UNA MIRADA AL INTERIOR DE LA CÉLULA VIVA
1º Contribución del agua a la estructura y función de la célula viva.
Aunque, con mucho, es la molécula más abundante en los seres vivos, se tiende a considerar para el agua un papel meramente pasivo como "solvente universal" en el que tienen lugar las reacciones químicas de la vida. No obstante, las cosas no son tan sencillas, pues, de entrada, existen diferentes tipos de agua en la célula: agua ligada, agua de hidratación, agua vecinal y agua libre. Aun admitiendo como correcta la estimación de que aproximadamente un 95% del agua celular no está ligada, este agua "libre" no constituye en la célula un medio fluido no viscoso que rellena los espacios que dejan libres las estructuras celulares; antes al contrario, parece que el agua contribuye decisivamente a la organización estructural de la célula viva. ¿ Cómo es posible pretender situar una pequeña molécula de 18 Da al nivel de las macromoleculas -proteínas y ácidos nucleicos- que, junto con las membrans, determinan la estructura celular? Resulta que el agua es capaz de formar agregados ordenados transitorios que se mantienen juntos mediante enlaces cooperativos intermoleculares. La unidad de agregación básica en condiciones normales de presión y temperatura es un cubo de 3.3 nm de arista, que contiene más de mil moléculas de agua y tiene una masa molecular relativa de más de 20 kDa [Watterson, Biochem. J. , 248:615 (1987)]. Estas unidades básicas interaccionan activamente con las macromoléculas, contribuyendo a su propio ensamblaje y organización. En el caso bien conocido de las proteínas del citoesqueleto, no sólo ellas contribuyen a "fijar y ordenar" las moléculas de agua de su capa de hidratación sino que, al menos en igual medida, los agregados de agua también contribuyen por su parte a posibilitar la organización de la red microtubular. De hecho, los complejos (proteínas del citoesqueleto)/agua constituyen unas fases que asemejan auténticos sólidos y que determinan que el interior celular diste mucho de tener la fluidez que se le supone. Pero es más, el agua contribuye activamente al "anclado" transitorio de proteínas "solubles" a la red del citoesqueleto, posibilitando la aparición del fenómeno de la canalización metabólica.
Esta novedosa y radical visión de un papel activo para el agua va aún más allá, pues llega a plantear la idea de que la organización del agua predetermina unas dimensiones geométricas requeridas en las macromoléculas de la célula viva. Las dimensiones de las membranas biológicas, de los dominios de las proteínas y de los ácidos nucleicos responden a dichos requerimientos geométricos.
Dada la estrecha relación entre estructura y función en el ser vivo, se deduce fácilmente que el papel activo del agua no queda en la mera estructura sino que alcanza al propio funcionamiento de la célula viva.
2º Las distorsiones introducidas por la Bioquímica in vitro.
El método tradicionalmente empleado para estudiar la función de las proteínas consiste en determinar su actividad in vitro en un homogenado o tras un proceso de purificación. En ambos casos, las relaciones entre moléculas sustratos y enzimas son muy diferentes a las que se dan en el interior celular. In vitro, suele trabajarse con concentraciones de sustrato del orden 10-3 M y de enzima en el rango 10-6-10-9 M. Sin embargo, parece que en la célula la relación molar puede ser prácticamente la contraria, con sustratos a 10-6 M y enzimas a 10-3 M. Las agregaciones transitorias de las diferentes enzimas de una vía metabólica para constituir lo que se ha dado en llamar metabolón justificarían las elevadísimas concentraciones locales de dichas enzimas y explicarían la notable eficiencia metabólica de la célula viva. Ni que decir tiene que, desde este punto de vista, los clásicos conceptos de Vmax y Km tienen escasa relevancia en la célula.
En definitiva, el comportamiento de las proteínas "solubles" en una disolución ideal in vitro tras su purificación o, incluso, en un simple homogenado es muy distinto al que exhiben en la célula viva y ello es debido a las asociaciones transitorias que dichas proteínas forman entre sí, con las proteínas del citoesqueleto y con las membranas, con la activa colaboración del agua.
3º Lo que la microscopía electrónica no deja ver.
La microscopía electrónica convencional ha extendido durante décadas un tupido velo que ha contribuido al mantenimiento de la visión convencional y errónea que se suele tener de la estructura celular. Ello es debido a que las secciones ultrafinas incluidas en resinas plásticas que se suelen emplear en esta técnica sólo ofrecen una imagen de lo que hay sobre la superficie del corte y enmascara las complejas redes del citoesqueleto citoplásmico y del llamado armazón o matriz nuclear. El empleo alternativo de la técnica de secciones ultrafinas no incluidas en resina y tratadas con detergentes no iónicos está permitiendo obtener espectaculares imágenes de las redes microtubulares del citoesqueleto y de la matriz nuclear [Penman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:5251 (1995)]. Las imágenes resultantes revelan unos grados de complejidad estructural (y, por tanto, funcional) apenas sospechados. Es más, cada vez se acumulan más datos experimentales que evidencian el papel activo de las proteínas del citoesqueleto y de la matriz nuclear en la regulación del funcionamiento de la célula viva. He aquí un ejemplo concreto: recientemente se ha demostrado que las asociaciones de regiones de la cromatina a la matriz nuclear constituyen un eficiente mecanismo de regulación génica.
A modo de conclusión: La célula vista de una forma distinta.
Por todo lo comentado arriba, parece pertinente la propuesta del Dr. Penman para que nos replanteemos la visión que hemos tenido de la estructura celular. La célula viva ya no es más el protoplasma que fluctúa entre sol y gel. Hemos de pensar en el interior celular como un medio de elevada viscosidad, en el que el movimiento de las moléculas se halla fuertemente restringido, en el que el agua contribuye a la ordenación del complejo entramado microtubular al que quedan asociados orgánulos, membranas y macromoléculas "solubles". Hace unos años, el Dr. David Goodsell dibujó el aspecto "real" que tendría a gran escala zonas concretas de una bacteria E. coli [Trends Biochem. Sci., 16:203 (1991)]; como, a veces, una imagen vale más que mil palabras, a dichos dibujos me remito.
La organización del interior celular recuerda al de un cristal de proteína con un 40% de agua. El estado físico del citoplasma, alejado de un fluido Newtoniano simple, podría ser descrito como "un entramado que constituye un gel no covalente reversible". A partir de aquí, es defendible considerar una estructura fractal para el citoplasma [Aon y Cortassa, FEBS Lett., 344:1 (1994)]. En definitiva, la célula viva es una estructura integrada, constituída por cuatro constituyentes fundamentales (agua, proteínas, ácidos nucleicos y membranas) que encajan entre sí en el espacio.
REACCIONES DE HIPERSENSIBILIDAD EN PLANTAS CULTIVADAS IN VITRO
La elección, aislamiento y desinfección del explanto es el primer paso para el establecimiento in vitro de cualquier especie vegetal, y el éxito de esta fase depende en gran medida de toda una serie de parámetros relacionados con el propágulo (estado fisiológico, edad, estado de desarrollo, estado sanitario) y con el sistema seguido para su manipulación y esterilización [Franclet y col., Eds., Cell and tissue culture in forestry .Vol. I, Dordrecht, (1.987)].
De todas formas e incluso trabajando en condiciones óptimas y muy poco agresivas, los tejidos que forman el explanto sufren siempre en mayor o menor medida situaciones de estrés (desecación, daños mecánicos, daños en la desinfección, cambios en los potenciales hídrico, salino y osmótico al ser incubados en el medio de cultivo, cambios de pH...), y todo esto provoca la estimulación del metabolismo de los compuestos fenólicos. Estas sustancias van a provocar o conducir una serie de reacciones de hipersensibilidad, tales como la exhudación al medio del contenido de las células deterioradas, reaciones de estrés en las células vecinas de las dañadas, incluso aunque esas células no parezcan estar dañadas, y/o una muerte prematura de células específicas de esa zona o del lugar de la infección.
En respuesta al estrés o daño mecánico, en general el metabolismo fenólico presenta tres tipos de reacciones:
a) La síntesis de productos fenólicos monoméricos (fitoalexinas).
b) La síntesis de derivados polifenólicos.
c) La oxidación de componentes fenólicos preformados, que van a dar lugar quinonas y a material polimerizado (ligninas).
La síntesis de monofenoles puede conducir a la acumulación en tejidos no dañados de grandes cantidades de productos ya preformados, o dar lugar a la aparición de nuevos productos, las fitoalexinas, cuyo papel en los mecanismos de protección contra enfermedades es bien conocido. Así, una acumulación de material polimerizado, tipo lignina, va a actuar como una barrera física contra las invasiones microbianas y las quinonas y fitoalexinas van a actuar inhibiendo el crecimiento microbiano, trás la infección.
Un grupo especial de fenoles son aquellos que protegen las auxinas (tienen un efecto antioxidante inhibiendo la oxidación del ácido indolacético (AIA). En una planta completa existe un gradiente de inhibición de la degradación enzimática del AIA, que es inversamente proporcional a la edad del tejido, por ello la inhibición disminuye del ápice a la base del tallo [(Stonier, Eds., Colloques internationaux CNRS nº 193. Les cultures de tissus de plantes, Paris. ( 1.971)].
En general los fenoles son sustancias lábiles y fáciles de oxidar, y los productos de esta oxidación tienen caracter fitotóxico, por lo que son capaces de alterar procesos morfogenéticos y/o de crecimiento y desarrollo, potenciando en otras ocasiones otros procesos de oxidación, ya que trás su propia oxidacíon se convierten en potentes oxidantes.
Por todo lo dicho, en el cultivo de tejidos se hace necesario controlar por una parte, los compuestos fenólicos protectores de auxinas, con objeto de estimular el crecimiento tisular y, por otro frente limitar la biosíntesis de fenoles y/o retardar o impedir su oxidación cuando llegan al medio de cultivo. Esta oxidación de fenoles provoca en los cultivos el "browning" o "Blackening" es decir un ennegrecimiento tanto del medio de cultivo como de los explantos, que suele concluir con la muerte o necrosis generalizada de los propágulos [(George y Sherrington, Eds., Plant propagation by tissue culture. Basingstoke. ( 1.984)].
Se han propuesto diversos métodos para eliminar o paliar los efectos negativos de estos compuestos fenólicos:
Para empezar es lógico suponer que evitar o suavizar los estreses que provocan o estimulan su biosíntesis, será el mejor método para impedir que estas sustancias aparezcan en los cultivos y produzcan efectos tóxicos e inhibición del crecimiento. Una práctica adecuada sería cuidar que las condiciones fitosanitarias y fisiológicas de las plantas madres origen de los explantos fueran idóneas en la Fase O y que los métodos de desinfección y aislamiento fueran lo menos agresivos posibles en la Fase 1 de establecimento de los cultivos. Otros métodos que dan buen resultado si la síntesis de fenoles no puede evitarse son, la dispersión, adsorción o lavado, con sustancias como el carbón activado (CA) o la polivinilpirrolidona (PVP); la modificación del potencial redox (disminuyendo los agentes redox, o la disponibilidad de oxigeno; la inactivación de enzimas de tipo fenolasa (quelantes), y otros sistemas como la incubación en condiciones de oscuridad, bajo pH, incubación a temperaturas más bajas..., que persiguen reducir la actividad fenolasa y la disponibilidad de sustratos. La adición de sustancias antioxidantes, es otro de los métodos que suelen aplicarse, aunque es necesario tener mucho cuidado, ya que trás su oxidación pasan a ser oxidantes muy potentes, invirtiendose su efecto positivo en el control de los fenoles [(Cleland, Biochem. 3: 480, (1.964)].
Determinados componentes de la formulación del medio de cultivo: citoquininas, micronutrientes: Mn++ y Cu++ (componentes de complejos enzimáticos) e incluso el potencial osmótico del medio pueden potenciar o inhibir la biosíntesis de compuestos fenólicos, su difusión y oxidación, interfiriendo activamente las reacciones de hipersensibilidad vegetal (ennegrecimiento, inhibición del crecimiento, necrosis) que provocan en condiciones in vitro.
Aunque, con mucho, es la molécula más abundante en los seres vivos, se tiende a considerar para el agua un papel meramente pasivo como "solvente universal" en el que tienen lugar las reacciones químicas de la vida. No obstante, las cosas no son tan sencillas, pues, de entrada, existen diferentes tipos de agua en la célula: agua ligada, agua de hidratación, agua vecinal y agua libre. Aun admitiendo como correcta la estimación de que aproximadamente un 95% del agua celular no está ligada, este agua "libre" no constituye en la célula un medio fluido no viscoso que rellena los espacios que dejan libres las estructuras celulares; antes al contrario, parece que el agua contribuye decisivamente a la organización estructural de la célula viva. ¿ Cómo es posible pretender situar una pequeña molécula de 18 Da al nivel de las macromoleculas -proteínas y ácidos nucleicos- que, junto con las membrans, determinan la estructura celular? Resulta que el agua es capaz de formar agregados ordenados transitorios que se mantienen juntos mediante enlaces cooperativos intermoleculares. La unidad de agregación básica en condiciones normales de presión y temperatura es un cubo de 3.3 nm de arista, que contiene más de mil moléculas de agua y tiene una masa molecular relativa de más de 20 kDa [Watterson, Biochem. J. , 248:615 (1987)]. Estas unidades básicas interaccionan activamente con las macromoléculas, contribuyendo a su propio ensamblaje y organización. En el caso bien conocido de las proteínas del citoesqueleto, no sólo ellas contribuyen a "fijar y ordenar" las moléculas de agua de su capa de hidratación sino que, al menos en igual medida, los agregados de agua también contribuyen por su parte a posibilitar la organización de la red microtubular. De hecho, los complejos (proteínas del citoesqueleto)/agua constituyen unas fases que asemejan auténticos sólidos y que determinan que el interior celular diste mucho de tener la fluidez que se le supone. Pero es más, el agua contribuye activamente al "anclado" transitorio de proteínas "solubles" a la red del citoesqueleto, posibilitando la aparición del fenómeno de la canalización metabólica.
Esta novedosa y radical visión de un papel activo para el agua va aún más allá, pues llega a plantear la idea de que la organización del agua predetermina unas dimensiones geométricas requeridas en las macromoléculas de la célula viva. Las dimensiones de las membranas biológicas, de los dominios de las proteínas y de los ácidos nucleicos responden a dichos requerimientos geométricos.
Dada la estrecha relación entre estructura y función en el ser vivo, se deduce fácilmente que el papel activo del agua no queda en la mera estructura sino que alcanza al propio funcionamiento de la célula viva.
2º Las distorsiones introducidas por la Bioquímica in vitro.
El método tradicionalmente empleado para estudiar la función de las proteínas consiste en determinar su actividad in vitro en un homogenado o tras un proceso de purificación. En ambos casos, las relaciones entre moléculas sustratos y enzimas son muy diferentes a las que se dan en el interior celular. In vitro, suele trabajarse con concentraciones de sustrato del orden 10-3 M y de enzima en el rango 10-6-10-9 M. Sin embargo, parece que en la célula la relación molar puede ser prácticamente la contraria, con sustratos a 10-6 M y enzimas a 10-3 M. Las agregaciones transitorias de las diferentes enzimas de una vía metabólica para constituir lo que se ha dado en llamar metabolón justificarían las elevadísimas concentraciones locales de dichas enzimas y explicarían la notable eficiencia metabólica de la célula viva. Ni que decir tiene que, desde este punto de vista, los clásicos conceptos de Vmax y Km tienen escasa relevancia en la célula.
En definitiva, el comportamiento de las proteínas "solubles" en una disolución ideal in vitro tras su purificación o, incluso, en un simple homogenado es muy distinto al que exhiben en la célula viva y ello es debido a las asociaciones transitorias que dichas proteínas forman entre sí, con las proteínas del citoesqueleto y con las membranas, con la activa colaboración del agua.
3º Lo que la microscopía electrónica no deja ver.
La microscopía electrónica convencional ha extendido durante décadas un tupido velo que ha contribuido al mantenimiento de la visión convencional y errónea que se suele tener de la estructura celular. Ello es debido a que las secciones ultrafinas incluidas en resinas plásticas que se suelen emplear en esta técnica sólo ofrecen una imagen de lo que hay sobre la superficie del corte y enmascara las complejas redes del citoesqueleto citoplásmico y del llamado armazón o matriz nuclear. El empleo alternativo de la técnica de secciones ultrafinas no incluidas en resina y tratadas con detergentes no iónicos está permitiendo obtener espectaculares imágenes de las redes microtubulares del citoesqueleto y de la matriz nuclear [Penman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:5251 (1995)]. Las imágenes resultantes revelan unos grados de complejidad estructural (y, por tanto, funcional) apenas sospechados. Es más, cada vez se acumulan más datos experimentales que evidencian el papel activo de las proteínas del citoesqueleto y de la matriz nuclear en la regulación del funcionamiento de la célula viva. He aquí un ejemplo concreto: recientemente se ha demostrado que las asociaciones de regiones de la cromatina a la matriz nuclear constituyen un eficiente mecanismo de regulación génica.
A modo de conclusión: La célula vista de una forma distinta.
Por todo lo comentado arriba, parece pertinente la propuesta del Dr. Penman para que nos replanteemos la visión que hemos tenido de la estructura celular. La célula viva ya no es más el protoplasma que fluctúa entre sol y gel. Hemos de pensar en el interior celular como un medio de elevada viscosidad, en el que el movimiento de las moléculas se halla fuertemente restringido, en el que el agua contribuye a la ordenación del complejo entramado microtubular al que quedan asociados orgánulos, membranas y macromoléculas "solubles". Hace unos años, el Dr. David Goodsell dibujó el aspecto "real" que tendría a gran escala zonas concretas de una bacteria E. coli [Trends Biochem. Sci., 16:203 (1991)]; como, a veces, una imagen vale más que mil palabras, a dichos dibujos me remito.
La organización del interior celular recuerda al de un cristal de proteína con un 40% de agua. El estado físico del citoplasma, alejado de un fluido Newtoniano simple, podría ser descrito como "un entramado que constituye un gel no covalente reversible". A partir de aquí, es defendible considerar una estructura fractal para el citoplasma [Aon y Cortassa, FEBS Lett., 344:1 (1994)]. En definitiva, la célula viva es una estructura integrada, constituída por cuatro constituyentes fundamentales (agua, proteínas, ácidos nucleicos y membranas) que encajan entre sí en el espacio.
REACCIONES DE HIPERSENSIBILIDAD EN PLANTAS CULTIVADAS IN VITRO
La elección, aislamiento y desinfección del explanto es el primer paso para el establecimiento in vitro de cualquier especie vegetal, y el éxito de esta fase depende en gran medida de toda una serie de parámetros relacionados con el propágulo (estado fisiológico, edad, estado de desarrollo, estado sanitario) y con el sistema seguido para su manipulación y esterilización [Franclet y col., Eds., Cell and tissue culture in forestry .Vol. I, Dordrecht, (1.987)].
De todas formas e incluso trabajando en condiciones óptimas y muy poco agresivas, los tejidos que forman el explanto sufren siempre en mayor o menor medida situaciones de estrés (desecación, daños mecánicos, daños en la desinfección, cambios en los potenciales hídrico, salino y osmótico al ser incubados en el medio de cultivo, cambios de pH...), y todo esto provoca la estimulación del metabolismo de los compuestos fenólicos. Estas sustancias van a provocar o conducir una serie de reacciones de hipersensibilidad, tales como la exhudación al medio del contenido de las células deterioradas, reaciones de estrés en las células vecinas de las dañadas, incluso aunque esas células no parezcan estar dañadas, y/o una muerte prematura de células específicas de esa zona o del lugar de la infección.
En respuesta al estrés o daño mecánico, en general el metabolismo fenólico presenta tres tipos de reacciones:
a) La síntesis de productos fenólicos monoméricos (fitoalexinas).
b) La síntesis de derivados polifenólicos.
c) La oxidación de componentes fenólicos preformados, que van a dar lugar quinonas y a material polimerizado (ligninas).
La síntesis de monofenoles puede conducir a la acumulación en tejidos no dañados de grandes cantidades de productos ya preformados, o dar lugar a la aparición de nuevos productos, las fitoalexinas, cuyo papel en los mecanismos de protección contra enfermedades es bien conocido. Así, una acumulación de material polimerizado, tipo lignina, va a actuar como una barrera física contra las invasiones microbianas y las quinonas y fitoalexinas van a actuar inhibiendo el crecimiento microbiano, trás la infección.
Un grupo especial de fenoles son aquellos que protegen las auxinas (tienen un efecto antioxidante inhibiendo la oxidación del ácido indolacético (AIA). En una planta completa existe un gradiente de inhibición de la degradación enzimática del AIA, que es inversamente proporcional a la edad del tejido, por ello la inhibición disminuye del ápice a la base del tallo [(Stonier, Eds., Colloques internationaux CNRS nº 193. Les cultures de tissus de plantes, Paris. ( 1.971)].
En general los fenoles son sustancias lábiles y fáciles de oxidar, y los productos de esta oxidación tienen caracter fitotóxico, por lo que son capaces de alterar procesos morfogenéticos y/o de crecimiento y desarrollo, potenciando en otras ocasiones otros procesos de oxidación, ya que trás su propia oxidacíon se convierten en potentes oxidantes.
Por todo lo dicho, en el cultivo de tejidos se hace necesario controlar por una parte, los compuestos fenólicos protectores de auxinas, con objeto de estimular el crecimiento tisular y, por otro frente limitar la biosíntesis de fenoles y/o retardar o impedir su oxidación cuando llegan al medio de cultivo. Esta oxidación de fenoles provoca en los cultivos el "browning" o "Blackening" es decir un ennegrecimiento tanto del medio de cultivo como de los explantos, que suele concluir con la muerte o necrosis generalizada de los propágulos [(George y Sherrington, Eds., Plant propagation by tissue culture. Basingstoke. ( 1.984)].
Se han propuesto diversos métodos para eliminar o paliar los efectos negativos de estos compuestos fenólicos:
Para empezar es lógico suponer que evitar o suavizar los estreses que provocan o estimulan su biosíntesis, será el mejor método para impedir que estas sustancias aparezcan en los cultivos y produzcan efectos tóxicos e inhibición del crecimiento. Una práctica adecuada sería cuidar que las condiciones fitosanitarias y fisiológicas de las plantas madres origen de los explantos fueran idóneas en la Fase O y que los métodos de desinfección y aislamiento fueran lo menos agresivos posibles en la Fase 1 de establecimento de los cultivos. Otros métodos que dan buen resultado si la síntesis de fenoles no puede evitarse son, la dispersión, adsorción o lavado, con sustancias como el carbón activado (CA) o la polivinilpirrolidona (PVP); la modificación del potencial redox (disminuyendo los agentes redox, o la disponibilidad de oxigeno; la inactivación de enzimas de tipo fenolasa (quelantes), y otros sistemas como la incubación en condiciones de oscuridad, bajo pH, incubación a temperaturas más bajas..., que persiguen reducir la actividad fenolasa y la disponibilidad de sustratos. La adición de sustancias antioxidantes, es otro de los métodos que suelen aplicarse, aunque es necesario tener mucho cuidado, ya que trás su oxidación pasan a ser oxidantes muy potentes, invirtiendose su efecto positivo en el control de los fenoles [(Cleland, Biochem. 3: 480, (1.964)].
Determinados componentes de la formulación del medio de cultivo: citoquininas, micronutrientes: Mn++ y Cu++ (componentes de complejos enzimáticos) e incluso el potencial osmótico del medio pueden potenciar o inhibir la biosíntesis de compuestos fenólicos, su difusión y oxidación, interfiriendo activamente las reacciones de hipersensibilidad vegetal (ennegrecimiento, inhibición del crecimiento, necrosis) que provocan en condiciones in vitro.
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