apuntes de biología

Espectroscopía de correlación de fluorescencia

En los últimos años el desarrollo de nuevas técnicas que permiten la detección y análisis de moléculas individuales está abriendo una nueva era en la investigación biológica (véase "Técnicas de detección y análisis de biomoléculas individuales" en Encuentros en la Biología 78, 2002). Una de estas técnicas es la espectroscopía de correlación de fluorescencia (FCS), un análisis de fluctuaciones temporales de pequeños conjuntos de moléculas que combina una extremada sensibilidad con una elevada confianza estadística. Aunque la FCS fue introducida a principios de los años setenta, diversas dificultades experimentales impidieron su desarrollo práctico hasta los años noventa y solamente en los últimos años se han incrementado exponencialmente sus aplicaciones prácticas.

A diferencia de lo que ocurre con las técnicas clásicas de relajación, la FCS no requiere perturbar externamente el sistema sino que se analizan las diminutas fluctuaciones en la señal fluorescente que ocurren siempre espontáneamente. Para hacer posible una auténtica medida con resolución de molécula individual, deben emplearse muestras muy diluídas del fluoróforo (en el rango de concentración nanomolar) y debe enfocarse la señal luminosa láser excitadora en un volumen de medida del orden femtomolar. Las fluctuaciones de la señal fluorescente registradas son posteriormente sometidas a un análisis en serie temporal para generar la denominadafunción de autocorrelación de fluctuaciones normalizada:

G(t)= <dF(t) dF(t+t)> / 2 (1)

La ecuación (1) genera información valiosa acerca de la dinámica molecular. De hecho, tal como muestra la figura adjunta, la función de correlación G(t) permite determinar, al menos, tres parámetros fundamentales: i) el número medio de moléculas fluorescentes observadas simultáneamente, G(0)-1; ii) el tiempo de residencia molecular, td, relacionado con la constante difusión; y iii) los tiempos característicos de "encendido/apagado" de la fluorescencia, tf, relacionados con dinámicas intramoleculares ultra-rápidas.

El análisis de autocorrelación de la FCS convencional es potencialmente aplicable a cualquier proceso rápido que afecte a la capacidad fluorescente de las moléculas objeto de estudio (reacciones rédox, reacciones ácido-base, ligamiento a oxígeno, o isomerización, entre otros), así como a procesos de asociación/disasociación molecular que impliquen grandes cambios en la movilidad difusional de las fluoróforos. El rango de aplicaciones ya publicadas de la FCS en el campo de la biología incluye estudios de dinámica fotofísica de proteínas fluorescentes, análisis de dinámica conformacional, estudios de cinética bioquímica e interacciones entre macromoléculas.

Variantes de la FCS

Con el modo convencional de autocorrelación, el análisis de interacciones moleculares por FCS sólo se puede realizar apropiadamente si los tamaños moleculares aparentes de las especies reaccionantes y productos difieren en un factor de, al menos, 4 a 8. Esta limitación queda obviada por la variante de espectroscopía de correlación cruzada de fluorescencia de dos colores (DC-FCCS). El concepto de la DC-FCCS supone emplear dos haces de luz láser distintas para excitar dos fluoróforos distintos en un esquema confocal, tomar registro de las fluctuaciones de fluorescencia de ambos fluoróforos y finalmente hacer un análisis en serie temporal de la correlación cruzada de las fluctuaciones de una y otra señal. Aquí el parámetro de medida fundamental es la amplitud de la función de correlación cruzada, en vez de su evolución temporal (como ocurría en la FCS convencional). Es obvio comprender que la correlación cruzada de dos señales será alta cuando los dos fluoróforos coinciden en la únidad de volumen elemental al mismo tiempo, y será baja cuando no. De esta forma, si partimos de una molécula con un doble marcado fluorescente, será muy fácil seguir cualquier reacción que genere una ruptura de la misma que implique la separación física de los dos fluoróforos. Análogamente, si partimos de dos moléculas con distinto marcador fluorescente, en principio exhibirán muy baja correlación cruzada, pero si seguimos una reacción de ligamiento o fusión entre ambas especies, se detectará un significativo incremento en la correlación cruzada.

La mayor dificultad experimental del diseño confocal de la DC-FCCS consiste en el adecuado alineamiento y "confocalización" de los dos haces de luz láser. Estos problemas de manipulación quedan obviados en el diseño de DC-FCCS con excitación por dos fotones. En esta variante, sólo hace falta un láser para excitar distintos fluoróforos que generen espectros de emisión con mínimo solapamiento.

Finalmente, se ha propuesto un esquema que permite el análisis y cuantificación de agregados moleculares. Este enfoque se ha aplicado ya con gran éxito a la detección de agregados amieloides y agregados priónicos en el líquido céfalorraquídeo de pacientes afectos de la enfermedad de Alzheimer y de la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, respectivamente.

A modo de conclusión

La disponibilidad de nuevas generaciones de fluoróforos versátiles y resistentes, la generalización del empleo de la proteína verde fluorescente (GFP) y otras proteínas fluorescentes, la disponibilidad comercial de sistemas FCS de manejo relativamente fácil y los recientes desarrollos de variantes DC-FCCS permiten vaticinar un gran incremento en el número de aplicaciones concretas de la FCS en investigación biológica en el futuro inmediato.

Progenitores clonales multipotentes para la reparación de sistema nervioso

Probablemente uno de los temas científicos del año que acaba de empezar sea el de las investigaciones sobre la utilización de células madre con fines terapéuticos, un tema que no está libre de una fuerte polémica. Opiniones a favor y en contra se suceden en los medios de comunicación, pero lo que parece fuera de toda duda es la importancia de que sepamos explotar adecuadamente las propiedades de las células pluripotentes para solucionar graves problemas de salud. Por citar sólo un caso, el envejecimiento de la población en los países occidentales va a aumentar en los próximos años la incidencia de enfermedades neurodegenerativas, algunas de las cuales no tienen hoy por hoy tratamiento curativo.

En el debate sobre las células madre se olvida en ocasiones que existen alternativas a las células embrionarias que no deberían generar inconvenientes desde el punto de vista ético. Una serie de descubrimientos recientes ilustran bien este punto, y vamos a referirnos a ellos en este artículo. Se trata de resultados espectaculares, aunque su auténtico alcance sólo podrá verificarse en los próximos años.

La historia comienza hace diez años. El grupo de Evan Snyder, en la Escuela Médica de Harvard, desarrolló una línea celular, denominada C17.2, inmortalizando células de la capa granular externa del cerebelo de ratones recién nacidos mediante transducción, mediada por retrovirus, del oncogén v-Myc [Snyder EY et al., Cell 68:33-51 (1992)]. Este gen es el equivalente en aves del proto-oncogén c-Myc, que en mamíferos está implicado en el control de la proliferación y diferenciación celular. Las células C17.2 no son auténticas células-madre, aunque comparten con ellas la capacidad de generar poblaciones celulares dotadas de una extraordinaria plasticidad. Por ello se habla de "progenitores clonales multipotentes".

Las células C17.2 han mostrado propiedades sorprendentes en diferentes modelos desarrollados en ratón, tanto de enfermedades como de traumatismos del sistema nervioso central. Son capaces de migrar hacia la zona afectada, diferenciarse en neuronas o glía, liberar factores neurohumorales, conectar con otras células nerviosas y recibir conexiones. Vamos a describir algunos ejemplos antes de describir los dos descubrimientos más recientes y que han levantado las mayores expectativas.

Un comportamiento inesperado de las células C17.2 es el de la "persecución" de los tumores. Cuando estas células fueron implantadas en el cerebro de ratones en los que se había desarrollado experimentalmente un glioma, las C17.2 migraron hasta rodear completamente los límites del tumor,acompañando a las células tumorales infiltrantes. Incluso cuando fueron inyectadas a distancia del glioma o en el torrente circulatorio, las células C17.2 se acabaron localizando preferentemente en la periferia del tumor [Aboody KS et al., Proc Natl Acad Sci USA 97:12846-12851 (2000)]. La idea que surge a partir de este trabajo es la de modificar genéticamente las células «acosadoras» de las células tumorales con objeto de que produzcan y suministren algún tipo de molécula terapéuticamente relevante que contribuya a detener el crecimiento de tumores especialmente agresivos y refractarios a otros tratamientos.

Otra situación en la que se han ensayado células neurales multipotentes ha sido en modelos de regeneración de médula espinal después de una sección traumática de la mitad de la misma, un procedimiento que resulta en parálisis de uno de los miembros posteriores. En este caso las células se aplicaron a la sección medular en el interior de una matriz sintética constituida por un biopolímero biodegradable (ácido poliglicólico). En los animales tratados, pero no en los controles, se observó una importante recuperación funcional en el miembro posterior afectado [Teng YD et al., Proc Natl Acad Sci USA 99:3024-3029 (2002)]. Aunque parte de la recuperación puede deberse a que el polímero redujo la inflamación y la cicatrización glial, diversas evidencias sugieren que la mejoría se debió, en parte, a la regeneración parcial de fibras nerviosas que atravesaban la zona lesionada. En otro experimento, células C17.2 fueron inyectadas el cerebro de ratones que habían sufrido, tres días antes, un daño cerebral traumático producido por un impacto. Los ratones fueron evaluados desde el punto de vista motor y cognitivo (aprendizaje) durante un periodo de 12 semanas. Aunque las funciones cognitivas no mejoraron en los ratones inyectados con células C17.2, sí se observó en éstos una significativa recuperación motora respecto a los controles (Ries P et al., Neurosurgery 51:1043-1052 (2002)].

Pero la más reciente contribución de las células C17.2 acaba de aparecer en dos artículos publicados en la revista Nature Biotechnology. En el primero de ellos se describe cómo estas células contribuyen a restablecer las funciones de las neuronas dopaminérgicas en un modelo animal de enfermedad de Parkinson [Ourednik et al.,Nature Biotech. 20:1103-1110 (2002)]. En este modelo los ratones son tratados con MPTP, una neurotoxina que inhibe la enzima tirosín-hidroxilasa, clave en la síntesis de dopamina. Ya se había intentado con anterioridad rescatar la función de las neuronas dopaminérgicas de la sustancia negra mediante la implantación de células C17.2 modificadas genéticamente para producir GDNF, el factor de crecimiento derivado de células gliales [Akerud P et al., J Neurosci. 21:8108-8118 (2001)]. La novedad del trabajo de Ourednik y colaboradores es que las células C17.2 no fueron en esta ocasión manipuladas genéticamente e incluso así se recuperó la capacidad de producir dopamina en la sustancia negra. La sorpresa consistió en que sólo algunas de las neuronas dopaminérgicas se diferenciaron a partir de las células multipotentes inyectadas; la mayoría fueron neuronas «rescatadas» que volvían a ser funcionales. Esto implica que las células C17.2 no sólo constituyen vectores para terapia génica y son capaces de reemplazar funcionalmente a otras neuronas, sino que además pueden desempeñar un papel trófico o neuroprotector que permite el restablecimiento de funciones en neuronas dañadas.

El segundo artículo del grupo de Snyder incide en la recuperación de lesiones cerebrales, producidas en este caso en un modelo de isquemia cerebral (ligación de la arteria carótida derecha seguida de atmósfera hipóxica) un tratamiento que causa una lesión cortical masiva. En la cavidad resultante del infarto cerebral se inyectaron células C17.2 embebidas en la matriz de ácido poliglicólico antes mencionada. En este ambiente las células se diferenciaron en neuronas y glía, promovieron el crecimiento de axones de las neuronas locales, establecieron y recibieron conexiones de éstas y adquirieron un cierto grado de citoarquitectura [Park et al., Nature Biotech. 20:1113-1117 (2002)]. Al mismo tiempo el polímero promovió la revascularización de la zona infartada. Estos efectos no se produjeron cuando se inyectaron las células o el biopolímero de forma aislada.

Los resultados, como hemos dicho, son espectaculares pero es preciso ser muy prudentes al respecto. Las células C17.2 son células de ratón y nos ilustran sobre las posibilidades de células no embrionarias manipuladas genéticamente para la adquisición de pluripotencialidad, pero obviamente no pueden ser aplicadas en humanos. Por otro lado, aunque las células C17.2 parecen diferenciarse rápidamente cuando son inyectadas en los tejidos, no puede descartarse que puedan dar lugar a tumores, como hacen otras células transformadas que expresan oncogenes. En cualquier caso, las posibilidades abiertas por estos resultados para el tratamiento de patologías graves del sistema nervioso constituirán probablemente un tema del mayor interés en los próximos años.

Señales Wnt para la inducción de la cresta neural

Uno de los rasgos más característicos de los vertebrados, más incluso que las vértebras que dan nombre al grupo, es la cresta neural. Se ha llegado a decir, con cierta exageración, que la cresta neural es lo único realmente interesante que tienen los vertebrados. También se la ha llamado la "cuarta hoja blastodérmica", colocándola en pie de igualdad con ectodermo, mesodermo y endodermo. La verdad es que este conjunto de células embrionarias resulta fascinante por su origen, en la zona límite entre el ectodermo y la placa neural, por su capacidad migradora, que las hace extenderse rápidamente por todo el cuerpo, y sobre todo por su pluripotencialidad. Las células de la cresta neural no sólo se diferencian en las neuronas del sistema nervioso periférico (simpático y parasimpático) y en las de los ganglios sensoriales de la raíz dorsal, sino que también dan lugar a la glía correspondiente, a los cromatóforos (los melanocitos de la piel en nuestro caso), a buena parte del tejido conectivo y del esqueleto facial, incluyendo las papilas dentarias, al esqueleto visceral (branquial), a la musculatura lisa de algunos grandes vasos como la aorta, al septo aorticopulmonar que divide el tracto de salida cardiaco, y a células endocrinas como las de la médula adrenal o las células C del tiroides, productoras de calcitonina. Desde el punto de vista de los derivados a los que da lugar, la cresta neural desempeña por tanto un papel intermedio entre el neuroectodermo (neuronas, glía) y el mesodermo (esqueleto, musculatura). En cualquier caso la cresta neural es un sistema excelente para estudiar procesos celulares fundamentales, como son los de la transición epitelio-mesénquima, la adquisición de propiedades migratorias, la diferenciación en respuesta a señales del entorno y la formación de patrones.

Se conocen relativamente poco los mecanismos que inducen la cresta neural a partir de sus precursores localizados en los márgenes de la placa neural. Recordemos que la placa neural es la zona más dorsal del ectodermo del embrión temprano de vertebrados. Por diversos mecanismos esta placa se curva y se hunde dentro del cuerpo del embrión, dando lugar al tubo neural. En algún momento de este proceso, dependiendo del grupo de vertebrados, las células del margen de la placa pierden su carácter epitelial, adquieren motilidad y migran por dos vías principales, una superficial, entre los somitos y la epidermis, y otra en profundidad. Pero como decíamos, se sabe o se sabía relativamente poco sobre las señales implicadas en el inicio del proceso. Sí se conocía que la participación del ectodermo era fundamental. Una placa neural aislada en un medio de cultivo no produce células de la cresta neural, salvo si se cocultiva con ectodermo. También se sabía que la inducción neural en el ectodermo requiere la inhibición de la vía de señalización por BMPs (Bone Morphogenetic Proteins, factores de crecimiento de la superfamilia TGFb). De esta forma antagonistas de BMP como Noggin inducen neuralización del ectodermo. En el embrión de pollo se había mostrado un mecanismo similar de represión de la vía BMP por FGFs (Fibroblast Growth Factors) y por Wnts, una familia de glicoproteínas muy importantes en la generación de patrones espaciales, como luego veremos.

Una vez comprobado que las señales de la vía BMP deben ser reprimidas para la inducción del tejido neural, se planteaba la cuestión de si una represión parcial, en los bordes de la placa, podría inducir la cresta neural. Sin embargo se comprobó que, al menos en embriones de ave y en ensayosin vitro, esto no era posible. La inducción de la cresta neural en estos ensayos muestra dos fases, una en la que participa una señal de tipo BMP y otra que puede ser iniciada por FGFs, ácido retinoico o Wnts. También se sabía que es en esta fase en la que se produce la interacción entre la placa neural y el ectodermo. En cualquier caso, los BMPs no bastan para inducir por sí solos la cresta neural. Por si fuera poco, BMP4 y BMP7, los candidatos propuestos, tienen un patrón de expresión que casa mal con un papel inductor, ya que se expresan más en los bordes de la placa neural que en el ectodermo, es decir, más en el receptor de la hipotética señal que en el emisor.
Un trabajo recientemente publicado podría haber resuelto la cuestión acerca de la señal que el ectodermo produce para la inducción de la cresta neural en embriones de pollo [García-Castro et al., Science 297:848-851 (2992)]. El grupo de Marianne Bronner-Fraser en el Caltech de Pasadena comenzó por buscar proteínas de la familia Wnt (se conocen 19 en humanos) que se expresaran en el ectodermo adyacente a la placa neural y en el momento de la diferenciación de la cresta neural. Entre los candidatos ensayados Wnt6 mostró el patrón de expresión más adecuado. A partir de esta evidencia, los experimentos mostraron, uno tras otro, la implicación de Wnt6 y, en general, de la vía de señalización por Wnt, en la inducción de la cresta neural. Por ejemplo cuando se inyectaron en la placa neural o en el tubo en formación células modificadas genéticamente para expresar un Wnt1 dominante negativo (una forma alterada de Wnt1 que bloquea la vía de señalización uniéndose a los receptores, correceptores o a los propios Wnts), se inhibió la expresión de Slug y HNK-1, marcadores de la cresta neural. Cuando se cultivaron explantes aislados de placa neural con BMP no se produjo, como es lógico, la expresión de marcadores de cresta neural ni la migración de células del explante, a menos que el medio estuviera enriquecido con factores de crecimiento. Sin embargo, cuando el medio de cultivo estaba condicionado por células S₂ de Drosophila, transfectadas para secretar Wingless (el homólogo de Wnt-1 en la mosca del vinagre), el explante produjo células migradoras que expresaban marcadores de cresta neural. Esto sucedió incluso cuando se utilizaban medios mínimos de cultivo. Este resultado es muy significativo, ya que el medio condicionado por células S₂ de Drosophiladispara el mecanismo de señalización por Wnts en varios sistemas de células de vertebrados. Los experimentos de control, en fin, mostraron que es la activación de este sistema la señal necesaria y suficiente para poner en marcha la diferenciación de la cresta neural.

Recordemos que la vía canónica de señalización por Wnts implica la activación de receptores Frizzled, la estabilización de la b-catenina citoplasmática cuya degradación es inhibida, su traslocación al núcleo y su unión a cofactores TCF/LEF para actuar como factor de transcripción. De hecho, b-catenina se localiza en el núcleo de las células de la placa neural inducidas para formar cresta neural y se sabe además que, en Xenopus, la sobreexpresión de b-catenina produce un exceso de formación de cresta neural.

En resumen, la importantísima vía de señalización por Wnts, en concreto la mediada por Wnt6, parece ser clave en la inducción de la cresta neural, uno de los procesos fundamentales del desarrollo de vertebrados. Esto se añade a una larga lista de procesos de desarrollo regulados por Wnts, que van desde la polaridad de segmentos en Drosophila al establecimiento de patrones dorsoventrales en vertebrados pasando por la formación del patrón anteroposterior del tubo nervioso. Resulta realmente fascinante que un mismo sistema de señales sea reclutado por procesos tan distantes entre sí, en una nueva muestra de "economía de la naturaleza".