BIOLOGIA CELULAR

Microscopia de Barrido Confocal

1.1.1.3.1. Historia
     En 1957 Marvin Minski padre de la inteligencia artificial estudiando el sistema nervioso pensó que si el pudiera verlo en sus diferentes niveles podría entender como funcionaban los circuitos neuronales, entonces fue así como desarrolló esta técnica llamada por el microscopio de barrido por etapas, de doble enfoque” (1).
    Marvin Minsky en los años cincuenta construyó y patentó un microscopio de barrido por etapas de doble enfoque que permitía observar con claridad capas sucesivas de una muestra  sin tener que rebanar el espécimen en finos cortes.  Treinta años después su método es llamado microscopia de barrido confocal, proceso de microscopia óptica más notable en nuestro siglo (1).
    El microscopio de barrido confocal combina el microscopio de fluorescencia con imagen electrónica y puntos de luz suministrados por láser dirigido al espécimen en particular para obtener imágenes tridimensionales (2).
     En los microscopios ópticos cuando el objetivo enfoca luz tomada de planos por encima y por debajo de la superficie que se observa, la imagen se hace rápidamente borrosa, entonces, Minski pensó que lo ideal seria recoger la luz reflejada del plano de interés solamente, pero sin embargo los tejidos ubicados por encima y por debajo de ese plano también refleja luz mostrando imágenes borrosas. La dispersión disminuye el contraste y se produce cuando la luz incide sobre las partículas y estas la reflejan a otras partículas adyacentes hasta alcanzar la superficie detectora.
     Entonces Minski hizo pasar la luz de iluminación a través de un objetivo pinhole, que enfoca los rayos garantizando un punto de luz nítido e intenso sobre una porción mínima de la muestra a la profundidad deseada, así garantizaba que esa zona sería la más intensamente iluminada y en consecuencia la que más luz reflejaba.
     Sin embargo de esta manera no garantizaba que la luz devuelta por los tejidos que estaban por encima y por debajo del punto que él quería observar no llegaran a la superficie del detector. Entonces realizó un segundo ajuste, impidiendo también que la luz que el tejido encima y debajo del plano focal reflejaba alcanzara la superficie receptora, por medio de una mascara con una apertura pequeña, de modo que solo la luz de regreso reflejada por el plano focal pasara a través de el orificio hasta la superficie detectora (1).1.1.1.3.2. Componentes
 En la figura se observa el microscopio confocal con sus componentes fundamentales.

1.1.1.3.2.1. Fuente luminosa.
 Luz amplificada por emisión estimulada de radiación, Láser (Light amplification by stimulated emission of radiation).
1.1.1.3.2.2 . Espejo dicroico.
 Refleja totalmente la luz que incide con un ángulo de cerca de 45°. El termino dicroico proviene de dicroísmo del griego dichromatismós y es la propiedad de presentar de manera alternativa dos coloraciones según la dirección de los rayos de luz incidentes.
1.1.1.3.2.3. Ranura detectora Pinhole.
 Esta ranura sólo permite el paso de la luz reflejada por el plano focal.
1.1.1.3.2.4. Lente objetivo.
 Permite enfocar el rayo de luz reflejado por el espejo dicroico hacia el plano focal de la muestra.
1.1.1.3.2.5. Detector.
 Recibe el haz de luz y genera una imagen.
1.1.1.3.3. Principios de Funcionamiento.
     Debido a que la cantidad de luz incidente sobre la muestra es tan pequeña, es necesario usar fuentes poderosas. La fuente de luz es un rayo láser que se hace pasar a través del pinhole, este haz de luz pasa a través del espejo, como se observa en la figura 1, posteriormente el haz pasa a través del lente objetivo el cual lo enfoca sobre la muestra. La luz emitida por la muestra es recibida por el lente objetivo y reflejada por el espejo dicroico que refleja totalmente la luz que llega en un ángulo de 45°. Esta luz pasa a través de la apertura pinhole que no permite el paso de la fluorescencia originada por los planos fuera de foco. Entonces sólo la luz del plano focal llega al detector. Inicialmente este tipo de técnica permitía observar claramente un sólo punto por lo cual era necesario hacer un barrido de la muestra, que requería un mayor tiempo para obtener una imagen completa.Para acelerar la velocidad de obtención de la imagen algunos microscopios desplazan el haz por medios de espejos oscilantes, que obligan a que la luz  que incide en ellos fluya rápidamente a través de la muestra (5,6). Estos espejos permiten construir la imagen en menos de 1 segundo. Otros sistemas usan rendijas que aceleran el proceso barriendo líneas en lugar de puntos. Actualmente estos microscopios se complementan con el procesamiento digital de imagenes dando como resultado la construcción tridimensional de las muestras (1).
1.1.1.3.4. Preparación de la Muestra.
    La preparación de las muestras varia según los procedimientos y las estructuras que se deseen visualizar.  Por ejemplo:   Células HeLa  se tienen en medio de cultivo y son fijadas con glutaraldehido y PBS (solución buffer de fosfatos) y MgSO4.  Luego son lavadas con PBS y tratadas con boro hídrico, Triton X-100 en PBS. Se colocan luego los anticuerpos monoclonales de antitubulina y FITC y finalmente son montadas en glicerol, para ser observadas al microscopio confocal observando imágenes nítidas y detalladas de los microtubulos.   Los huevos de Psammechinus miliaris fertilizados son colocados en glicerol al 40% y son colocados en laminas cubiertas con poli-L-lisina, luego fijadas con metanol y tratadas con anticuerpos antitubulina que diferencia los centros mitoticos periféricos. Las células de una línea celular de plasmacitoma son fijadas al 3.5% de formaldehído permeabilizado con saponina y tratado con anticuerpos purificados contra endoplasmina. Las glándulas salivares de Drosopila; se realiza disección de la larva y se colocan en buffer A y cromomicina A3 que es un fluorocromo especifico del DNA así se observa el núcleo.  Los embriones de nematodos se colocan en láminas recubiertas con poli-L-lisina congeladas en hielo seco, fijados con metanol y luego tratados con anticuerpos antitubulina y FITC (6).Depende de los procedimientos y las estructuras que se deseen visualizar (4). Sin embargo, la preparación de las muestras es igual a la utilizada para microscopía de fluorescencia convencional y/o citometría de flujo, en cuanto a los métodos de fijación y la tinción o marcaje. Es importante tener en cuenta algunos aspectos (6).
1.1.1.3.4.1. Fijación.
 Cuando es necesaria se deben respetar los lugares de reconocimiento del anticuerpo y minimizar la presencia de artefactos. En general no son adecuados los fijadores como el glutaraldehído, porque exageran la autofluorescencia de la muestra, y son adecuados  el paraformaldehído (4% en solución salina isotónica) y metanol o acetona fríos (-20°C).
1.1.1.3.4.2. Secciones Histológicas.
 El grosor depende de la distancia de trabajo propia de cada objetivo, de la penetrabilidad del anticuerpo o de los fluorocromos empleados en la tinción y de las propiedades de transparencia de los tejidos que conforman la muestra.
1.1.1.3.4.3. Atenuación de la fluorescencia.
 Se debe limitar el tiempo de observación, puesto que los radicales libres que se producen durante el tiempo de excitación de los fluorocromos dañan las células y los tejidos no fijados.
1.1.1.3.4.4. Conservación de las muestras.
 Deben ser protegidas de la luz, analizadas rápidamente y almacenadas en frío.
1.1.1.3.5. Utilidades
     Este tipo de técnica sirve para estudiar la estructura de materiales biológicos, siendo muy útil en investigación biomédica. Permite monitorizar los movimientos de las moléculas dentro de las células. Por ejemplo el movimiento del Calcio. Permite además localizar anticuerpos para estudios de inmunocitoquímica con mayor resolución que la microscopía convencional, realizar hibridación histoquímica in situ de alta resolución con procedimientos no isotópicos para localizar la posición de las secuencias de los ácidos nucleicos en las células. Una de las grandes cualidades es que permite la visualización en tres dimensiones incluyendo el interior y permite registrar procesos de secreción en células vivas con marcadores como el FM1-43 (/).
 Con el uso de software y posterior al procesamiento de la imagen permite realizar colecciones de secuencias seriadas, reconstrucciones en 3D, medidas de colocalización de marcadores, imágenes laterales del objeto, superposición de imágenes obtenidas por diferentes técnicas.
1.1.1.3.6. Precauciones
     Es necesario tener en cuenta todas las normas de bioseguridad existentes para el manejo de materiales y sustancias en el laboratorio.
    Además es necesario garantizar un medio de trabajo seguro, es decir, que el piso sea el adecuado y este adecuadamente aseado, que los materiales de trabajo se encuentren en orden y adecuadamente marcados, contar con todos los elementos de protección personal necesarios para el laboratorio (guantes, tapabocas, gorro, bata). Adicionalmente es importante que las personas que trabajan en el laboratorio tengan consciencia de los riesgos a los que están expuestos, con el fin de evitar al máximo las conductas inadecuadas que puedan predisponer a la presentación de accidentes.
    Es primordial que cada quien conozca las practicas y las técnicas de manipulación, es decir, que cada quien sepa con exactitud que va a hacer al interior del laboratorio.
 
1.1.1.3.7. Ventajas
     Permite realizar seccionamientos ópticos, es decir que para observar los tejidos en sus diferentes niveles no es necesario dañar el tejido con seccionamientos reales. Permite una alta claridad en las imágenes, por lo cual existe la posibilidad de tener un alto grado de diferenciación. Adicionalmente permite la visualización de uno o más tintes de marcaje. Permite realizar cortes ópticos en los diferentes planos pudiendo reconstruir de esta manera imágenes en tercera dimensión (3).
     Brinda una alta calidad en tercera dimensión permitiendo realizar perfiles de superficie, medir profundidades y definir parámetros volumétricos.
   Este microscopio consigue elevada resolución por tres procesos fundamentales:  Primero se enfoca la luz  mediante un lente objetivo, creando un haz biconico cuyo vértice o foco ilumina una zona de la muestra a la profundidad deseada.  Luego la luz  reflejada por esta área es enfocada y concentrada en un punto, permitiéndole que pase en su totalidad a través de una abertura confocal que es captada por un dispositivo detector como una  vídeo cámara. Por último la luz es trasladada de una zona a otra  hasta explorar el plano por completo (1,2,3).  Este barrido se obtiene por reflexión del haz luminosos en un espejo oscilante situado entre el espejo dicronico y las lentes del objetivo de tal forma que el punto luminosos y el diafragma confocal del detector permanezcan en registro (3).  Se utilizan microscopios con un rayo de luz en X-axis con un espejo de Polygon y en el Y-axis un espejo de galvanometer-driven, con un ion láser de argón que opera a 488 nm para lograr excitar la fuente luminosa.
   El microscopio óptico convencional nos da imágenes degradadas y borrosas por la información que queda fuera del foco de las zonas de la muestra situadas encima y debajo del plano focal.  El microscopio confocal, gracias a que utiliza los métodos electrónicos anteriormente enunciados permite enfocar un plano escogido de una muestra fina, eliminando la luz que proviene de las zonas fuera de foco superiores o inferiores a este plano (3).  Además se obtienen imágenes detalladas de secciones del interior de una estructura intacta.
    El microscopio confocal  posee un sistema de lentes ( NA 1.3 ) que  pueden ser de forma circular con una resolución de 1/1.4 o anular con una resolución de 1/1.75 (4), obteniendo series de secciones ópticas a  diferentes profundidades del espécimen archivadas en un ordenador para reconstruir la imagen tridimensional (5).

 Microscopia de inmunofluorescencia.

En 1941  Coons intentó conjugar  los anticuerpos con colorantes fluorescentes y en 1942 publicó la primera aplicación de esta técnica inmunológica.
  La microscopia de inmunofluorescencia es una técnica inmunohistoquímica que consiste en conjugar colorantes fluorescentes (isotiocianato de fluoresceína, rodamina B de lisamina o ácido 1-dimetilaminonaftalen-5-sulfónico) con anticuerpos o antígenos, exponiendo después este conjugado a los anticuerpos o antígenos correspondientes en cortes de tejidos, frotis de microorganismos o de células, o cultivo de tejidos en capa única. Cuando la reacción es positiva y se expone a la luz ultravioleta se producirá fluorescencia observable bajo el microscopio de inmunofluorescencia (1,2) (ver figura 1b).
http://micro.magnet.fsu.edu/primer/techniques/fluorophase.html
 

DESCRIPCION DEL MICROSCOPIO DE INMUNOFLUORESCENCIA 

        Consta de una fuente de luz (lámpara de mercurio o halógena) la cual debe emitir la mayor cantidad de luz ultravioleta , el microscopio y un sistema de filtros, el de excitación o selección de luz ubicado entre la fuente de luz y el preparado, tiene por objeto permitir el paso de ondas de luz con longitud que caiga en el rango azul con el fin que el preparado sea alcanzado exclusivamente por la luz azul y produzca emisión de luz fluorescente. Es segundo filtro es el de calor y está ubicado entre la fuente de luz y el filtro de excitación en los microscopios de luz transmitida y entre la fuente de luz y el espejo dicrómico en los microscopios de luz incidente. El tercer tipo de filtro es de barrera, colocado antes del ocular para prevenir daños retinianos que podrían ser causados por rayos ultravioleta que escapan el espejo dicrómico (3).
FUNCIONAMIENTO
        La luz de una fuente de longitud de onda múltiple se mueve a través de un filtro excitador que solo permite que pase la radiación excitada de la longitud de onda deseada. Esta radiación es reflejada por el filtro dicromático y enfocada por la lente del objetivo sobre la muestra, las moléculas fluorescentes de la muestra se excitan y emiten luz (por fluorescencia) de una longitud de onda específica y mayor. Esta luz es enfocada por el objetivo y la mayor parte pasa a través del filtro dicromático y no se refleja. Un filtro de barrera final bloquea toda la luz residual con la frecuencia de la radiación de excitación.
Clases de técnicas utilizadas para la preparación de las muestras
DIRECTA : Es una técnica que consiste en demostrar la presencia de un antígeno mediante reacción directa con un anticuerpo específico marcado con colorante fluorescente. El anticuerpo es obtenido a través de la inoculación del microorganismo productor del antígeno en un modelo animal (2,3,4,5,6).
INDIRECTA : Es una técnica de doble capa en donde se aplica el anticuerpo sin marcar directamente sobre el sustrato de tejido y se visualiza por tratamiento con un suero anti-inmunoglobulina conjugado con fluorocromo (4).
        El proceso consta de dos etapas: en la primera se fijan sobre un portaobjetos los antígenos que constituyen el substrato conocido específico (células que contiene virus, T. gondii, T. pallidum, etc.) sobre él se coloca el suero de quien se sospecha la presencia de anticuerpos específicos, si la reacción es positiva se dará formación de complejo antígeno-anticuerpo no visible ya que el anticuerpo no estaba marcado (7).
        En la segunda etapa se debe obtener una anti-inmunoglobulina humana marcada, que reaccionará con el anticuerpo del complejo producido en la primera etapa. La anti-inmunoglobulina se obtiene así: de una mezcla de varios sueros de personas normales, se precipitan las globulinas (anticuerpo),  están globulinas son inoculadas a un organismos (conejos, cabras), el organismo producirá antiglobulinas humanas que se marcan con fluoresceína o cualquier otro de los colorantes. Este anticuerpo marcado se unirá al anticuerpo humano no marcado de la primera etapa que en esta momento se puede considerar como un antígeno, dando reacción positiva de fluorescencia solamente si en la primera etapa se produjo unión entre el antígeno fija en la placa y el anticuerpo presente en el suero humano que estamos evaluando (4,7).
        La técnica indirecta tiene ventajas: la inmunofluorescencia es más brillante que la detección directa debido a que varias anti-inmunoglobulinas fluorescentes se pueden unir a cada una de las moléculas de Antígeno-anticuerpo presentes en la primera capa, además dado que el proceso de conjugación es largo, se ahorra tiempo cuando se estudian varios sueros para la determinación de anticuerpo ya que sólo es necesario prepara un único reactivo marcado : la anti-inmunoglobulina (4).
SANDWICH : Este es un procedimiento de doble capa diseñado para visualizar anticuerpos específicos. El nombre de la determinación deriva de la observación que el antígeno se ubica entre el anticuerpo presente en el sustrato de la célula y el agregado como segunda capa (4).
PREPARACIÓN DE LA MUESTRA (1)
A. Métodos de conjugación : Es posible conjugar las proteínas en el suero completo o en fracciones de suero luego de concentrar los anticuerpos.
Se debe añadir al suero un amortiguador de carbonato-bicarbonato para mantener condiciones óptimas de pH (9.0), se agita en baño de hielo añadiendo fluorocromo en un período de 15 minutos, se debe permitir una agitación toda la noche ya que la conjugación es del orden del 100% en 24 horas.
B. Purificación del conjugado : Se logra mediante eliminación por diálisis de las sales amortiguadoras y los elementos utilizados como solventes del fluorocromo (acetona). Se utiliza extracción con carbón o filtración en columna de sephadex para eliminar las sustancias fluorescentes Que. no reaccionaron lo cual puede ocasionar tinción inespecífica.
C. Concentración del Anticuerpo : Se logra mediante tratamiento con sales de amonio saturado. El almacenamiento es el solución salina amortiguada con fosfato a pH 7.1.
D. Preparación de anticuerpos : Se obtienen mediante inmunización en animales, la globulina humana se aplica en 2 o 3 inyecciones a intervalos de 3-4 semanas, la respuesta de anticuerpos se mide mediante métodos serológicos y el suero se recoge 7-10 días luego de la última inyección.
E. Manejo de cortes y tejidos : Los frotis y cortes montados que no se estudien de inmediato se pueden proteger por sumersión en carbowax y almacenamiento a -20°C. Los cortes liofilizados protegidos con resina de poliester se pueden conservar varios meses en un desecador a 0°C sin que pierda sus antígenos.
        Es preferible trabajar con cortes fijados ya que.la tinción inmunofluorescente en cortes sin fijar se acompaña de difusión o pérdida del antígeno además se reduce la autoinmunofluorescencia tisular (vesículas y partículas).
        Se deben usar fijadores que no alteren la estructura antígeno-anticuerpo, el más empleado es alcohol etílico al 95% entre 4-30°C, alcohol metílico, acetona o formol. Para bacterias es muy útil la fijación mediante calor. La inclusión en parafina de los tejidos es muy usado y puede lograr una localización más precisa y una tinción más viva que con cortes en congelación.
FLUOROCROMOS - Sustancias que emiten un fotón cuando son excitados por un fotón incidente.

        Se deben utilizar colorantes que formen uniones con las proteínas pero sin afectar los grupos de combinación específica del anticuerpo. La reacción de unión ocurre entre los grupos amino y carboxilo de la proteína y los grupos tiocianato o cloruro de sulfonilo de los colorantes. El fenómeno de fijación disminuye la fluorescencia de los fluorocromos de tal manera que los conjugados solo muestran de 15-30% de la fluorescencia del colorante libre.
        El pH afecta la fluorescencia y  por esta razón se debe trabajar a pH estable y adecuado dependiendo del colorante : fluoresceína (pH 8), rodamina (pH 7), DANS (pH 1.6-14) (1).
    El colorante fluorescente es una molécula que absorbe luz en una longitud de onda, lo que excita los electrones y los lleva a un nivel energético mayor y al volver a su nivel energético inicial emite luz en una segunda longitud de onda. El isocianato de fluoresceína y el DANS muestran una fluorescencia verde manzana bajo la luz ultravioleta y la rodamina anarajando brillante (1).
    Cuando el lapso de tiempo entre la absorcion de la luz activamente y la emision de la nueva luz es mayor de 1/10000 segundos el fenomeno se define como fosforescencia, pero cuando el fenomeno es menor de 1/10000 segundos se define como fluorescencia.

VENTAJAS Y DESVENTAJAS
VENTAJAS 
- Se pueden obtener resultados rápidos.
-No es necesario realizar cultivos.
-Se puede identificar microorganismos específicos en un grupo mixto.
-Determina la identidad de un organismo muerto.
-Es sensible.Nota: La figura muestra un ejemplo de fagocitosis.

DESVENTAJAS
-Costos en reactivo y equipo
-Debe ser realizado por personal muy especializado.
-Los resultados no son 100% específicos (como toda técnica serológica).
APLICACIONES
    Esta técnica tiene múltiples aplicaciones en diagnóstico e investigación. Se ha utilizado en estudios bacteriológicos, virales, parasitológicos. Se ha utilizado en el estudio de la distribución intracelular de las moléculas.
A dividing cell showing the genetic material in chromosomes (blue) connected via INCEPs (pink) to the cell skeleton tubulin tracks (green).The tracks guide one set of genes to each daughter cell. Courtesy of Bill Earnshaw ICMB, University of Edinburgh