apuntes de biología

Técnicas de detección y análisis de biomoléculas individuales

Las biomoléculas interactúan entre sí y se asocian para formar máquinas moleculares que cumplen variadas y fundamentales funciones en los seres vivos. Las estructuras y funciones de las biomoléculas están siendo determinadas gracias al empleo de recientes avances tecnológicos de la biología estructural y molecular. Sin embargo, tanto la estructura de las biomoléculas como las interacciones entre ellas cambian dinámicamente, lo cual hace muy importante poder avanzar en el estudio de las propiedades dinámicas de las biomoléculas. Lamentablemente, los métodos de medida habituales implican a gran número de moléculas y, por tanto, las propiedades dinámicas son promediadas y no pueden ser observadas. La reciente implantación y desarrollo de técnicas de detección y análisis de moléculas individuales (SMD, del inglés "single-molecule detection") está permitiendo el acceso a ese tipo de información que, hasta hace poco, permanecía oculta.

No es una exageración afirmar que las técnicas SMD están abriendo una nueva era de la investigación biológica. Las técnicas SMD permiten la visualización y manipulación de moléculas aisladas sin dañarlas. El análisis de moléculas aisladas está actualmente dominado por tres tipos de aproximaciones metodológicas diferentes: la técnica electrofisiológica del pinzamiento zonal de membranas, la microscopía de fuerza atómica y métodos ópticos basados en la fluorescencia. Analicemos sucintamente cada una de ellas.

Técnica del pinzamiento zonal de membranas.

La mayor parte de nuestro conocimiento actual sobre los canales iónicos procede de la implantación de la técnica del pinzamiento zonal ("patch-clamp", en inglés), introducida en 1976 por Erwin Neher y Bert Sakmann (lo que les valió a ambos el Premio Nobel de Medicina y Fisiología en 1991). Esta técnica permite el registro de las corrientes iónicas a través de zonas minúsculas de membranas celulares. La técnica consiste, esencialmente, en presionar la punta de una micropipeta de vidrio contra la superficie de la membrana con ayuda de un microscopio y un micromanipulador, formándose un cierre hermético. Hacia 1982 ya se habían desarrollado técnicas para sellar el fragmento de membrana contra la punta de la pipeta, obteniéndose resistencias del orden de gigaohmios, lo cual permitía registrar corrientes tan pequeñas como 0.1 pA. Este elevadísimo grado de sensibilidad permitió detectar las corrientes iónicas debidas a canales iónicos aislados.

La técnica del pinzamiento zonal admite diversas variantes. Si después de sellar la punta de la pipeta contra la membrana se aplica una pequeña succión, el fragmento de membrana pinzado se rompe, con lo que se consigue el registro de la célula completa ("whole-cell recording", en inglés), que permite cuantificar la corriente que atraviesa toda la superficie de una célula individual. Separando la pipeta de la célula a partir de esta configuración, los bordes de la membrana unidos a la punta de la pipeta se sellan, permitiendo así el registro exterior-fuera ("outside-out patch recording", en inglés), en el que se pueden determinar las corrientes iónicas que atraviesan los canales presentes en el fragmento de membrana atrapado. Como el diámetro de la micropipeta empleada es extemadamente pequeño, la corriente detectada corresponde a apenas uno o dos canales iónicos. Por último, separando la pipeta de la célula antes de aplicar la pequeña succión, se puede obtener el registro interior-fuera ("inside-out patch recording", en inglés), ya que el parche de membrana queda evertido.

Microscopía de fuerza atómica.

Gerd Binnig introdujo esta técnica en 1986, el mismo año en que recibió el Premio Nobel de Física (junto con Heinrich Rohrer y Ernst Ruska) por el desarrollo de la microscopía de efecto túnel. En la actualidad, la microscopía de fuerza atómica es la única técnica que permite obtener imágenes de muestras con resolución por debajo del nanómetro y que puede operar en disolución. El microscopio de fuerza atómica usa una aguja muy fina al final de un soporte flexible para hacer un barrido sobre la superficie de la muestra. Las deflecciones del soporte medidas a una resolución de unos pocos ángstroms sirven para determinar el contorno de la muestra, generando imágenes que muestran la topografía de la superficie de las biomoléculas analizadas. Esta técnica resulta particularmente atractiva porque no sólo revela la superficie de un objeto en su estado nativo sino que además ofrece una relación señal:ruido excepcionalmente elevada. Con esta técnica ya se han conseguido sorprendentes imágenes que revelan características submoleculares de biomoléculas aisladas. Es más, se pueden detectar mínimos cambios estructurales en la superficie de una biomolécula con una resolución temporal de unos pocos milisegundos, suficiente para poder monitorizar los cambios conformacionales implicados en procesos biológicos concretos. Además, la aguja del microscopio de fuerza atómica puede considerarse una nanoherramienta que permite manipular moléculas aisladas.

Técnicas ópticas.

A diferencia de la microscopía de fuerza atómica, las técnicas ópticas no se restringen al análisis de superficies y, por tanto, resultan mucho más versátiles en relación al ambiente molecular, ofreciendo una aproximación particularmente atractiva para analizar moléculas en equilibrio termodinámico, ya que estas técnicas causan una mínima interferencia con el sistema biológico sometido a estudio.

Aunque ya se ha conseguido SMD aplicando la espectroscopía Raman, la inmensa mayoría de las aplicaciones de técnicas ópticas para SMD están basadas en métodos espectroscópicos para la detección de moléculas fluorescentes. Un principio espectroscópico que ha progresado recientemente hasta convertirse en una de las más prominentes herramientas para el estudio de moléculas individuales es la transferencia de energía de resonancia (FRET). La FRET es un proceso no radiativo por el cual la energía de un fluoróforo donador excitado es transferida a un fluoróforo aceptor en estado basal situado a una distancia en el rango del nanómetro. El empleo de laFRET permite realizar estudios de colocalización y/o interacción biomolécula-biomolécula, así como analizar cambios conformacionales dentro de una biomolécula dada.

Haces de luz láser pueden ser empleados como auténticas pinzas ópticas que permiten atrapar y manipular biomoléculas individuales con gran precisión. Manipulando la fuerza que se aplica a estas pinzas ópticas se obtiene una respuesta similar a los cambios en el estado de compresión de un muelle regidos por la ley de Hook. Se pueden registrar desplazamientos con una precisión por debajo del nanómetro, que corresponde con una precisión en la medida de la fuerza aplicada por debajo del piconewton. De esta forma, ya es posible analizar el funcionamiento de motores moleculares individuales.

Una técnica SMD particularmente elegante con un muy elevado grado de confianza estadística es la espectroscopía de correlación de fluorescencia (FCS). A ella dedicaremos un futuro artículo en Encuentros en la Biología.

A ritmo de calcio

Es bien conocido que el calcio iónico (Ca2+) es un importante mensajero intracelular usado por las células. Desde que Sydney Ringer en 1883 [J Physiol, 2:251-272] demostró la necesidad del Ca2+ para la función cardiaca (descubriendo el primer mensajero intracelular conocido) hasta hoy, se ha visto que tanto las células procariotas como las eucariotas usan este catión como mensajero intracelular. Bacterias y levaduras mantienen concentraciones intracelulares bajas de Ca2+ [Norris V., Cell Calcium, 10:511-517 (1989)] similares a las encontradas en células de organismos pluricelulares, un prerrequisito para que este ión pueda actuar como mensajero intracelular; además las bombas y proteínas efectoras de calcio de procariotas y levaduras son muy similares a las que hay en vertebrados, mostrando lo ancestral de la señalización por calcio en la historia de la vida.

Una importante característica del Ca2+ es que la célula no puede producirlo ni destruirlo, sino únicamente controlar sus concentraciones intracelulares usando como fuente principal de Ca2+ el medio extracelular. Así, la célula evolutivamente ha "domesticado" el ión calcio por medio de la creación de una compleja maquinaria que le permite controlar con mucha precisión los niveles de calcio iónico intracelular: proteínas que unen calcio, bombas que sacan Ca2+ del citosol, bien hacia depósitos intracelulares (el retículo endoplasmático) o hacia el medio extracelular, el intercambiador Na+-Ca2+ que saca Ca2+ hacia el medio extracelular, los receptores de IP3 y rianodina que movilizan calcio de los depósitos, los canales de calcio dependientes de voltaje que permiten la entrada de calcio extracelular cuando se produce despolarización de la membrana, o los canales que se activan cuando el nivel de Ca2+ almacenado en los depósitos intracelulares disminuye [Elliott A.C., Cell Calcium,30:73-93(2001)], permitiendo la entrada de calcio extracelular (corriente capacitativa).

Curiosamente, la señalización por calcio no ocurre de un modo similar en todas las células, pudiendo distinguirse claramente cómo se produce esta señal en células excitables, que son células animales capaces de disparar en sus membranas potenciales de acción [Fewtrell C., Ann Rev Physiol, 55:427-454 (1993)] y en células no excitables (todas las células vegetales y muchas animales). Mientras que en las primeras el estímulo que provoca la señalización por calcio lleva a la apertura de canales de calcio dependientes de voltaje que permiten entrada de calcio extracelular, en las segundas el estímulo lleva a la producción intracelular de IP3 que dispara la salida de Ca2+ desde depósitos intracelulares.

La monitorización del calcio intracelular utilizando sondas fluorescentes sensibles a Ca2+ ha puesto de manifiesto que en muchas células la señalización por calcio es más compleja que un simple incremento de los niveles intracelulares de Ca2+ . Se han observado oscilaciones de los niveles de Ca2+ intracelular en células excitables como neuronas, células cardiacas y células beta pancreáticas, oscilaciones que son acompañadas por fluctuaciones del potencial de membrana. Inicialmente se pensó que las oscilaciones eran exclusivas de células excitables, sin embargo en 1986 Woods et al. [Nature, 319:600-602] describieron oscilaciones de Ca2+ intracelular en hepatocitos (células no excitables) estimulados hormonalmente, y ese mismo año Yada et al. [Biochim Biophys Acta 887:105-112 (1986)] describieron lo mismo en células epiteliales en cultivo. A medida que se extendió el uso de las sondas para calcio intracelular y se desarrollaron técnicas de monitorización de calcio a nivel de célula individual, fue incrementándose el número de tipos celulares en los que se detectaban oscilaciones de calcio en respuesta a los estímulos que movilizan calcio. Actualmente hay descritas oscilaciones de calcio intracelular en multitud de células, desde el huevo fertilizado, hasta células endoteliales, pasando por células de la hipófisis, cromafines, mastocitos, musculares, hepáticas, precursores neuronales, neuroblastos, astrocitos ...

En células excitables las oscilaciones del Ca2+ intracelular están dirigidas por la frecuencia de los potenciales de acción que se disparan en la membrana, mientras que en células no excitables la unión de una molécula a su receptor en la membrana plasmática puede provocar oscilaciones mediante un mecanismo aún objeto de discusión. Según parece, el receptor de IP3 , que está acoplado a un canal que libera calcio del retículo, posee características moleculares que le permiten ser modulable por calcio, de este modo el receptor activado en presencia de bajos niveles de calcio incrementa la permeabilidad del canal a calcio, mientras que altos niveles de calcio disminuyen la permeabilidad del canal.

Pero además, este comportamiento rítmico es regulable, de modo que la frecuencia de las oscilaciones puede modificarse al cambiar la frecuencia de los potenciales de acción o la concentración de las moléculas con receptores acoplados a la generación de IP3. Así, una codificación por frecuencia de la señal de calcio intracelular permite una mayor rango de respuesta de la célula ante la intensidad del estímulo.

Diversos experimentos realizados sobre células secretoras han permitido establecer una relación entre las oscilaciones y los pulsos secretorios. De este modo, se ha sugerido que este comportamiento rítmico podría permitir optimizar el proceso secretorio a la vez que se evitarían los efectos tóxicos de un incremento sostenido de los niveles de Ca2+ intracelular [Tse A. et al., Science, 260:82-84 (1993)].

Si pasamos del nivel de organización celular al nivel tisular, teniendo en cuenta que un tejido es un conjunto de células que actúa de forma coordinada para llevar a cabo una o varias funciones, es lógico pensar que la señal intracelular de calcio, que puede regular una determinada función, esté acoplada entre las diferentes células que componen el tejido para producir de este modo un efecto coordinado a nivel tisular. Efectivamente esto es así, y se han podido medir oscilaciones sincrónicas de calcio intracelular entre las diferentes células de muchos tejidos; por ejemplo, en el hígado se han visto estas oscilaciones sincrónicas entre las diferentes células que componen un lobulillo hepático, la unidad funcional del hígado [Robb-Gaspers L.D. y Thomas A.P., J Biol Chem, 270:8102-8107 (1995)]. Del mismo modo, en una estructura secretora la sincronización permite que todas las células liberen a la vez y en la misma cantidad la secreción, obteniéndose un funcionamiento perfectamente regulado de la glándula.

La sincronización implica la transferencia de la señal de calcio entre las diferentes células, la llegada simultánea de una señal externa a todas las células o la existencia de ambos fenómenos. Se sabe que existe una transferencia intercelular de la señal de calcio a través de uniones de tipo gap (gap junction), aunque no está claro si lo que pasa a través de estos poros es el propio calcio o algún otro mensajero como por ejemplo el IP3 (es interesante saber que el calcio tiene una escasa capacidad de difusión en el interior celular debido principalmente al tamponamiento que ejercen las proteínas ligantes de calcio, mientras que el IP3 sí es muy difusible). También se conoce la existencia de mensajeros extracelulares capaces de actuar en un modo autocrino/paracrino disparando la señal de calcio. Así, por ejemplo, en los mastocitos, que no están acoplados entre si por uniones tipo gap, cuando se dispara la señal de calcio en uno de ellos, por la unión de la molécula de inmunoglobulina a los receptores de Fc, se colibera junto con los productos proinflamatorios (fundamentalmente histamina) un mediador extracelular soluble (ATP), que llega hasta células cercanas disparando la señal de calcio en ellas e induciendo la consiguiente liberación de estas moléculas proinflamatorias.

Pero la señal oscilatoria de calcio no solo participa en procesos como la secreción y la contracción, sino también en procesos como la expresión génica. Recientemente [Dolmetsch R.E. et al., Nature, 392:933-936 (1998); Li W.H. et al., Nature 392:936-941 (1998)] se demostró que la frecuencia de las oscilaciones de calcio era capaz de regular la eficiencia y especificidad de la expresión génica. Esto pone de manifiesto la importancia de la señal de calcio en todos los procesos celulares, empezando por la regulación génica y terminando por el control de los productos de los genes, las proteínas. Por ejemplo, las células mamotropas de rata (células de la hipófisis productoras de prolactina) poseen en la región promotora del gen que codifica para la prolactina secuencias de unión a calcio capaces de modular la expresión del gen, mientras que la liberación de secreción a la sangre está controlada por oscilaciones de calcio; de este modo toda la secuencia de eventos relacionados con la actividad de estas células está regulada por la señal de calcio [Villalobos C. et al., Mol Endocrinol 12:87-95 (1998)].

Seguramente Sydney Ringer no imaginaba la importancia del calcio iónico en la biología celular, y es que el Ca2+ como mensajero intracelular es otro ejemplo de logro evolutivo que ha permanecido congelado en el tiempo, que probablemente se desarrolló muy pronto en la evolución de la vida y sin el cual es inconcebible imaginar la vida tal y como la conocemos.

El misterioso origen del endotelio vascular

El endotelio vascular es la delgada capa de células que tapiza internamente los vasos sanguíneos. Los investigadores que se dedican al estudio de las células endoteliales han ido de sorpresa en sorpresa en los últimos años y en estas páginas nos hemos hecho eco de alguna de ellas (Encuentros en la Biología números 38, 65 y 67). Esta cadena de descubrimientos se debe al interés que la biología del endotelio despierta en varios frentes de la ciencia actual. La interacción del endotelio con las células sanguíneas es básica en fenómenos de inflamación así como en la diseminación de células metastásicas. La angiogénesis (la formación de nuevos vasos por crecimiento de vasos preexistentes), cuando se produce de forma descontrolada, está relacionada con problemas tan graves como la retinopatía diabética, la psoriasis o la artritis reumatoide. El descubrimiento de que el crecimiento de los tumores sólidos es dependiente de su capacidad para inducir angiogénesis en los tejidos circundantes ha abierto importantes expectativas en la terapia del cáncer. Finalmente tampoco podemos olvidar que determinados problemas podrían necesitar un estímulo de la angiogénesis para su resolución, por ejemplo la reparación del miocardio después de un episodio de isquemia.

Sin embargo, subsisten aún interesantes incógnitas relacionadas, por ejemplo, con aspectos evolutivos, es decir, con cuándo y cómo apareció el endotelio vascular. Esto se debe a que las células endoteliales muestran una distribución muy restringida dentro del Reino Animal. De hecho, los vasos de los invertebrados, aunque en ocasiones formen un sistema vascular muy bien desarrollado, carecen en general de revestimiento endotelial. En los vasos principales de los invertebrados la sangre circula a través de cavidades revestidas por las láminas basales de epitelios, sea entre epitelios endodérmicos y mesodérmicos o entre las dos hojas mesodérmicas que forman los mesenterios. Esto quiere decir que la sangre y los hemocitos están en contacto directo con las proteínas de la matriz extracelular que constituyen la lámina basal. Los pequeños vasos que penetran en los distintos órganos están también limitados por una lámina basal perteneciente a células mioepiteliales, es decir, células que comparten características epiteliales y contráctiles.

El sistema vascular original de los animales, por tanto, está contituido por una red de cavidades tapizadas por matriz extracelular, sin un tipo celular especializado como sucede en Vertebrados. Por supuesto, existen algunas excepciones a esta regla y un ejemplo lo constituyen los Nemertinos (Phylum Nemertea), un grupo de gusanos marinos con el cuerpo comprimido y una pintoresca trompa evaginable. Los Nemertinos eran considerados excepcionales por su sistema circulatorio perfectamente tapizado por un epitelio que durante mucho tiempo se consideró como similar al endotelio de Vertebrados. Sin embargo, una serie de estudios embriológicos han mostrado que las presuntas células endoteliales se formaban por ahuecamiento de cordones celulares mesodérmicos, es decir, por un mecanismo similar al que origina el celoma en muchos protóstomos [Turbeville, J.M. Nemertinea. In: Harrison FW (ed.) Microscopic anatomy of invertebrates, vol 3. pp 285-328, Wiley-Liss, New York. (1991)]. En otras palabras, el supuesto sistema vascular de los Nemertinos no es otra cosa que una red de canales celómicos que desempeñan la misma función que la de los vasos de otros animales.

Esta asunción de funciones vasculares por parte del celoma no es única. Las sanguijuelas (Anélidos hirudíneos) poseen también un conjunto de delgados canales celómicos que recorren el cuerpo, y los Equinodermos (erizos, estrellas de mar, etc.) poseen, de forma paralela a su sistema vascular hemal, una compleja red de canales celómicos de funciones muy variadas

¿No hay, pues, células endoteliales en los invertebrados? La respuesta es sí. De hecho existen casos muy concretos. El más conocido es el de los Moluscos cefalópodos, cuyos vasos son similares a los de otros invertebrados pero tienen la particularidad de presentar células aplanadas y adheridas a la lámina basal de las células mioepiteliales. Estas células cubren más o menos completamente la superficie interna de los vasos, pero cuando llegan a recubrirla totalmente el aspecto de dichas células no es muy diferente al de las células endoteliales de los vertebrados. [Brusca, R.C. y Brusca, G.J. Invertebrates. Sinauer Associates, Sunderland, MA (1990)].

Otro aspecto importante a considerar, antes de discutir el origen del endotelio en vertebrados, es el de los amebocitos que en muchos invertebrados aparecen adheridos a la lámina basal vascular [Jamieson, B.G.M. Oligochaeta. In Microscopic Anatomy of Invertebrates, Vol. 7 (Ed. F.W. Harrison), pp. 217-322. Wiley-Liss, New York (1992)]. Estos amebocitos parecen ser hemocitos (células circulantes) que adquiren propiedades adherentes y son capaces de migrar sobre la lámina basal vascular. El hecho no deja de ser de extraordinario interés dado el parecido que dichas células presentan con los precursores vasculares circulantes de los Vertebrados (ver más adelante).

Volvamos a los Vertebrados. Hemos dicho que el endotelio vascular está presente en todos los miembros del Phyllum y sólo en ellos (con la única excepción dentro del Reino Animal de los Moluscos cefalópodos). Resulta en cierto modo lógico que sean precisamente cefalópodos y los vertebrados los grupos animales con especies de mayor tamaño, ya que parece obvio que las funciones del sistema circulatorio son esenciales para el aumento el tamaño corporal. En cualquier caso, seguimos sin pistas que nos permitan explicar la repentina (en términos evolutivos), aparición del endotelio. Urocordados (ascidias y salpas) y Cefalocordados (anfioxos), nuestros más próximos parientes no vertebrados, tienen vasos tapizados por láminas basales y carecen de endotelio. Es posible por tanto que sólo podamos responder a la cuestión analizando las propiedades únicas de nuestro endotelio, algunas de las cuales comentamos a continuación.

Durante el desarrollo, las células endoteliales y las células sanguíneas vertebradas parecen diferenciarse de un precursor común, el hemangioblasto [Choi, K., et al.Development 125:725-732 (1997)]. Sin embargo, a pesar de múltiples evidencias en este sentido, recientemente se ha aislado un precursor común a células endoteliales y musculares lisas (Yamashita, J. et al. Nature 408:92-96 (2000)], añadiendo aún más incógnitas a la cuestión. Por otro lado, se ha comprobado que células endoteliales pueden diferenciarse e integrarse en los vasos a partir de precursores circulantes, que normalmente residen en la médula ósea pero se movilizan en caso de necesidad [Asahara, T. et al. Science 275:964-967 (1997)]. El endotelio vascular normalmente es quiescente y su tasa de actividad mitótica es bajísima. Sin embargo, en respuesta a determinados estímulos (p.e. señales inducidas por la falta de oxígeno), se activa, produce enzimas que degradan su lámina basal, reorganiza el citosqueleto, prolifera y migra a través de los tejidos, dando lugar a nuevos vasos en el proceso de angiogénesis que antes hemos comentado. Por si todo esto fuera poco, el endotelio que tapiza el corazón de los embriones, en lugares muy concretos, se transforma en células migradoras que forman los llamados cojines endocárdicos, fundamentales en el desarrollo cardiaco y precursores de las válvulas cardiacas. Buena parte de los fibrocitos de las válvulas de nuestro corazón son derivados de células endoteliales [Markwald et al. Acta Anat.156:173-186. (1996)].

Una hipótesis extraordinariamente atractiva, y que podría relacionarse con todo lo anteriormente descrito, es que el endotelio haya derivado, en los ancestros de los vertebrados, de células circulantes similares a los amebocitos de los invertebrados, aquellas células que describíamos antes con capacidad para adherirse a la lámina basal. Imaginemos por un momento que células sanguíneas hayan sido capaces de adherirse y acabar revistiendo toda la superficie interna de los vasos. El siguiente paso consistiría en el establecimiento de uniones intercelulares (de hecho las uniones entre células endoteliales son de un tipo especial, implicando a una variedad única de cadherina, la VE-cadherina o cadherina-5). Finalmente, la adquisición por parte de estas células de la capacidad de producir su propia lámina basal y de revertir ocasionalmente al fenotipo migrador e invasivo original podría explicar el proceso angiogénico.

Un origen del endotelio a partir de células circulantes ancestrales explicaría no sólo el origen ontogenético común de endotelio y células sanguíneas, sino también la existencia de precursores circulantes indiferenciados con capacidad de generar endotelio. Posiblemente podríamos explicar también la existencia de un precursor vascular común a endotelio y músculo liso, ya que tanto las células mioepiteliales como los celomocitos, es decir, las células circulantes en el celoma, parecen formarse en invertebrados por delaminación del epitelio celómico [Van den Bossche, J.P. y Jangoux, M. Nature 261:227-228 (1976)]. Los celomocitos desempeñan en los invertebrados muchas de las funciones de las células sanguíneas de los vertebrados, incluyendo funciones defensivas y fagocitosis. Si asumimos que las células sanguíneas de los vertebrados son derivados de los celomocitos, en última instancia todos los componentes del sistema circulatorio, células sanguíneas, endoteliales y musculatura lisa vascular, podrían ser descendientes de células derivadas del epitelio celómico. Las estrechas relaciones filogenéticas entre celoma y sistema circulatorio quedarían de esta forma subrayadas.

Se trata tan sólo de una hipótesis en los límites entre la evolución y el desarrollo, pero que podría tener un importante valor explicativo de muchos de los enigmas que rodean el origen y las propiedades del endotelio de los Vertebrados.