BIOLOGIA CELULAR

Microscopia de contraste de fases e interferencia de Nomarski.

    Las células vivas se pueden observar con nitidez en un microscopio de contraste de fases o de contraste de fases interferencial. La posibilidad de que algunos componentes de la célula puedan perderse o distorsionarse durante la preparación de las muestras no ha dejado de preocupar a los especialistas en microscopia. La única solución a este problema es examinar las células mientras aún están vivas, sin ningún tipo de fijación ni congelación. Para este propósito son útiles microscopios con sistemas ópticos especiales.
    Cuando la luz pasa a través de una célula viva, la fase de la onda luminosa varía en relación al índice de refracción de la célula: la luz que pasa a través de una zona relativamente gruesa o densa de la célula, como por ejemplo el núcleo, se retrasa y su fase queda desplazada de forma correspondiente respecto a la de la luz que ha pasado a través de una región adyacente de citoplasma, más fina. El microscopio de contraste de fases y el microscopio de contraste de fases interferencial aprovechan los efectos de interferencia que se producen cuando se combinan estos dos grupos de ondas, creando de esta forma una imagen de la estructura celular. Ambos tipos de microscopios ópticos se utilizan habitualmente para visualizar células vivas.

• 1930 Labedeff :  Diseña primer microscopio de contraste interferencial.
• 1932 Frits Zernike : Inventa microscopio de contraste de fases.
• 1952 Nomarski : Inventa y patenta el sistema de contraste Interferencial que lleva su nombre.
• 1953 Premio Nobel de Física otorgado a Zernike.

Objetivo
    La microscopia de contraste de fases y la del microscopio de interferencia nos dan la posibilidad de observar células vivas y sin ninguna preparación , ya que al realizar otros procedimientos existe la posibilidad de que algunos de sus componentes puedan perderse o distorsionarse por métodos como la fijación, coloración, congelación, y otros, asi, estos instrumentos ópticos ayudan a resolver el problema.Principio de la microscopia de contraste
    Las células vivas son transparentes a la luz visible, por lo tanto los rayos de luz pasan a través sin sufrir pérdidas en intensidad.
    La luz transmitida a través de las células vivientes, sin embargo, encuentra a su paso, regiones de índices de refracción diferentes, y diferentes grosores y/o densidades, lo que es capaz de alterar su velocidad y su dirección. En la Figura 1 se da la representación esquemática en donde dos regiones adyacentes de una misma célula, A y B, de un diferente grosor, t₁ y t₂ y con diferentes índices de refracción, n₁ y n₂, son atravesadas por un rayo luminoso. Las variaciones en grosor e índices de refracción son capaces de producir una diferencia en el curso óptico de la luz transmitida por las dos regiones. En este caso específico, le toma más tiempo pasar a la luz a través de la fracción B, cuyo índice de refracción es mayor (n₂) y por lo tanto esta retrasada la onda del rayo en velocidad con respecto al que es capaz de atravesar la porción A, cuyo índice de refracción es más bajo.
    Si la diferencia de los índices de refracción es pequeña, la magnitud del cambio de fase inducido igualmente es muy pequeña y se mide en términos de longitudes de onda (l). Así, en la representación de la Figura 1, el rayo que pasa a través de la parte B se muestra retrasado 1/4 de longitud de onda ( l/4)  y emerge fuera de fase. con respecto a la transmisión que nos muestra la parte A.
Diseño del instrumento óptico
    El sistema óptico del microscopio de contraste de fases difiere del microscopio ordinario (de luz) solamente en la adición de un diafragma anular colocado debajo de la platina para iluminar el objeto con un cono de luz estrecho y una placa de difracción montada en el objetivo, un diagrama representado en la Figura 2, muestra el diseño de un microscopio de contraste de fase y el curso que siguen los rayos que pasan a través de una estructura celular.
    La fase relativa de luz desviada, saldra 1/4 de longitud de onda retrasado, sí es capturada y cambiada con la introducción de un material retrasador de fase, en aquella parte de la placa de difracción que sea cubierta por cualquiera de los dos rayos, aumentando aún más, otro 1/4 de longitud de onda y logrando retrasar en rayo luminoso en total 1/2 longitud de onda, con lo que se logra que este rayo quede totalmente fuera de fase con respecto a la luz no desviada.
    Cuando la diferencia se presenta es por que los índices de refracción son diferentes y el microscopio de contraste de fase transforma estas variaciones  en brillo o intensidad. Las estructuras celulares presentan muchas irregularidades y son objetos ópticamente no homogéneos; así, la luz que "choca" con el objeto se presenta desviada.
  
Contraste de fase oscuro o positivo: cuando los rayos de luz, la desviada y la no desviada tienden a cancelarse creando una interferencia destructiva y hacer que el objeto aparezca mucho más oscuro que los alrededores.    Contraste de fase brillante o negativo: se presenta cuando retrasamos la luz no desviada y la hacemos 1/4 de longitud de onda menor, lo que hace que salga al tiempo con la luz desviada, que tiene un retraso de 1/4 de longitud de onda, logrando de esta manera que salgan al mismo tiempo y se recombinen para dar brillo, creando una interferencia constructiva; aumentando en esta forma el objeto mientras su contorno permanece con menos intensidad.
http://micro.magnet.fsu.edu/primer/techniques/phasecontrast/phase.htmlMicroscopio de interferencia
        La microscopia de interferencia o técnica DIC (Diffential-Interference Contrast) Nomarski, permite la visualización de especímenes mucho más densos gracias a que la imagen proyectada es tridimensional. Los principios ópticos y la operación del DIC, son bien diferentes a los de microscopia de contraste y su operación es compleja.
        Como los cambios de fase producidos por las estructuras celulares son muy pequeños y por lo general de fracciones de longitud de onda, para poder medir este cambio con precisión es necesario separar por completo la luz que se transmite directamente de la desviada por el objeto, tal como lo hace el microscopio de interferencia.
Nomarski differential interference contrast microscopy. 
Fundamentalmente, la luz que se emplea en este caso es polarizada (blanca o monocromática), o sea que tiene la propiedad de concentrar los rayos dispersos en uno solo y se adicionan a los lentes objetivos cuatro componentes ópticos: Polarizador, prisma DIC, señalador DIC y un analizador.
        El objeto espécimen que se encuentra en fase toma direcciones diferentes de acuerdo con los valores de grosor e índices de refracción que presente. El prisma (birrefringente) situado sobre la parte posterior del plano focal del objetivo es usado para recombinar las dos ondas en un solo rayo.
        El objeto atravesado por los dos rayos vuelve a otro prisma (Wollaston) que es el que en realidad crea la interferencia (destructiva o constructiva), así el plano polarizado es recapturado por un analizador, que transforma esto en ondas de vibración de la misma longitud y habilita la interferencia; como respuesta a estas dos últimas acciones tenemos que diferentes regiones del objeto estudiado apareceran con más brillo o menos brillo sobre un fondo oscuro.
        Los espacios laterales de las dos ondas se miden en términos de micrómetros y no se exceden en el tamaño de la resolución perceptible al ojo humano, logrando asi que no se presente una doble imagen al observador.
        En esta microscopia incluir el tipo Nomarski (prisma), lo que obtendremos será una apariencia seudo tridimensional del objeto.
Aplicaciones
        Una de las grandes ventajas del microscopio de contraste de fases, del microscopio de contraste de fases interferencial y del microscopio de campo oscuro estriba en que los tres permiten observar las células en acción y estudiar los movimientos implicados en procesos como la mitosis o la migración celular. Puesto que muchos movimientos son demasiado lentos para ser observados a tiempo real, normalmente resulta útil hacer películas o vídeos por el sistema de aceleración de movimiento (microcinematografía). En esto casos, se toman fotografías sucesivas, separadas por breves períodos de tiempo, de modo que cuando la película o video registrados se proyectan a la velocidad normal los acontecimientos aparecen muy acelerados.
         Esta técnica microscópica se usa para medir  índice de refracción y concentración de sólidos de las estructuras celulares utilizando un metodo de refractometría por inmersión, así se sumergen las células en una solución isotónica cuyo índice de refracción puede variarse.
        Esta refractometría se ha empleado para ser medidos en procesos como la división celular y el desarrollo de esporas fungicas. Igualmente es útil para determinar masa seca y espesor de las estructuras celulares.
2. Microscopio de interferencia diferencial de Nomarski
2.1. Fundamento
    La posibilidad de que algunos de los componentes celulares se distorsionen en el momento del corte y preparación, ha conducido a los científicos a crear microscopios con los cuales se pueda observar células vivas sin ningún tipo de fijación ni de congelación; para este propósito se utilizan sistemas ópticos especiales (1).
C    uando la luz pasa a través de una célula viva, la fase de la onda luminosa varía con relación al índice de refracción de la célula; creándose una interferencia, que retrasa la onda luminosa cuando atraviesa una zona relativamente densa; la microscopia de interferencia diferencial de Nomarski, aprovecha estos efectos de interferencia, para crear una imagen de la estructura celular viva, nítida y tridimensional (1).
    Existen en principio tres tipos de microscopios de interferencias: los microscopios de interferencia de longitud desdoblada, los de dos ondas y los de ondas múltiples. Los de una sola onda, generalmente se denominan microscopios de contraste de fases.  Los de dos ondas, son los auténticos microscopios de interferencia. En el  sistema de iluminación, sistemas ópticos diversos, desdoblan el rayo incidente en haces próximos unos del otro en forma variable según lo desee el operador; un segundo sistema óptico, simétrico al primero, pero situado detrás del objetivo, recompone los dos haces haciéndolos interferir para construir la imagen. Los de ondas múltiples, no son utilizados en microscopia biológica sino en metalografía, para medida de la profundidad de las estructuras (3).
2.2. Partes del microscopio de interferencia diferencial de Nomarski
 Los componentes básicos del microscopio de interferencia diferencial de Nomarski son iguales al microscopio óptico, difiriendo en los sistemas que transmiten el rayo de luz incidente  (3); estos son:

• Filtro polarizador plano: polariza el rayo de luz incidente que proviene de la lámpara en uno solo y con una misma longitud.
• Prismas de Nomarski modificado por Wollaston: son dos, uno ubicado dentro del condensador birrefringente que genera dos rayos de luz paralelos formado un ángulo de 90?; el segundo se ubica en la parte posterior del objetivo, es ajustable y en él convergen los dos rayos de luz generados por el prisma inferior para que se recompongan.
• Filtro polarizador o analizador: se ubica en la parte superior de los objetivos y del prisma superior y su función es recombinar los rayos de luz, para producir la imagen seudo-tridimensional  observada a través del ocular.

2.3. Principio óptico del microscopio de interferencia diferencial de Nomarski
        La microscopia de contraste de interferencia diferencial de Nomarski usa la combinación de un sistema de luz polarizado y dos rayos divididos para crear fases de diferencias en la muestra. Esto provee una imagen tridimensional de la muestra sin los halos que rodean a la célula en las imágenes generadas en los microscopios de fase de contraste (2).
    El principio del sistema es el siguiente: se utiliza luz blanca polarizada por el filtro plano, este rayo de luz monocromático incide en el condensador completamente abierto y el prisma de Nomarski birrefringente que se encuentra dentro de él, genera dos rayos de luz paralelos, uno incide sobre la muestra a analizar y el segundo pasa en forma paralela sobre la muestra.
Ocurre una diferencia de la trayectoria local del rayo que atraviesa el espécimen causado por el índice de refracción y de grosor, creando una fase distorsionada del rayo incidente que se representa por el desplazamiento del mismo; luego estos rayos atraviesan los lentes del objetivo y también al segundo prisma de Nomarski, allí ubicado, en diferentes porciones, debido a la ruta desigual en la trayectoria óptica con la cual inciden en él; se forma una imagen doble de la muestra lateral y longitudinalmente. Al atravesar estos rayos polarizados y aún paralelos, el filtro analizador los transforma a un mismo plano de vibración, es aquí en donde ocurre la onda de interferencia constructiva o destructiva, que es ocasionada por las diferencias en la trayectoria óptica dentro de la muestra y se manifiestan al observarse en la imagen áreas brillantes y opacas o áreas claras u oscuras. En donde no ocurre la interacción entre el par de rayos, se produce un fondo gris uniforme.
     Los espacios laterales de las dos ondas se miden en términos de micrómetros y no se exceden en el tamaño de la resolución perceptible al ojo humano, logrando así que no se presente una doble imagen al observador, sino una apariencia seudo-tridimensional del objeto estudiado sobre un fondo uniforme.
2.4. Utilidades del microscopio de interferencia diferencial de Nomarski
 El uso de este microscopio hace posible determinar el índice de refracción, la concentración de sólidos, la masa seca y el espesor de las estructuras celulares y estos
cambios han sido estudiados en los procesos como la mitosis o la migración celular; unido a  un método de refractometría por inmersión4.
2.5. Ventajas

• Produce una imagen brillante contra un fondo oscuro sin halos de difracción de una célula viva.
• Determinación del índice de refracción
• Determinación de sólidos, masa seca y espesor de  las estructuras celulares

2.6. Desventajas

• Alto costo del equipo por los diferentes aditamentos utilizados en el microscopio
• Costo alto y mantenimiento cuidadoso  de la muestra de células  vivas
• La microcinematografía requerida para mirar los procesos que realiza la célula in vivo requiere de equipos especiales y personal entrenado.

Microscopio de campo oscuro.    El microscopio de campo oscuro se encuentra catalogado entre los microscopios ópticos.
Desde muchos años atrás el microscopio óptico posibilito el descubrimiento de las células y la elaboración de la teoría de que todos los seres vivos están constituidos por células (1).
    El microscopio òptico se compone de dos partes principalmente:

1. Parte Mecánica: Sirve de soporte.
2. Parte Óptica: constituida por tres sistemas de lentes.
* Condensador.
* Objetivo
* Ocular

    El condensador del microscopio óptico convencional tiene como finalidad proyectar un cono de luz sobre los elementos que están siendo analizados en el microscopio. Después de atravesar el elemento, ese haz luminoso en forma de cono penetra en el objetivo, proyectando una imagen aumentada en el plano focal del ocular ,que nuevamente la amplia  y es recibida por la retina como una imagen situada a 25 cm de la lente ocular (1).    El microscopio de campo oscuro esta constituido por un microscopio óptico al cual se le acondiciona un condensador especial, este tiene como fin producir una disfracen de los rayos luminosos enviándolos lateralmente sobre el objeto en forma de un cono luminosos, y de esta forma tampoco penetran directamente al objetivo (2).
Existen dos clases de condensador de campo oscuro:
* Cardiode
* Paraboloide.
    Ambos son utilizados con el mismo fin, pero el cardiode tiene mayor aplicabilidad en la investigación con Treponemas (2).
    Para que el efecto de campo oscuro se logre , la apertura numérica del condensador debe ser mayor que la de el objetivo, lo cual ocurre con los objetivos de pequeño y gran aumento no así con los de inmersión los cuales deberán adicionarse de un diagrama de suspensión para la reducir la apertura numérica (2).
1.2.1. RESOLUCIÓN DE MICROSCOPIA EN CAMPO OSCURO
    Se llama poder de resolución de un sistema óptico a la capacidad de separar detalles y es expresado por el limite de resolución que es la menor distancia que existe entre dos puntos para que estos aparezcan individualizados.
Lo que determina la riqueza del detalle de la imagen provista por un sistema óptico es su limite de resolución y no su poder de aumentar el tamaño de los objetos (1).
    El limite de resolución depende de la apertura numérica (AN) del objetivo y de la longitud de onda de la luz utilizada (1).
En la microscopia de campo oscuro la AN no debe ser superior a 1.0 ya que el condensador debe tener siempre una apertura numérica superior a este valor.  El limite de resolución del objetivo esta dado por la siguiente formula: (1)
                              LR  =  k   x    Long. onda
                                                  AN
* k =  Constante ( 0.61)
* Log. onda =  0.55    Se toma la longitud de onda de la franja verde - amarilla
   por ser el ojo humano mas sensible a estos colores que a otros.
* AN = Apertura numérica no superior a 1.0
1.2.2. MÉTODOS PARA OBSERVACIÓN EN FONDO OSCURO
    Existen diferentes métodos para observar un objeto sobre un fondo oscuro , es decir, utilizando únicamente la luz difractada por él.
1.2.2.1. OBSERVACIÓN INCIDENTE O POR REFLEXIÓN
    La observación por reflexión con iluminación oblicua o anular es la mas frecuentemente utilizada con los microscopios estereoscopios o lupas binoculares. Generalmente no nos damos cuenta de que observamos en fondo oscuro cuando el material ocupa todo el campo visual (3).
1.2.2.2. OBSERVACIÓN POR TRANSMISIÓN  ( Fondo Negro Central)
    La observación por transmisión con una pantalla central necesita la utilización de un objetivo con pantalla interna de Spierer; con una pantalla anular , la de Wilska: anoptral, versión original y no la fabricada industrialmente que es un contraste de fase negativa a fuerte absorción (3).
1.2.2.3. OBSERVACIÓN POR TRANSMISIÓN  ( Fondo negro Anular)
    La observación con  iluminación anular de abertura superior a la del objetivo, es la única que, en la practica corriente , se denomina campo oscuro. Debe indicarse que difícilmente puede utilizarse objetivos de gran aumento , de apertura numérica superior a 1.0. dado que el condensador debe presentar una abertura superior a esta. Debe entonces practicarse la inmersión,  evitando las burbujas de aire (3).
1.2.2.4. OBSERVACIÓN BIRREFRINGENTE ( Polarización)
    La observación de un objeto birrefringente entre nicoles cruzados da una imagen sobre fondo negro de naturaleza muy particular (3).
1.2.2.5. OBSERVACIÓN HAZ PERPENDICULAR (Fondo Negro ultramicrosopico)
     La observación con un haz perpendicular a la dirección de la observación según Ziedentopf y Szimondy da informaciones sobre la orientación de las partículas observadas (3).
Accesorios de campo oscuro
 Usados principalmente para especimenes no coloreados que son semitransparentes o transparentes.
 

1.2.3. NATURALEZA Y ESTRUCTURA DE LA IMAGEN EN FONDO OSCURO
     Las imágenes en autentico fondo negro son remarcables por un efecto de borde ,con numerosas franjas de difracciòn muy brillantes si le objeto es refringente. Los planos ,en el centro de una estructura parecen ópticamente vacíos . es por ello que deben adoptarsen grandes precauciones en el momento de interpretar las imágenes . Dado que la imagen solo se forma con las luz difractada, siempre más débil que la luz directa deben formarsen fuentes lumìnicas muy intensas, lo que no siempre es fácil sobre todo cuando los objetos son vivos y, por consiguiente, sensibles a fuertes iluminaciones (3).
1.2.4. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA Y PROCEDIMIENTO DE LECTURA.
    El material a estudio se emulsiona sobre un porta-objetos sobre el cual se coloca una gota de solución salina, se cubre con una laminilla y se monta sobre la platina , se baja el condensador de campo oscuro y se corre con el carro de la platina la preparación de forma tal que al subir completamente el condensador la cara superior de su lente quede cubierta por su preparación solamente en su mitad posterior.(2)
    Sobre la parte descubierta del lente se coloca aceite de inmersión en cantidad adecuada; este por capilaridad se extiende entre la cara inferior del portaobjetos y la superior del lente del condensador. Se centra la preparación y se observa con objetivo de pequeño aumento colocando el foco luminoso en la mitad del campo mediante los tornillos de centraje del condensador, luego se observa el campo microscópico con el objetivo de gran aumento, esto permite conocer el estado del microscopio al observar los treponemas bucales (2).
1.2.5. VENTAJAS

* Permite ver partículas dipersas en un medio homogéneo.
* Hace posible la observación del movimiento Browniano de las partículas.
* Se puede utilizar para la observación de preparaciones sin colorear.
* Visualiza los bordes destacados delas muestras.
* Técnica valiosa para observar microorganismos de tipo Treponema pallidum, espiroquetas con diámetros superior a 0.2 um.

1.2.6. DESVENTAJAS

* Inadecuada preparación de la muestra.
* Difícil acceso al microscopio que posea el condensador especial por su alto costo.
* No deja visualizar estructuras celulares especificas, solo bordes de células o    partículas.