianas) es una pareja de fragmentos, en este ejemplo con tamaños de 5,5 kb y 1,3 kb.
|
No hay comentarios:
Publicar un comentario