INTRODUCCIÓN AL ESTUDIO DE LOS ENZIMAS.
Gran parte de la historia de la Bioquímica discurre pareja a la historia de la investigación de los enzimas. Citaremos algunos hitos importantes:
-La existencia de catalizadores biológicos fue descrita por primera vez a comienzos del S. XIX en estudios acerca de la digestión de la carne por secreciones del estómago y la conversión del almidón en azúcar por la saliva.
-En 1835 la primera teoría general sobre la catálisis química publicada por J.J. Berzelius incluía un ejemplo de lo que hoy conocemos como un enzima: la diastasa de la malta, señalando que la hidrólisis del almidón se catalizaba más eficazmente por ésta que por el ácido sulfúrico.
-En 1860 Louis Pasteur propuso que la fermentación del azúcar para transformarse en alcohol era inducida por ciertos catalizadores biológicos, razón por la cual los enzimas fueron llamados inicialmente "fermentos". Pasteur supuso que dichos catalizadores se hallaban unidos de modo indisoluble a la estructura de las células de la levadura por lo que no podían actuar fuera de estas.
-En 1877 se utiliza por primera vez la denominación "enzima" (etimológicamente "en la levadura").
-En 1897 E. Büchner consiguió extraer de las células de la levadura los enzimas que catalizan la fermentación alcohólica, demostrando que éstos pueden actuar independientemente de la estructura celular. Este hecho permitió estudiar "in vitro" la actividad y propiedades de los enzimas, aislarlos en estado puro y analizar su composición.
-En 1926 J.B. Sumner aisló un enzima, la ureasa, en forma cristalina pura y demostró que los cristales estaban formados por proteínas.
-Entre 1930 y 1936 se aislaron en forma cristalina pura diversos enzimas quedando establecida de modo definitivo la naturaleza proteica de estos catalizadores biológicos. Desde entonces se han identificado varios miles de enzimas diferentes, habiéndose aislado muchos de ellos en forma cristalina.
-En el mismo período J.B.S. Haldane expuso la idea de que los enzimas establecen interacciones débiles con el sustrato para distorsionarlo y catalizar así su transformación; esta idea resultó capital para el moderno conocimiento de la acción enzimática.
-En 1981 se descubrió que determinados tipos de RNA pueden catalizar su propia síntesis, hecho este que obligó a revisar algunas de las ideas preexistentes acerca de la naturaleza de los biocatalizadores.
En la actualidad se considera que, con la excepción de un reducido grupo de moléculas de RNA con propiedades catalíticas, los enzimas son proteínas, y como tales, exhiben todas las propiedades inherentes a este grupo de biomoléculas. Los pesos moleculares de las proteínas enzimáticas oscilan desde unos 12.000 daltons hasta más de un millón.
En muchos casos, las cadenas polipeptídicas de la proteína enzimática son suficientes para que ésta desarrolle su actividad catalítica. En otros, se hace necesaria la participación de un compuesto químico adicional, de naturaleza no proteica, denominado cofactor.
3.-ESTRUCTURA DE LOS ENZIMAS: EL CENTRO ACTIVO.
Los enzimas, en cuanto que proteínas, presentan todos los rasgos estructurales y propiedades químicas que caracterizan a esta notable clase de biomoléculas. En efecto, se ha podido comprobar que los enzimas pierden su actividad catalítica cuando sufren desnaturalización por efecto de los mismos agentes que afectan a las demás proteínas; la conformación tridimensional nativa intacta de la proteína enzimática resulta indispensable para que ésta desempeñe su función. Además, los enzimas, al igual que otras muchas clases de proteínas, presentan un centro activo a través del cual interactúan con la(s) molécula(s) de ligando, que en este caso recibe(n) el nombre de sustrato(s), mediante un acoplamiento espacial (las superficies moleculares de ambos tienen formas complementarias) y químico (grupos funcionales complementarios del enzima y el (los) sustrato(s) establecen diferentes tipos de interacciones débiles entre sí). Tanto la actividad catalítica como el elevado grado de especificidad química que presentan los enzimas residen en esta interacción específica entre el enzima y su sustrato.
El centro activo es una cavidad existente en la superficie del enzima que está forrada interiormente por una serie de restos de aminoácidos (Figura 14.2). Por regla general los aminoácidos que forman parte del centro activo no se encuentran contiguos en la cadena polipeptídica, sino ocupando posiciones a veces muy alejadas en la misma. El hecho de que estos aminoácidos coincidan próximos entre sí sobre el centro activo no es más que una consecuencia del plegamiento característico de la cadena polipeptídica, es decir, de la conformación tridimensional nativa de la proteína enzimática. Puede resultar útil, aunque no siempre posible, distinguir entre los aminoácidos que forman parte del centro activo dos categorías:
a)Aminoácidos catalíticos.- Son uno o más aminoácidos cuyas cadenas laterales R poseen unas peculiaridades químicas tales que los facultan para desarrollar una función catalítica. Constituyen el verdadero centro catalítico del enzima.
b)Aminoácidos de unión.- Son una serie de aminoácidos cuyas cadenas laterales R poseen grupos funcionales que pueden establecer interacciones débiles (puentes de hidrógeno, interacciones iónicas, etc.) con grupos funcionales complementarios de la molécula de sustrato. Su función consiste en fijar la molécula de sustrato al centro activo en la posición adecuada para que los aminoácidos catalíticos puedan actuar (ver Figura 14.2).
En cuanto al resto de los aminoácidos de la cadena polipeptídica del enzima, los que no forman parte del centro activo, podría pensarse en principio que no desempeñan ninguna función, pero esto no es cierto; tienen la importante misión de mantener la conformación tridimensional catalíticamente activa del enzima; sin ella no existiría centro activo y el enzima no podría interactuar con su sustrato.
4.-CINÉTICA ENZIMÁTICA: EL COMPLEJO ENZIMA-SUSTRATO.
Los enzimas actúan de acuerdo con los mismos principios generales que los demás catalizadores: aumentan la velocidad de las reacciones químicas combinándose transitoriamente con los reactivos de manera que estos alcanzan un estado de transición con una energía de activación menor que el de la reacción no catalizada. Hay que destacar sin embargo que los enzimas son mucho más eficaces que cualquier catalizador artificial conocido. Se ha podido comprobar que los aumentos de velocidad que producen son de entre 107 y 1014 veces la velocidad de la reacción no catalizada. La actividad molecular(número de moléculas de sustrato transformadas por una sola molécula de enzima por minuto) de distintos enzimas oscila entre unos pocos miles y varios millones de moléculas de sustrato por minuto. Cabe preguntarse pues, cómo consiguen los enzimas aumentos tan espectaculares en la velocidad de las reacciones químicas que catalizan.
Los métodos experimentales para conocer la actividad catalítica de los enzimas son cada vez más complejos y sofisticados. Sin embargo, el método más antiguo utilizado en enzimología, desarrollado por Leonor Michaelis y Maud Menten (Figura 14.3), y que en la actualidad sigue siendo de gran utilidad, consiste en analizar como varía la velocidad de las reacciones catalizadas enzimáticamente en función de algunos parámetros experimentales como la concentración del sustrato o la del propio enzima, lo que globalmente se conoce con el nombre de cinética enzimática.
La cinética de las reacciones catalizadas por enzimas muestra un rasgo característico que no se observa en las reacciones no enzimáticas: la la saturación del enzima por el sustrato (ver Figura 14.4). Cuando se mide la velocidad inicial de una reacción catalizada enzimáticamente se observa que para concentraciones de sustrato bajas la velocidad de reacción es proporcional a dicha concentración, como ocurre con carácter general para las reacciones no enzimáticas. A medida que la concentración de sustrato aumenta la velocidad de reacción deja de ser proporcional a ésta. Con un aumento posterior la velocidad de reacción llega a ser totalmente independiente de la concentración del sustrato y se aproxima asimptóticamente a un valor máximo que es característico de cada enzima y que se conoce comovelocidad máxima. Se dice entonces que el enzima se halla saturado por el sustrato. La concentración de sustrato a la cual la reacción alcanza la mitad de su velocidad máxima se conoce con el nombre de KM (constante de Michaelis-Menten). KM es un valor característico de cada enzima y constituye una medida de la afinidad del enzima por el sustrato: valores bajos de KMindican una alta afinidad mientras que valores altos representan una baja afinidad.
El efecto de saturación del enzima por el sustrato condujo a los primeros investigadores de la cinética enzimática, incluso antes de que se conociera la naturaleza proteica de los enzimas, a formular la hipótesis, hoy corroborada, de que el enzima y el sustrato se combinan de modo transitorio para formar un complejo enzima-sustrato (Figura 14.5) en el que se alcanza el estado de transición con mayor probabilidad que en la reacción no catalizada. Una vez alcanzado dicho estado elcomplejo enzima-sustrato se descompone para dar lugar a los productos y el enzima libre.
El enzima, una vez liberado, puede combinarse con una nueva molécula de sustrato para formar un nuevo complejo enzima-sustrato cerrándose así el ciclo catalítico del enzima. De este modo, una sola molécula de enzima puede transformar en producto, en sucesivos ciclos catalíticos, a un elevado número de moléculas de sustrato, lo que contribuiría a explicar la gran eficacia catalítica que exhiben estas biomoléculas.
La hipótesis del complejo enzima-sustrato explica de modo satisfactorio el efecto de saturación del enzima por el sustrato observado en los estudios de cinética enzimática: cuando la concentración de sustrato es muy superior a la concentración del enzima en el medio de reacción, todos los centros activos de las moléculas de enzima se hallan ocupados en un momento dado por moléculas de sustrato, con lo que aumentos posteriores de la concentración de éste no se traducen en aumentos en la velocidad de reacción.
5.-CATÁLISIS ENZIMÁTICA: MECANISMOS.
La idea de que el enzima se combina transitoriamente con el sustrato para formar un complejo enzima-sustrato en el cual se alcanza más fácilmente el estado de transición de la reacción catalizada es la piedra angular de todas las explicaciones acerca del fenómeno de la catálisis enzimática. Sin embargo, esta idea no termina de explicar en su totalidad dicho fenómeno; ciertamente, responde a la pregunta de ¿qué hacen los enzimas? pero deja sin contestar otra pregunta esencial: ¿cómo lo hacen?
Una forma interesante de abordar este problema consiste en preguntarse de donde procede la energía necesaria para provocar los considerables descensos en la energía de activación asociados con las reacciones químicas enzimáticamente catalizadas. Si nos atenemos a las leyes termodinámicas, la cuantía de tales descensos debe ser energéticamente "pagada" de alguna manera, ya que la energía "no se crea ni se destruye". La respuesta a esta pregunta reside en la propia naturaleza de la interacción entre el enzima y el sustrato y en el concepto de energía de fijación. Como ya se apuntó anteriormente, la unión entre un enzima y su sustrato para formar el complejo enzima-sustrato se ve favorecida por la formación de una serie de interacciones débiles (puentes de hidrógeno, interacciones iónicas, etc) entre grupos funcionales complementarios de ambas moléculas. La formación de cada una de estas interacciones débiles va acompañada por la liberación de una pequeña cantidad de energía libre que contribuye a estabilizar el complejo. La suma de todas estas pequeñas cantidades de energía liberadas por la totalidad de las interacciones débiles formadas representa la energía de fijación. El papel que juega esta energía en la catálisis enzimática es de una importancia extraordinaria: la energía de fijación no se limita a producir una estabilización del complejo enzima-sustrato, sino que constituye la principal fuente de energía libre que los enzimas utilizan para rebajar la barrera de energía de activación y con ello aumentar la velocidad de la reacción catalizada.
Prosiguiendo con nuestro análisis sobre la naturaleza de la actividad catalítica de los enzimas trataremos ahora de averiguar de qué manera utilizan los enzimas la energía de fijación para producir catálisis. En primer lugar, el enzima puede fijar a las moléculas reaccionantes (sustratos) de manera que queden muy próximas entre sí sobre el centro activo y a su vez próximos a eventuales grupos catalíticos del propio enzima. En segundo lugar, el enzima fija a las moléculas reaccionantes de manera que quedan no sólo próximas entre sí, sino orientadas en la relación geométrica más favorable para que la reacción tenga lugar, es decir, con sus grupos funcionales reaccionantes enfrentados. Las colisiones al azar de moléculas reaccionantes en el medio de reacción son extremadamente improbables, y aún en el caso de producirse, la orientación de los grupos funcionales reaccionantes no será la más favorable en la mayor parte de los casos. Sin embargo, el centro activo del enzima, al fijar a los sustratos de manera energéticamente favorable mediante interacciones débiles, y al hacerlo con una orientación precisa, proporciona a éstos un "lugar de encuentro" idóneo para que se lleve a cabo la reacción.
La combinación de los factores de proximidad y orientación favorable de los sustratos sobre el centro activo explica por sí misma los incrementos de velocidad observados en algunas reacciones catalizadas enzimáticamente. Sin embargo, los enzimas todavía pueden utilizar la energía de fijación de un modo adicional para producir catálisis, a saber, provocando en la(s) molécula(s) de sustrato una distorsión favorable para que se alcance con prontitud el estado de transición. ¿Cómo consiguen los enzimas provocar tal distorsión en su(s) sustrato(s)? Para contestar a esta pregunta es necesario revisar algunos conceptos que hasta ahora hemos tratado de una manera quizás excesivamente dogmática. La elegante idea de que dos moléculas con superficies complementarias "encajan" tal y como lo harían "una llave y una cerradura" ha resultado extraordinariamente útil a la hora de explicar muchos procesos bioquímicos; sin embargo, esta idea puede resultar en cierto modo engañosa cuando se aplica a la catálisis enzimática. Un enzima que fuese exactamente complementario con su sustrato sería con toda probabilidad un pésimo enzima, puesto que estabilizaría al sustrato en lugar de inducir su transformación. Dicho de otro modo, el descenso de energía libre que acompañaría a la formación del complejo enzima-sustrato, gracias a la formación de múltiples interacciones débiles entre ambos, sumiría a éste en una especie de "pozo" energético del que le sería muy difícil salir. Este tipo de consideraciones teóricas, apoyadas en muchos casos por resultados experimentales, han conducido a los investigadores de la catálisis enzimática a afirmar que los enzimas no son exactamente complementarios con sus sustratos sino más bien con las especies del estado de transición, es decir, las interacciones débiles que se forman entre el enzima y su sustrato son óptimas en el estado de transición. Cuando el sustrato penetra en el centro activo del enzima se forman algunas interacciones débiles entre ambos; a partir de este momento, cualquier distorsión del sustrato tendente a alcanzar el estado de transición se verá acompañada por el establecimiento de interacciones débiles adicionales energéticamente favorables. Así, el coste energético que supone llevar al sustrato al estado de transición es "pagado" gracias al descenso de energía libre asociado con el establecimiento de dichas interacciones débiles (Figura 14.6). Una vez más, el concepto de energía de fijación resulta crucial para entender cómo los enzimas rebajan la barrera de energía de activación para aumentar la velocidad de una reacción química. Es conveniente resaltar el hecho de que la distorsión del sustrato a la que hemos hecho referencia no es sólo estructural, es decir, no afecta sólo a la forma de la molécula, ángulos o distancias de enlace, sino también electrónica: la formación de interacciones débiles puede provocar cambios en la distribución global de la carga eléctrica, aparición de cargas parciales donde antes no las había, etc.
La energía de fijación del sustrato al centro activo todavía puede suponer una fuente adicional de poder catalítico. La optimización de las interacciones débiles entre el sustrato y el enzima puede conducir no sólo a una distorsión estructural y electrónica del sustrato, sino también a una alteración en la conformación de la proteína enzimática. Tal alteración conformacional, conocida como encaje inducido, puede conllevar una aproximación de grupos catalíticos esenciales del enzima a los grupos funcionales del sustrato susceptibles de reaccionar, con lo que las propiedades catalíticas del enzima se habrán visto incrementadas. La vieja y en exceso rígida imagen de la "llave y la cerradura" para describir la interacción específica entre el sustrato y el centro activo del enzima, ha sido sustituida por una más flexible en la que dicha interacción se contempla más bien como la que tiene lugar entre "una mano y un guante", reflejando así el ajuste mutuo que tiene lugar entre ambos objetos.
El importante papel que juega la energía de fijación en la catálisis enzimática da respuesta, por añadidura, a otra vieja pregunta que se formulaban los primeros investigadores de la naturaleza y acción de los enzimas: ¿por qué los enzimas han de ser tan grandes con respecto a sus sustratos? En efecto: si la energía de fijación es la principal fuente de poder catalítico, el enzima debe ofrecer el mayor número posible de grupos funcionales capaces de establecer interacciones débiles con el sustrato, con el consiguiente aumento en el tamaño de la proteína enzimática.
Hasta aquí hemos podido comprobar que los enzimas utilizan con gran eficacia la energía de fijación como fuente principal de energía libre para producir catálisis. En muchos casos esta energía utilizada tal y como se ha descrito es suficiente para explicar los espectaculares aumentos en las velocidades de reacción que los enzimas son capaces de producir. No obstante, una vez fijado el sustrato, el enzima puede recurrir a formas adicionales de catálisis que no están basadas en la energía de fijación sino en el poder catalítico que poseen en sí mismos determinados grupos funcionales del centro activo. Estos grupos funcionales residen en los que hemos llamado anteriormente aminoácidos catalíticos y es su propia naturaleza química la que les permite funcionar como catalizadores. Aunque son múltiples los mecanismos según los cuales actúan estos grupos catalíticos, en general se pueden encuadrar en alguna de las dos siguientes modalidades:
a) Catálisis covalente.- Algunos enzimas se pueden combinar con el sustrato, a través de un grupo catalítico, para formar un intermediario covalente inestable que se descompone con facilidad para formar los productos.
b) Catálisis ácido-base.- La velocidad de algunas reacciones químicas se ve incrementada por la presencia de ácidos o bases en el medio de reacción. En estos casos, al proporcionar grupos funcionales capaces de actuar como dadores o aceptores de protones (carboxilo, amino, etc.), el enzima puede efectuar una catálisis general ácido-básica.
Los diferentes mecanismos que los enzimas ponen en juego para acelerar las reacciones químicas, unos basados en la energía de fijación , otros en la acción de grupos catalíticos específicos, no son mutuamente excluyentes. Cada enzima particular recurre a una determinada combinación de los diferentes mecanismos estudiados en la que pueden estar presentes todos o tan sólo algunos de ellos; la contribución específica que cada mecanismo aporta al hecho catalítico también es diferente según de qué enzima se trate. Todo parece indicar que, como regla general, los mecanismos basados en la energía de fijación son responsables en mayor medida de los aumentos en la velocidad de reacción que los basados en grupos catalíticos específicos (catálisis covalente y ácido-base)
En la actualidad se han podido estudiar en detalle los mecanismos moleculares responsables de la actividad catalítica de unos cuantos enzimas confirmándose en líneas generales las ideas desarrolladas a lo largo del presente parágrafo.
No hay comentarios:
Publicar un comentario