Apoptosis y redes vasculares
La importancia del proceso de muerte celular, tanto en condiciones patológicas como no patológicas, es de todos bien conocida. En los últimos años, mucho se ha discutido sobre la terminología que se debe usar en estos casos y se ha generalizado la distinción entre necrosis y apoptosis, término este último que también se conoce como ?muerte celular programada?. Uno de los problemas más citado por los expertos es la dificultad que existe en muchos casos para distinguir los cambios autolíticos post mortem del proceso de muerte celular en sí mismo (Farber, Modern. Pathol., 7: 605-609, 1994). Las fuentes de confusión son, principalmente, la caracterización morfológica (definida por los fenómenos de condensación celular -picnosis-, ruptura nuclear -cariorhexis- y la subsiguiente pérdida de material nuclear -cariolisis-, Kerr et al., Br. J. Cancer, 26: 239-257, 1972), la variabilidad entre diferentes tipos de células y el uso de la palabra ?programada? para definir la muerte celular por apoptosis. El término no debe ser entendido en un sentido excesivamente amplio, sino más bien como indicador de un hecho de muerte selectiva con cierto carácter regular y predecible durante el desarrollo embrionario normal; el control del proceso, en cuanto a 'programación genética' se refiere, está claramente definido por el ambiente y las interacciones a las que se ven sometidas las células (ver FIGURA 1). La importancia del proceso de apoptosis se incrementa con el paso del tiempo, ya que se cree que alteraciones en la regulación de la muerte celular programada podrían jugar un importante papel en la etiología del cáncer, el SIDA, las respuestas autoinmunes y varios aspectos degenerativos del sistema nervioso central.
Figura 1.- Eventos metabólicos comunes en apoptosis. 1.- Retirada de factores tróficos; 2.- Estímulos positivos (glucocorticoides, TNF, TGF-beta, proteína HIV gp 120, ligando APO-1/Fas); 3.- Activación de enzimas dependientes de calcio; 4.- Endonucleasas; 5.- Proteasas; 6.- Transglutaminasa; 7.- Degradación del DNA y condensación de la cromatina; 8.- Disrupción del esqueleto y ruptura celular; 9.- Entrecruzamiento de proteìnas citoplasmáticas. A.- Radiación ionizante, drogas anticáncer y toxinas; B.- Estructura alterada de la cromatina; C.- Cambio en los marcadores de superficie celular; D.- Fagocitosis celular sin inflamación. Modificado de Carson y Ribeiro, The Lancet, 341:1251-1254, 1993.
Disponemos ya de gran cantidad de datos acerca de varias moléculas que parecen jugar un importante papel en el proceso apoptótico. El oncogén bcl-2 (B-cell lymphoma/leukemia-2 gene) es considerado como un supresor generalizado de muerte celular. Todas las células hematopoyéticas y linfáticas, muchos tipos de células epiteliales y neuronas tienen la proteínabcl-2, que se localiza intracelularmente en la membrana mitocondrial, el núcleo y el retículo endoplásmico. Es muy interesante saber que el virus de Epstein-Barr incrementa la transcripción del gen bcl-2 en las células del linfoma de Burkitt, confiriendo a dichas células una larga supervivencia y resistencia a la radiación ionizante y a los glucocorticoides. Dado que la proteína bcl-2 parece bloquear principalmente la apoptosis inducida por gamma-radiación y drogas quimioterapéuticas, se supone que interrumpe una vía final común para la muerte celular programada, incrementando notablemente la resistencia a daños en el DNA (Reed, J. Cell Biol., 124: 1-6, 1994).
En términos generales, se tiende a considerar la apoptosis como un tipo de 'muerte fisiológica' o quizá podríamos decir homeostática, pues la fragmentación del material genético ocurre sin pérdida de los contenidos celulares hacia el espacio extracelular, por lo que la eliminación de estas células por macrófagos evita cualquier tipo de proteolisis incontrolada. Centrándonos en ese aspecto, es fácil entender que el proceso de apoptosis sea capital en el modelado morfogenético propio de la embriogénesis (por ejemplo en la formación de las extremidades, Hurlé et al., J. Embryol. Exp. Morphol., 85: 239-250, 1985).
No menos interesantes son las remodelaciones que sufren las redes capilares primarias que se desarrollan inicialmente en muchos órganos y que luego habrán de desaparecer. En este terreno se han propuesto nuevas e interesantes hipótesis sobre el sistema de inducción de muerte celular programada en entramados capilares complejos, como el que sucede en la membrana pupilar. Dos causas distintas han sido propuestas para explicar la muerte de las células vasculares endoteliales. La primera parece ser macrófago dependiente (Lang y Bishop, Cell, 74: 453-462, 1993) mientras la segunda sería un resultado directo del cese del flujo sanguíneo. Ambas han sido reunidas recientemente en un sólo modelo (Meeson et al., Development, 122: 3929-3938, 1996) que se muestra en la FIGURA 2 (basada en Meeson et al., 1996). Al inicio del proceso de regresión capilar se produce la muerte de células vasculares endoteliales aisladas por apoptosis inducida por macrófagos -apoptosis inicial- (A). La protrusión de estas células en la luz capilar retiene el flujo en primera instancia (B) y finalmente acaba deteniéndolo (C). Tras el cese del flujo se produce una apoptosis sincrónica en la red capilar implicada, conocida como apoptosis secundaria (D), probablemente debida a la falta de algún factor de crecimiento provisto por la sangre (¿VEGF?).
Es posible que regresiones tisulares complejas que afectan a porciones ectodérmicas y mesodérmicas en la embriogénesis de los vertebrados sean dirigidas por un proceso regulado de involución capilar.
Disponemos ya de gran cantidad de datos acerca de varias moléculas que parecen jugar un importante papel en el proceso apoptótico. El oncogén bcl-2 (B-cell lymphoma/leukemia-2 gene) es considerado como un supresor generalizado de muerte celular. Todas las células hematopoyéticas y linfáticas, muchos tipos de células epiteliales y neuronas tienen la proteínabcl-2, que se localiza intracelularmente en la membrana mitocondrial, el núcleo y el retículo endoplásmico. Es muy interesante saber que el virus de Epstein-Barr incrementa la transcripción del gen bcl-2 en las células del linfoma de Burkitt, confiriendo a dichas células una larga supervivencia y resistencia a la radiación ionizante y a los glucocorticoides. Dado que la proteína bcl-2 parece bloquear principalmente la apoptosis inducida por gamma-radiación y drogas quimioterapéuticas, se supone que interrumpe una vía final común para la muerte celular programada, incrementando notablemente la resistencia a daños en el DNA (Reed, J. Cell Biol., 124: 1-6, 1994).
En términos generales, se tiende a considerar la apoptosis como un tipo de 'muerte fisiológica' o quizá podríamos decir homeostática, pues la fragmentación del material genético ocurre sin pérdida de los contenidos celulares hacia el espacio extracelular, por lo que la eliminación de estas células por macrófagos evita cualquier tipo de proteolisis incontrolada. Centrándonos en ese aspecto, es fácil entender que el proceso de apoptosis sea capital en el modelado morfogenético propio de la embriogénesis (por ejemplo en la formación de las extremidades, Hurlé et al., J. Embryol. Exp. Morphol., 85: 239-250, 1985).
No menos interesantes son las remodelaciones que sufren las redes capilares primarias que se desarrollan inicialmente en muchos órganos y que luego habrán de desaparecer. En este terreno se han propuesto nuevas e interesantes hipótesis sobre el sistema de inducción de muerte celular programada en entramados capilares complejos, como el que sucede en la membrana pupilar. Dos causas distintas han sido propuestas para explicar la muerte de las células vasculares endoteliales. La primera parece ser macrófago dependiente (Lang y Bishop, Cell, 74: 453-462, 1993) mientras la segunda sería un resultado directo del cese del flujo sanguíneo. Ambas han sido reunidas recientemente en un sólo modelo (Meeson et al., Development, 122: 3929-3938, 1996) que se muestra en la FIGURA 2 (basada en Meeson et al., 1996). Al inicio del proceso de regresión capilar se produce la muerte de células vasculares endoteliales aisladas por apoptosis inducida por macrófagos -apoptosis inicial- (A). La protrusión de estas células en la luz capilar retiene el flujo en primera instancia (B) y finalmente acaba deteniéndolo (C). Tras el cese del flujo se produce una apoptosis sincrónica en la red capilar implicada, conocida como apoptosis secundaria (D), probablemente debida a la falta de algún factor de crecimiento provisto por la sangre (¿VEGF?).
Es posible que regresiones tisulares complejas que afectan a porciones ectodérmicas y mesodérmicas en la embriogénesis de los vertebrados sean dirigidas por un proceso regulado de involución capilar.
Marcadores moleculares: Qué son, cómo se obtienen y para qué valen
Desde la prehistoria, el hombre ha seleccionado y mejorado especies vegetales, animales y microbianas basándose en el fenotipo. Las mejoras genéticas eran posible gracias a la variabilidad genética, a la heredabilidad del carácter que se quería aislar, a la eficacia e intensidad de la selección aplicada, y al tiempo necesario para realizar un ciclo de selección. Sin embargo, quedan muchos aspectos desconocidos, como son el número y efecto de los genes implicados en la expresión de un carácter, la localización de estos genes, y su función fisiológica. Por otra parte, la taxonomía siempre ha estudiado características morfológicas, lo cual requiere observaciones muy exhaustivas de los organismos en diferentes estadios de desarrollo. Los criterios utilizados carecen muy a menudo de definición y objetividad y, en cualquier caso, son marcadores ambiguos debido a las influencias ambientales.
Afortunadamente la aparición de los marcadores moleculares está ayudando a eliminar tanto los inconvenientes de una selección basada en el análisis exclusivo del fenotipo, como la identificación de especies y variedades de una forma más rigurosa y repetitiva. Los marcadores moleculares son biomoléculas que se pueden relacionar con un rasgo genético. Las biomoléculas que pueden ser marcadores moleculares son las proteínas (antígenos e isoenzimas) y el DNA (genes conocidos o fragmentos de secuencia y función desconocida). Cuando varios marcadores moleculares se asocian inequívocamente con un rasgo genético, se dice que forman un QTL (loci de rasgos cuantitativos o cuantificables). Un marcador molecularmonomórfico es invariable en todos los organimos estudiados, pero cuando presenta diferencias en el peso molecular, actividad enzimática, estructura, o sitios de restricción, se dice que es polimórfico. A veces el grado de variación es tal que se denominan hipervariable.
Los primeros marcadores desarrollados a finales de los 70 se basaron en la identificación de proteínas e isoenzimas por electroforesis en geles de almidón o poliacrilamida. Con ellos se abrió el conocimiento de la estructura y heterogeneidad genética entre diferentes especies, variedades, y poblaciones de distinto origen geográfico. Pero esta técnica tenía una límitación muy importante: no era capaz de detectar suficiente polimorfismo entre variedades o especies próximas debido a que las proteínas son el resultado de la expresión génica, que puede ser distinta de unos tejidos a otros, de una etapa de desarrollo a otra, de un medio ambiente a otro, y de una época del año a otra. Los avances de la tecnología del DNA recombinante han permitido el desarrollo de los marcadores moleculares basados en el DNA, consiguiendo estabilidad en la identificación de especies y variedades. El número de técnicas descritas es cada vez más numeroso, por lo que vamos a reunirlas en 3 categorías: RFLP, MAAP y STS. Pero antes conviene saber lo que es una PCR (reacción en cadena de la polimerasa), descrita en 1988. La PCR es una de las técnicas esenciales para la preparación de huellas dactilares, si bien no vale para elaborar marcadores por sí sola. La reacción básica de la PCR comienza con la desnaturalización del DNA molde para separar las cadenas, continúa con el alineamiento de un par de oligonucleótidos con su DNA molde, y termina con la polimerización para sintetizar un nuevo DNA entre los dos oligonucleótidos. De aquí se vuelve a la desnaturalización para comenzar un nuevo ciclo. Hoy en día todo el proceso esta completamente automatizado en un aparato llamado ?termociclador?, y existe una batería de enzimas y condiciones que permiten polimerizar hasta 35 kpb sin errores, aunque las condiciones normales amplifican sin problemas fragmentos de 3 a 6 kpb de longitud.
RFLP (Polimorfismo en el tamaño de los fragmentos de restricción).
Esta técnica, desarrollada a finales de los 70, se basa en la detección de fragmentos de DNA de distinto peso molecular (por digestión con la misma enzima de restricción) en diferentes organismos. Los fragmentos más fáciles de analizar son los ?pequeños? derivados de la digestión del genoma de las mitocondrias o los cloroplastos, puesto que delecciones, sustituciones o mutaciones pueden alterar significativamente el patrón de bandas identificable por electroforesis en geles de agarosa, donde migran de acuerdo con su peso molecular. En cambio, para moléculas de DNA de mayor tamaño, como el DNA cromosómico, el patrón de bandas es tan complejo que es necesario utilizar sondas específicas para visualizar sólo ciertos fragmentos mediante la técnica de Southern Blot. Las sondas de DNA para esta técnica suelen corresponder a genes previamente conocidos, aunque a veces se usan DNA preparados a partir de amplificaciones inespecíficas. Aunque la RFLP evalúa sólo un tipo de polimorfismo en cada ensayo, el resultado es muy preciso. Los primeros mapas genómicos basados en la distribución física de los genes en vez de la frecuencia de entrecruzamiento se hicieron utilizando esta técnica. Cuando se emplea la PCR en lugar de sondas radiactivas para visualizar los polimorfismos, se le denomina PCR-RFLP
MAAP (Múltiples perfiles arbitrarios de amplificación)
Término genérico acuñado en 1994 con el que se designan las técnicas que emplean oligonucleótidos arbitrarios para generar huellas dactilares complejas. Entre estas técnicas caben destacar:
Afortunadamente la aparición de los marcadores moleculares está ayudando a eliminar tanto los inconvenientes de una selección basada en el análisis exclusivo del fenotipo, como la identificación de especies y variedades de una forma más rigurosa y repetitiva. Los marcadores moleculares son biomoléculas que se pueden relacionar con un rasgo genético. Las biomoléculas que pueden ser marcadores moleculares son las proteínas (antígenos e isoenzimas) y el DNA (genes conocidos o fragmentos de secuencia y función desconocida). Cuando varios marcadores moleculares se asocian inequívocamente con un rasgo genético, se dice que forman un QTL (loci de rasgos cuantitativos o cuantificables). Un marcador molecularmonomórfico es invariable en todos los organimos estudiados, pero cuando presenta diferencias en el peso molecular, actividad enzimática, estructura, o sitios de restricción, se dice que es polimórfico. A veces el grado de variación es tal que se denominan hipervariable.
Los primeros marcadores desarrollados a finales de los 70 se basaron en la identificación de proteínas e isoenzimas por electroforesis en geles de almidón o poliacrilamida. Con ellos se abrió el conocimiento de la estructura y heterogeneidad genética entre diferentes especies, variedades, y poblaciones de distinto origen geográfico. Pero esta técnica tenía una límitación muy importante: no era capaz de detectar suficiente polimorfismo entre variedades o especies próximas debido a que las proteínas son el resultado de la expresión génica, que puede ser distinta de unos tejidos a otros, de una etapa de desarrollo a otra, de un medio ambiente a otro, y de una época del año a otra. Los avances de la tecnología del DNA recombinante han permitido el desarrollo de los marcadores moleculares basados en el DNA, consiguiendo estabilidad en la identificación de especies y variedades. El número de técnicas descritas es cada vez más numeroso, por lo que vamos a reunirlas en 3 categorías: RFLP, MAAP y STS. Pero antes conviene saber lo que es una PCR (reacción en cadena de la polimerasa), descrita en 1988. La PCR es una de las técnicas esenciales para la preparación de huellas dactilares, si bien no vale para elaborar marcadores por sí sola. La reacción básica de la PCR comienza con la desnaturalización del DNA molde para separar las cadenas, continúa con el alineamiento de un par de oligonucleótidos con su DNA molde, y termina con la polimerización para sintetizar un nuevo DNA entre los dos oligonucleótidos. De aquí se vuelve a la desnaturalización para comenzar un nuevo ciclo. Hoy en día todo el proceso esta completamente automatizado en un aparato llamado ?termociclador?, y existe una batería de enzimas y condiciones que permiten polimerizar hasta 35 kpb sin errores, aunque las condiciones normales amplifican sin problemas fragmentos de 3 a 6 kpb de longitud.
RFLP (Polimorfismo en el tamaño de los fragmentos de restricción).
Esta técnica, desarrollada a finales de los 70, se basa en la detección de fragmentos de DNA de distinto peso molecular (por digestión con la misma enzima de restricción) en diferentes organismos. Los fragmentos más fáciles de analizar son los ?pequeños? derivados de la digestión del genoma de las mitocondrias o los cloroplastos, puesto que delecciones, sustituciones o mutaciones pueden alterar significativamente el patrón de bandas identificable por electroforesis en geles de agarosa, donde migran de acuerdo con su peso molecular. En cambio, para moléculas de DNA de mayor tamaño, como el DNA cromosómico, el patrón de bandas es tan complejo que es necesario utilizar sondas específicas para visualizar sólo ciertos fragmentos mediante la técnica de Southern Blot. Las sondas de DNA para esta técnica suelen corresponder a genes previamente conocidos, aunque a veces se usan DNA preparados a partir de amplificaciones inespecíficas. Aunque la RFLP evalúa sólo un tipo de polimorfismo en cada ensayo, el resultado es muy preciso. Los primeros mapas genómicos basados en la distribución física de los genes en vez de la frecuencia de entrecruzamiento se hicieron utilizando esta técnica. Cuando se emplea la PCR en lugar de sondas radiactivas para visualizar los polimorfismos, se le denomina PCR-RFLP
MAAP (Múltiples perfiles arbitrarios de amplificación)
Término genérico acuñado en 1994 con el que se designan las técnicas que emplean oligonucleótidos arbitrarios para generar huellas dactilares complejas. Entre estas técnicas caben destacar:
- RAPD (DNA polimórfico amplificado al azar): Es una de las técnicas más versátiles desde que se desarrolló en el año 1990. Se usa una colección de decanucleótidos para amplificar por PCR áreas específicas distribuídas al azar por el genoma. Su pequeñez y la baja temperatura de alineamiento (36°C) aseguran que se unen a infinidad de secuencias en el genoma para conseguir amplificar muchos fragmentos de DNA. Estos fragmentos se pueden separar en geles de agarosa para obtener perfiles electroforéticos que variarán según el polimorfismo de los distintos individuos o grupos de individuos, y proporcionarán una huella dactilar característica. Es muy cómoda, rápida, requiere poco DNA que además no necesita estar muy puro, no presupone conocimientos previos sobre la secuencia, y se pueden distinguir rápida y simultáneamente muchos organismos. Sus inconvenientes son que los fragmentos amplificados no suelen corresponder a DNA ligado a algún carácter, sino redundante, y que no da información sobre el número de copias que el DNA genómico contiene de la secuencia amplificada. Esta tecnología ha sido utilizada para la catalogación de frutos, selección de variedades, y diferenciación de líneas clonales. También se está utilizando para el análisis de las variedades de apio, uva, limón y olivo.
- AP-PCR (PCR con oligonucleótidos arbitrarios): La idea es similar a la de la RAPD, desarrollándose a la vez que ésta, aunque se cambia el diseño de los oligonucleótidos y el tipo de PCR. Los oligonucleótidos han de ser largos (no menos de 20 nt), y la PCR consta dos de ciclos de baja astringencia (poco específicos) que permite la polimerización de una batería de fragmentos característicos de cada variedad. Esta fase va seguida de ciclos de alta astringencia para amplificar (visualizar) específicamente las bandas anteriores. Los fragmentos amplificados se pueden migrar en un gel de agarosa para observar las grandes diferencias entre especies, o bien se puede marcar radiactivamente y migrar en gel de poliacrilamida para obtener resultados mucho más finos y precisos. Existe una variación denominada DAF (Huellas dactilares por amplificación de DNA) que utiliza oligonucleótidos de 5 a 15 bases, pero las huellas proporcionadas suelen ser muy complejas y difíciles de interpretar.
- AFLP (Polimorfismo de la longitud de los fragmentos amplificados): Esta técnica se desarrolló en 1995 y combina el uso de enzimas de restricción y oligonucleótidos para PCR, de manera que se obtienen marcadores moleculares muy específicos sin necesidad de conocer la secuencia con anterioridad. El DNA se corta con dos enzimas de restricción, una de corte muy frecuente, y otra de corte poco frecuente. A los fragmentos se les ligan oligonucleótidos de extremos compatibles con las enzimas usadas.y se amplifica por PCR. Jugando con la complementariedad del oligonucleótido con el sitio de restricción se puede disminuir o aumentar el número de bandas amplificadas. Una ventaja especial de esta técnica es que es capaz de generar muchos marcadores moleculares en una sola reacción. Por eso el resultado debe resolverse en un gel de poliacrilamida de alta resolución, puesto que no se resolverían en agarosa. Esta técnica ya se ha usado con éxito en patatas y cebada.
- STS (Sitios etiquetados por la secuencia) o SSLP (Polimorfismo de longitud en las secuencias discretas) Desarrollada a partir de 1989, aprovecha las secuencias conocidas, únicas dentro del genoma, para amplificarlas por PCR. El polimorfismo se suele encontrar fácilmente cuando lo que se amplifican son intrones en lugar de exones. La ventaja principal es la velocidad con la que se pueden realizar los análisis una vez que las parejas de oligonucleótidos se han establecido claramente. Por tanto se combinan la rapidez de la RAPD con la especificidad de la RFLP. Por la manera en que se determinan los oligonucleótidos y por la forma de analizar los polimorfismos, esta técnica ha derivado en otras que enumeramos a continuación:
- SSR (Repetición de secuencias discretas), descrita en 1989. En los genomas existe un DNA ubicuo y abundante denominado "microsatélite" que consiste en mono-, di-, tri- y tetranucleótidos repetidos en tándem. Este DNA, que es muy polimórfico, se ha utilizado como marcador molecular cuando la secuencia del motivo repetido se clona y secuencia para usarla en el análisis de poblaciones. De esta manera se han estudiado con éxito numerosos árboles, aunque en algunos se ha visto que los microsatélites son menos variables de lo que se esperaba. Otras siglas para designar esta técnica son ISSR, IMA, ISA, IRA, y RAMP.
- EST (Sitios etiquetados por la expresión), descrita en 1991. Su particularidad proviene del hecho que los oligonucleótidos se han deducido a partir de cDNA parcial o completamente secuenciado. Curiosamente el polimorfismo sólo se observa claramente cuando los fragmentos amplificados se cortan con enzimas de restricción, lo que hace que el método sea realmente costoso en tiempo y dinero.
- CAPS (Secuencia polimórfica amplificada y cortada), descrita en 1993. Los fragmentos amplificados se someten a una restricción enzimática y se migra en un gel de agarosa. Las variaciones se detectan por presencia o ausencia de sitios de restricción. Se pueden así localizar cambios finos en una zona específica.
- SCAR (Regiones amplificadas caracterizadas y secuenciadas), descrita en 1993. Esta técnica aprovecha que las RAPD proporcionan principalmente fragmentos de DNA altamente repetido. Estos fragmentos de RAPD se clonan y secuencian para elaborar oligonucleótidos específicos. Aunque permite el desarrollo rápido de marcadores moleculares, el grado de polimorfismo obtenido es bastante bajo.
- D/TGGE (Geles de electroforesis en gradiente desnaturalizante/térmico), descrita en 1987. Analiza el polimorfismo a través de la estabilidad, a distintas condiciones Desnaturalizantes o Temperaturas, del DNA amplificado. Su principal problema reside en las dificultades técnicas para manetener estables las condiciones experimentales.
- SSCP (Polimorfismo de conformaciones monocatenarias), descrita en 1989. Esta técnica se basa en el análisis del polimorfismo a través de las diferencias conformacionales de fragmentos de DNA monocatenario. Las distintas conformaciones son detectables como un cambio de movilidad en geles de poliacrilamida no desnaturalizante. Es especialmente útil cuando las reacciones de PCR producen bandas de DNA de gran tamaño (en general superior a 1?5 kpb) o bien bandas de tamaño muy próximo. Puede llegar a distinguir cambios de pocos nucleótidos en una secuencia de más de 1 kpb. Se está utilizando para caracterizar árboles de interés forestal.
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