El origen de la musculatura vascular
Arterias y venas, los grandes vasos del organismo, están formados por un revestimiento endotelial en contacto directo con la sangre, una capa más o menos gruesa de células musculares lisas (la túnica media), y una capa de tejido conectivo rica en matriz extracelular fibrosa (la túnica adventicia). En los capilares, el endotelio está recubierto por células más o menos conectadas entre sí, denominadas pericitos. Los pericitos comparten con las células musculares lisas bastantes características, entre ellas la de una cierta capacidad contráctil.
Células musculares lisas y pericitos (las llamaremos células murales en lo sucesivo) desempeñan una importante función estructural, evitando la deformación o rotura de unos vasos sometidos a la presión sanguínea. Este hecho está dramáticamente ilustrado, en el momento de escribir estas líneas, por el aneurisma disecante sufrido por el cantante Carlos Cano, una ruptura en la pared de la aorta con gravísimas consecuencias. Además, la capacidad contráctil de estas células contribuyen a la regulación del riego sanguíneo local y de la presión arterial, nos hacen "ponernos colorados" o palidecer, aumentan el flujo de sangre al tubo digestivo después de una buena comida o mantienen constante el aporte sanguíneo al cerebro.
Además de estas dos funciones básicas, en los últimos años se va comprendiendo que las células murales desempeñan también papeles fundamentales para la diferenciación y supervivencia de las células endoteliales. En ocasiones, cuando se habla de la necesidad de promover la angiogénesis (el crecimiento vascular) en relación al tratamiento de la isquemia cardiaca, se enfoca la cuestión exclusivamente sobre el endotelio. De esta forma se olvida que dicho endotelio necesita de células murales para ser completamente funcional. Es bien conocido que las células murales producen VEGF (vascular endothelial growth factor) y angiopoyetina-1, factores de crecimiento que son ligandos, respectivamente, de los receptores endoteliales VEGFR-2 (también llamado Flk-1) y Tie-2. Estas interacciones son esenciales para la supervivencia del endotelio. Por otro lado, las células endoteliales producen el homodímero PDGF-BB (platelet-derived growth factor), induciendo así el reclutamiento de células mesenquimáticas indiferenciadas y su diferenciación a células musculares lisas. Esta propiedad queda bien ilustrada por los ratones genéticamente deficientes en PDGF-B, que mueren al nacer mostrando importantes anomalías en los vasos, dilataciones y hemorragias [Leveen et al., Genes Dev, 8:1875-1887 (1994)].
Esta última observación sugiere que un vaso en desarrollo o en crecimiento puede "obtener" sus células murales directamente de precursores indiferenciados presentes en su entorno, y así parece ocurrir en muchos casos. No obstante, también se está comprobando que las células murales pueden tener otros orígenes, en ocasiones sorprendentemente diversos. El caso más clásico es el de la cresta neural. En efecto, las células de la cresta neural, que migran desde los márgenes de la placa neural durante la formación del tubo nervioso, revisten los arcos aórticos durante su desarrollo. Los arcos aórticos son los derivados de los grandes vasos branquiales en los peces, aunque sólo algunos persisten en el mamífero adulto formando, por ejemplo, el cayado aórtico, las arterias pulmonares y parte de las arterias carótidas. Pues bien, la musculatura lisa de todos estos vasos deriva de la cresta neural. Otro curioso ejemplo es la derivación de músculo liso vascular a partir de precursores que se diferencian del epitelio celómico, como sucede con las arterias coronarias [Vrancken Peeters et al., Anat Embryol 199: 367-378 (1999)] y con la aorta en el tramo posterior al cayado aórtico [Pérez-Pomares et al., Histochem J, 31:771-779 (1999)]. Por último, no podemos olvidar que también se ha descrito la diferenciación de células musculares lisas a partir del propio endotelio, por un proceso que podría tener un interés clínico. En efecto, este podría ser uno de los factores que expliquen el origen del exceso de células musculares lisas en las lesiones ateroscleróticas que reducen la luz de las arterias.
En suma, las células musculares lisas que acompañan a los vasos pueden tener un origen muy diverso, pero faltaba una sugestiva posibilidad, que se acaba de describir. Un origen común de endotelio y células murales a partir de un mismo progenitor indiferenciado, en respuesta a diferentes factores de crecimiento [Yamashita et al.,Nature, 408:92-96 (2000)].
En efecto, un equipo japonés ha cultivado células madre embrionarias y han purificado, mediante citometría de flujo, una subpoblación caracterizada por la expresión del receptor VEGFR-2. Dado lo que comentábamos antes, podría pensarse que estas células son precursores de los linajes hematopoyético y/o endotelial, pero los autores del trabajo no detectan en sus células purificadas ningún marcador específico de estos linajes. Cuando estas células se cultivan en presencia de suero, más del 95% se hacen positivas para anticuerpos contra la a-actina de células musculares lisas. En cambio, cuando se añade al medio de cultivo VEGF, aparecen hojas epiteliales con marcadores endoteliales como cadherina-5, PECAM (platelet endothelial cell adhesion molecule), el antígeno CD34 o el receptor de la lipoproteína de baja densidad acetilada. Estas capas de endotelio aparecen rodeadas por células que tienen todo el aspecto y los marcadores de las células musculares lisas. Si las células se cultivan sin suero, pero con PDGF-BB, se produce una diferenciación generalizada en células musculares lisas. Experimentos de dilución limitante, que producen colonias derivadas de una sola célula, muestran que ambos tipos celulares, endotelio y músculo liso, están presentes en dichas colonias y por tanto derivan de un mismo precursor.
Otros experimentos imitan más las condiciones en que probablemente se encuentran estos precursores in vivo. Por ejemplo, agregados formados por varios cientos de células madre VEGFR-2+, cultivados sobre geles de colágeno en presencia de suero y VEGF, dieron lugar a túbulos formados por células endoteliales recubiertos por células murales. Por si fuera poco, ¡dichos túbulos contenían células sanguíneas! Es decir, todos los elementos que forman el sistema circulatorio pueden ser derivadosin vitro a partir de una población homogénea de células madre embrionarias. Por último, la inyección directa de las células madre de ratón purificadas y marcadas (mediante la expresión del gen reporter LacZ) en el torrente circulatorio de embriones de pollo permitió obtener células marcadas en los vasos del receptor, tanto en el endotelio como en la túnica media.
Se trata, por tanto de la primera ocasión en la que todos los elementos que conforman el sistema vascular son obtenidos a partir de células pluripotentes embrionarias, dependiendo tan sólo de la combinación de factores de crecimiento presentes en el cultivo. El descubrimiento permitirá avanzar en el conocimiento de los mecanismos moleculares que regulan la diferenciación de estos elementos, y abre caminos para progresos insospechados en el campo de la ingeniería tisular.
Células musculares lisas y pericitos (las llamaremos células murales en lo sucesivo) desempeñan una importante función estructural, evitando la deformación o rotura de unos vasos sometidos a la presión sanguínea. Este hecho está dramáticamente ilustrado, en el momento de escribir estas líneas, por el aneurisma disecante sufrido por el cantante Carlos Cano, una ruptura en la pared de la aorta con gravísimas consecuencias. Además, la capacidad contráctil de estas células contribuyen a la regulación del riego sanguíneo local y de la presión arterial, nos hacen "ponernos colorados" o palidecer, aumentan el flujo de sangre al tubo digestivo después de una buena comida o mantienen constante el aporte sanguíneo al cerebro.
Además de estas dos funciones básicas, en los últimos años se va comprendiendo que las células murales desempeñan también papeles fundamentales para la diferenciación y supervivencia de las células endoteliales. En ocasiones, cuando se habla de la necesidad de promover la angiogénesis (el crecimiento vascular) en relación al tratamiento de la isquemia cardiaca, se enfoca la cuestión exclusivamente sobre el endotelio. De esta forma se olvida que dicho endotelio necesita de células murales para ser completamente funcional. Es bien conocido que las células murales producen VEGF (vascular endothelial growth factor) y angiopoyetina-1, factores de crecimiento que son ligandos, respectivamente, de los receptores endoteliales VEGFR-2 (también llamado Flk-1) y Tie-2. Estas interacciones son esenciales para la supervivencia del endotelio. Por otro lado, las células endoteliales producen el homodímero PDGF-BB (platelet-derived growth factor), induciendo así el reclutamiento de células mesenquimáticas indiferenciadas y su diferenciación a células musculares lisas. Esta propiedad queda bien ilustrada por los ratones genéticamente deficientes en PDGF-B, que mueren al nacer mostrando importantes anomalías en los vasos, dilataciones y hemorragias [Leveen et al., Genes Dev, 8:1875-1887 (1994)].
Esta última observación sugiere que un vaso en desarrollo o en crecimiento puede "obtener" sus células murales directamente de precursores indiferenciados presentes en su entorno, y así parece ocurrir en muchos casos. No obstante, también se está comprobando que las células murales pueden tener otros orígenes, en ocasiones sorprendentemente diversos. El caso más clásico es el de la cresta neural. En efecto, las células de la cresta neural, que migran desde los márgenes de la placa neural durante la formación del tubo nervioso, revisten los arcos aórticos durante su desarrollo. Los arcos aórticos son los derivados de los grandes vasos branquiales en los peces, aunque sólo algunos persisten en el mamífero adulto formando, por ejemplo, el cayado aórtico, las arterias pulmonares y parte de las arterias carótidas. Pues bien, la musculatura lisa de todos estos vasos deriva de la cresta neural. Otro curioso ejemplo es la derivación de músculo liso vascular a partir de precursores que se diferencian del epitelio celómico, como sucede con las arterias coronarias [Vrancken Peeters et al., Anat Embryol 199: 367-378 (1999)] y con la aorta en el tramo posterior al cayado aórtico [Pérez-Pomares et al., Histochem J, 31:771-779 (1999)]. Por último, no podemos olvidar que también se ha descrito la diferenciación de células musculares lisas a partir del propio endotelio, por un proceso que podría tener un interés clínico. En efecto, este podría ser uno de los factores que expliquen el origen del exceso de células musculares lisas en las lesiones ateroscleróticas que reducen la luz de las arterias.
En suma, las células musculares lisas que acompañan a los vasos pueden tener un origen muy diverso, pero faltaba una sugestiva posibilidad, que se acaba de describir. Un origen común de endotelio y células murales a partir de un mismo progenitor indiferenciado, en respuesta a diferentes factores de crecimiento [Yamashita et al.,Nature, 408:92-96 (2000)].
En efecto, un equipo japonés ha cultivado células madre embrionarias y han purificado, mediante citometría de flujo, una subpoblación caracterizada por la expresión del receptor VEGFR-2. Dado lo que comentábamos antes, podría pensarse que estas células son precursores de los linajes hematopoyético y/o endotelial, pero los autores del trabajo no detectan en sus células purificadas ningún marcador específico de estos linajes. Cuando estas células se cultivan en presencia de suero, más del 95% se hacen positivas para anticuerpos contra la a-actina de células musculares lisas. En cambio, cuando se añade al medio de cultivo VEGF, aparecen hojas epiteliales con marcadores endoteliales como cadherina-5, PECAM (platelet endothelial cell adhesion molecule), el antígeno CD34 o el receptor de la lipoproteína de baja densidad acetilada. Estas capas de endotelio aparecen rodeadas por células que tienen todo el aspecto y los marcadores de las células musculares lisas. Si las células se cultivan sin suero, pero con PDGF-BB, se produce una diferenciación generalizada en células musculares lisas. Experimentos de dilución limitante, que producen colonias derivadas de una sola célula, muestran que ambos tipos celulares, endotelio y músculo liso, están presentes en dichas colonias y por tanto derivan de un mismo precursor.
Otros experimentos imitan más las condiciones en que probablemente se encuentran estos precursores in vivo. Por ejemplo, agregados formados por varios cientos de células madre VEGFR-2+, cultivados sobre geles de colágeno en presencia de suero y VEGF, dieron lugar a túbulos formados por células endoteliales recubiertos por células murales. Por si fuera poco, ¡dichos túbulos contenían células sanguíneas! Es decir, todos los elementos que forman el sistema circulatorio pueden ser derivadosin vitro a partir de una población homogénea de células madre embrionarias. Por último, la inyección directa de las células madre de ratón purificadas y marcadas (mediante la expresión del gen reporter LacZ) en el torrente circulatorio de embriones de pollo permitió obtener células marcadas en los vasos del receptor, tanto en el endotelio como en la túnica media.
Se trata, por tanto de la primera ocasión en la que todos los elementos que conforman el sistema vascular son obtenidos a partir de células pluripotentes embrionarias, dependiendo tan sólo de la combinación de factores de crecimiento presentes en el cultivo. El descubrimiento permitirá avanzar en el conocimiento de los mecanismos moleculares que regulan la diferenciación de estos elementos, y abre caminos para progresos insospechados en el campo de la ingeniería tisular.
Resistencia a citostáticos mediada por topoisomerasas
La resistencia oncológica a drogas citotóxicas se considera una de las mayores causas de fallo clínico de la quimioterapia (Perez et al., 1993, Cancer, 71:1571-1580). Casi el 50 % de los pacientes con cáncer presentan tumores que son resistentes a los fármacos empleados, los cuales han desarrollado resistencia durante el curso del tratamiento a pesar de haber presentado respuesta inicial al mismo (Kirschner et al., 1992, Biochem Pharmacol, 43:77-87). Se estima que la resistencia a drogas contribuye a más del 90 % de las muertes por cáncer (Lum et al., 1993, Cancer, 72:3502-3514).
El ADN es el objetivo mayoritario para los agentes antineoplásicos usados en quimioterapia. Una vez que la droga ha alcanzado el citoplasma, se expone a diferentes mecanismos de detoxificación. Algunos de ellos siempre están presentes en el citoplasma, mientras que otros son inducidos por la presencia de la droga. Incluso cuando el agente citostático ha alcanzado su último objetivo y ha provocado daño en el ADN, algunas células son resistentes a causa de la gran capacidad de reparación de ese daño (Masters, 1990, Radiotherapy and Oncology, 19:297-305).
La topoisomerasa II es una enzima esencial para la replicación y transcripción del ADN, así como para la recombinación y segregación cromosómica (Wang, 1985, Ann Rev Biochem, 54: 664-697). Esta enzima hace posible el acceso al ADN mediante rotura y reparación de la doble cadena. Es la proteína homóloga a la ADN girasa bacteriana y está constituida por un homodímero de 170 kDa (Harris y Hochhauser, 1992, Acta Oncologica, 31:205-213). La topoisomerasa I actúa de forma similar sobre el ADN monocatenario. La topoisomerasa II actúa produciéndo roturas en la cadena de ADN bicatenario, uniéndose covalentemente al extremo 5' de la rotura. Las roturas están sujetas por 4 pares de bases en la cadena opuesta y la proteína se une como un dímero. Posteriormente, se produce el paso de la cadena de ADN por la rotura, con cambios en el superenrollamiento y relajación de la hebra, (este estado se conoce como complejo hendible). Seguidamente, se produce la liberación parcial de la cadena (Liu, 1989, Ann Rev Biochem, 58:351-375).
Las drogas que interaccionan con topoisomerasa II, son adriamicina, daunorubicina, ellipticina, VP16, mAMSA, VM26, actinomicina D y mitoxantrone. Existe un grupo de agentes no intercaladores que se unen directamente a la topoisomerasa II, siendo los más importantes el tenipósido (VP26) y el etopósido (VP16). Se ha podido comprobar que las topoisomerasas están relacionadas con el fenómeno de resistencia a múltiples drogas (MDR) (Harris y Hochhauser, 1992, Acta Oncologica, 31:205-213).
Las drogas estabilizan el complejo hendible atrapando a la topoisomerasa II sobre el ADN y matando la célula. Cada tipo de fármaco produce un espectro diferente de complejos hendibles en zonas diferentes del ADN. Casi todos los agentes que inhiben la topoisomerasa aumentan el número de enzima asociado a las roturas de la cadena de ADN, aunque esto no siempre se correlaciona con la citotoxicidad ya que las drogas pueden tener otros mecanismos de acción. Parece ser que un mecanismo común de acción puede ser la inhibición de la capacidad de la enzima para unir la cadena de ADN cortada (Robinson y Osheroff, 1990, Biochemistry, 29:2511-2515).
La muerte celular inducida por la droga antineoplásica es proporcional al nivel de topoisomerasa II; mientras más enzima hay mayor es la toxicidad. No es sorprendente que la resistencia en algunos modelos experimentales se deba a unos niveles muy reducidos de topoisomerasa II y/o I (Brian et al., 1993, Cancer suppl, 72:3484-3488).
La mayor actividad topoisomerasa II en tejidos normales se ha encontrado en timo y bazo. En tumores los valores más altos se han detectado en cáncer de mama y leiomiosarcoma.
Regulación de la topoisomerasa II
La topoisomerasa II se expresa principalmente durante la fase proliferativa de crecimiento. La cantidad de enzima se incrementa al inicio de la replicación del ADN y continúa incrementándose durante las fases S y G2 hasta alcanzar sus valores máximos al final de G2-M, para posteriormente disminuir al final de la mitosis. La importancia de la regulación de la topoisomerasa II durante el ciclo celular estriba en conocer cuál es la fase más sensible para los inhibidores de esta enzima. Tras la estimulación de células BALB-c 3T3 con suero, las células activas proliferativamente muestran una mayor sensibilidad al etopósido que las células quiescentes. El incremento en sensibilidad a la droga comienza durante la fase S y alcanza el máximo justo antes de la mitosis. Sin embargo, aunque el nivel máximo de topoisomerasa II asociada a roturas en la cadena de ADN se produce durante G2, la citotoxicidad es máxima durante la fase S, sugiriendo que las interacciones con otros mecanismos conducen a la muerte celular (Chow y Ross, 1987, Mol Cell Biol, 7:3119-3123). La modulación de la actividad topoisomerasa II durante el ciclo celular involucra procesos de fosforilación. Esta afirmación se ha demostrado para caseín quinasas y para la proteína quinasa C. Estos cambios pueden ser cruciales en la activación de la actividad topoisomerasa. La fosforilación produce un aumento de 3 veces en la actividad de la enzima y la desfosforilación la inactiva. Se ha visto que los mayores niveles de fosforilación se producen en G2 y M (Heck et al., 1989, J Biol Chem, 264:15161-15164).
Topoisomerasa II y resistencia a citostáticos
En numerosas líneas celulares se ha observado la existencia de un fenotipo atípico de resistencia a múltiples drogas. Estas células presentan resistencia cruzada a todos los citostáticos anti topoisomerasa II, excepto a los alcaloides de la vinca (Harris y Hochhauser, 1992, Acta Oncologica, 31:205-213).
Estos mecanismos pueden incluir:
Mutaciones y topoisomerasas anormales.- Las roturas en el ADN producidas por mAMSA o etopósido tienen un absoluto requerimiento por el ATP, al contrario de lo que sucede en las células de la cepa silvestre. En las células resistentes se ha encontrado un nuevo polimorfismo de enzimas de restricción. Una mutación en el punto de unión al ATP parece ser el responsable de la inducción de resistencia al mAMSA en la topoisomerasa de ADN del bacteriófago T4 (Huff et al., 1990, Mol Gen Genet, 221:27-32). Varios estudios han demostrado la existencia de formas de topoisomerasa II funcionalmente anormales en células resistentes a drogas (Harris y Hochhauser, 1992, Acta Oncologica, 31:205-213).
Metilación.- Varios estudios han demostrado la existencia de puntos hipermetilados. Esto puede ser de importancia en la regulación de la transcripción de alelos no mutantes (Tan et al., 1989, JNCI, 81:1732-1735).
Deprivación de glucosa e hipoxia.- Estos factores pueden ser relevantes en la masa tumoral y contribuyen hacia una disminución en la expresión de topoisomerasa.
Factores citosólicos.- Una variedad de actividades enzimáticas antioxidantes se incrementan en células resistentes, incluyendo glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa, glutatión peroxidasa y catalasa. Estas enzimas pueden inactivar los radicales libres formados por la acción de algunas drogas.
Hiperregulación de topoisomerasa I.- La topoisomerasa I es una enzima, involucrada en la transcripción, que produce roturas en el ADN monocatenario. Esta enzima puede incrementar su actividad como efecto compensatorio con la subregulación de la topoisomerasa II y puede ser capaz de realizar la función de ésta, al menos parcialmente, cuando se encuentra subregulada.
Topoisomerasa IIb- Se ha comprobado la existencia, en células de leucemia P388 resistentes a mAMSA, de otra forma de topoisomerasa II de 180 kDa que difiere en varios aspectos a la forma conocida de 170 kDa (topoisomerasa IIa). Esta nueva forma enzimática difiere en la expresión a través del ciclo celular y en la sensibilidad a drogas. Los niveles de topoisomerasa IIb alcanzan el pico máximo durante G1 y caen durante el resto del ciclo celular. La topoisomerasa IIa se expresa en células de proliferación rápida y su tasa se incrementa al compararla con la topoisomerasa IIb, en células transfectadas NIH 3T3 (Chung et al., 1989, Proc Natl Acad Sci USA, 86:9431-9435).
En conclusión, la expresión y regulación de topoisomerasas en células tumorales es un factor a tener en cuenta en la respuesta de los tumores a los agentes antineoplásicos y en el desarrollo de resistencia a la quimioterapia.
El ADN es el objetivo mayoritario para los agentes antineoplásicos usados en quimioterapia. Una vez que la droga ha alcanzado el citoplasma, se expone a diferentes mecanismos de detoxificación. Algunos de ellos siempre están presentes en el citoplasma, mientras que otros son inducidos por la presencia de la droga. Incluso cuando el agente citostático ha alcanzado su último objetivo y ha provocado daño en el ADN, algunas células son resistentes a causa de la gran capacidad de reparación de ese daño (Masters, 1990, Radiotherapy and Oncology, 19:297-305).
La topoisomerasa II es una enzima esencial para la replicación y transcripción del ADN, así como para la recombinación y segregación cromosómica (Wang, 1985, Ann Rev Biochem, 54: 664-697). Esta enzima hace posible el acceso al ADN mediante rotura y reparación de la doble cadena. Es la proteína homóloga a la ADN girasa bacteriana y está constituida por un homodímero de 170 kDa (Harris y Hochhauser, 1992, Acta Oncologica, 31:205-213). La topoisomerasa I actúa de forma similar sobre el ADN monocatenario. La topoisomerasa II actúa produciéndo roturas en la cadena de ADN bicatenario, uniéndose covalentemente al extremo 5' de la rotura. Las roturas están sujetas por 4 pares de bases en la cadena opuesta y la proteína se une como un dímero. Posteriormente, se produce el paso de la cadena de ADN por la rotura, con cambios en el superenrollamiento y relajación de la hebra, (este estado se conoce como complejo hendible). Seguidamente, se produce la liberación parcial de la cadena (Liu, 1989, Ann Rev Biochem, 58:351-375).
Las drogas que interaccionan con topoisomerasa II, son adriamicina, daunorubicina, ellipticina, VP16, mAMSA, VM26, actinomicina D y mitoxantrone. Existe un grupo de agentes no intercaladores que se unen directamente a la topoisomerasa II, siendo los más importantes el tenipósido (VP26) y el etopósido (VP16). Se ha podido comprobar que las topoisomerasas están relacionadas con el fenómeno de resistencia a múltiples drogas (MDR) (Harris y Hochhauser, 1992, Acta Oncologica, 31:205-213).
Las drogas estabilizan el complejo hendible atrapando a la topoisomerasa II sobre el ADN y matando la célula. Cada tipo de fármaco produce un espectro diferente de complejos hendibles en zonas diferentes del ADN. Casi todos los agentes que inhiben la topoisomerasa aumentan el número de enzima asociado a las roturas de la cadena de ADN, aunque esto no siempre se correlaciona con la citotoxicidad ya que las drogas pueden tener otros mecanismos de acción. Parece ser que un mecanismo común de acción puede ser la inhibición de la capacidad de la enzima para unir la cadena de ADN cortada (Robinson y Osheroff, 1990, Biochemistry, 29:2511-2515).
La muerte celular inducida por la droga antineoplásica es proporcional al nivel de topoisomerasa II; mientras más enzima hay mayor es la toxicidad. No es sorprendente que la resistencia en algunos modelos experimentales se deba a unos niveles muy reducidos de topoisomerasa II y/o I (Brian et al., 1993, Cancer suppl, 72:3484-3488).
La mayor actividad topoisomerasa II en tejidos normales se ha encontrado en timo y bazo. En tumores los valores más altos se han detectado en cáncer de mama y leiomiosarcoma.
Regulación de la topoisomerasa II
La topoisomerasa II se expresa principalmente durante la fase proliferativa de crecimiento. La cantidad de enzima se incrementa al inicio de la replicación del ADN y continúa incrementándose durante las fases S y G2 hasta alcanzar sus valores máximos al final de G2-M, para posteriormente disminuir al final de la mitosis. La importancia de la regulación de la topoisomerasa II durante el ciclo celular estriba en conocer cuál es la fase más sensible para los inhibidores de esta enzima. Tras la estimulación de células BALB-c 3T3 con suero, las células activas proliferativamente muestran una mayor sensibilidad al etopósido que las células quiescentes. El incremento en sensibilidad a la droga comienza durante la fase S y alcanza el máximo justo antes de la mitosis. Sin embargo, aunque el nivel máximo de topoisomerasa II asociada a roturas en la cadena de ADN se produce durante G2, la citotoxicidad es máxima durante la fase S, sugiriendo que las interacciones con otros mecanismos conducen a la muerte celular (Chow y Ross, 1987, Mol Cell Biol, 7:3119-3123). La modulación de la actividad topoisomerasa II durante el ciclo celular involucra procesos de fosforilación. Esta afirmación se ha demostrado para caseín quinasas y para la proteína quinasa C. Estos cambios pueden ser cruciales en la activación de la actividad topoisomerasa. La fosforilación produce un aumento de 3 veces en la actividad de la enzima y la desfosforilación la inactiva. Se ha visto que los mayores niveles de fosforilación se producen en G2 y M (Heck et al., 1989, J Biol Chem, 264:15161-15164).
Topoisomerasa II y resistencia a citostáticos
En numerosas líneas celulares se ha observado la existencia de un fenotipo atípico de resistencia a múltiples drogas. Estas células presentan resistencia cruzada a todos los citostáticos anti topoisomerasa II, excepto a los alcaloides de la vinca (Harris y Hochhauser, 1992, Acta Oncologica, 31:205-213).
Estos mecanismos pueden incluir:
Mutaciones y topoisomerasas anormales.- Las roturas en el ADN producidas por mAMSA o etopósido tienen un absoluto requerimiento por el ATP, al contrario de lo que sucede en las células de la cepa silvestre. En las células resistentes se ha encontrado un nuevo polimorfismo de enzimas de restricción. Una mutación en el punto de unión al ATP parece ser el responsable de la inducción de resistencia al mAMSA en la topoisomerasa de ADN del bacteriófago T4 (Huff et al., 1990, Mol Gen Genet, 221:27-32). Varios estudios han demostrado la existencia de formas de topoisomerasa II funcionalmente anormales en células resistentes a drogas (Harris y Hochhauser, 1992, Acta Oncologica, 31:205-213).
Metilación.- Varios estudios han demostrado la existencia de puntos hipermetilados. Esto puede ser de importancia en la regulación de la transcripción de alelos no mutantes (Tan et al., 1989, JNCI, 81:1732-1735).
Deprivación de glucosa e hipoxia.- Estos factores pueden ser relevantes en la masa tumoral y contribuyen hacia una disminución en la expresión de topoisomerasa.
Factores citosólicos.- Una variedad de actividades enzimáticas antioxidantes se incrementan en células resistentes, incluyendo glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa, glutatión peroxidasa y catalasa. Estas enzimas pueden inactivar los radicales libres formados por la acción de algunas drogas.
Hiperregulación de topoisomerasa I.- La topoisomerasa I es una enzima, involucrada en la transcripción, que produce roturas en el ADN monocatenario. Esta enzima puede incrementar su actividad como efecto compensatorio con la subregulación de la topoisomerasa II y puede ser capaz de realizar la función de ésta, al menos parcialmente, cuando se encuentra subregulada.
Topoisomerasa IIb- Se ha comprobado la existencia, en células de leucemia P388 resistentes a mAMSA, de otra forma de topoisomerasa II de 180 kDa que difiere en varios aspectos a la forma conocida de 170 kDa (topoisomerasa IIa). Esta nueva forma enzimática difiere en la expresión a través del ciclo celular y en la sensibilidad a drogas. Los niveles de topoisomerasa IIb alcanzan el pico máximo durante G1 y caen durante el resto del ciclo celular. La topoisomerasa IIa se expresa en células de proliferación rápida y su tasa se incrementa al compararla con la topoisomerasa IIb, en células transfectadas NIH 3T3 (Chung et al., 1989, Proc Natl Acad Sci USA, 86:9431-9435).
En conclusión, la expresión y regulación de topoisomerasas en células tumorales es un factor a tener en cuenta en la respuesta de los tumores a los agentes antineoplásicos y en el desarrollo de resistencia a la quimioterapia.
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