Radicales libres de oxígeno y enzimas antioxidantes
Durante el metabolismo aerobio se generan constantemente pequeñas cantidades de sustancias reactivas de oxígeno (ROS), incluyendo radicales hidroxilo (.OH), aniones superóxido (O2.-), y peróxido de hidrógeno (H2O2), como respuesta a estímulos externos e internos. Estas mínimas concentraciones de ROS pueden ser indispensables en muchos procesos, como el sistema de señales intracelulares (que está relacionado con otros procesos como la proliferación celular y la apoptosis), la inmunidad, y la defensa contra microorganismos. Sin embargo, altas dosis o una eliminación inadecuada de ROS dan lugar a estrés oxidativo, que puede causar graves disfunciones metabólicas y daño a macromoléculas biológicas. Va a existir, por tanto, una relación entre los niveles de las enzimas antioxidantes y los tres tipos de moléculas mensajeras (factores de crecimiento, prostaglandinas y óxido nítrico) implicadas en la homeostasis celular, es decir, un equilibrio entre el mantenimiento de las condiciones estáticas o constantes en el medio interno celular y el nivel de ROS.
Una de las consecuencias del estrés oxidativo es la peroxidación lipídica, cuya prevención es esencial en todos los organismos aerobios, ya que los productos derivados de este proceso pueden interactuar con el DNA y son potencialmente mutágenos. Los epóxidos formados pueden reaccionar espontáneamente con centros nucleofílicos en la célula o unirse a los ácidos nucleicos (DNA y RNA). Esta reacción puede dar lugar a citotoxicidad, alergia, mutagénesis o carcinogénesis, dependiendo de las propiedades del epóxido en cuestión. En los organismos aerobios existen una gran variedad de sistemas de defensa antioxidante tanto enzimáticos como no enzimáticos, que se coordinan cooperativamente y protegen al organismo de los riesgos que conlleva el estrés oxidativo. Entre ellos destacan las actividades enzimáticas superóxido dismutasa (SOD), glutatión peroxidasa (GPX) y catalasa (CAT); además del ácido ascórbico (vitamina C), alfa-tocoferol (vitamina E), glutatión (GSH), beta-caroteno, vitamina A, flavonoides y ácidos fenólicos.
Por otro lado , también existe una relación entre los niveles de ROS celulares y el incremento ó descenso de las actividades de las enzimas antioxidantes. La adición de H2O2 causa un incremento, dosis dependiente, del mRNA de catalasa en células que se encuentran en crecimiento exponencial. Además, también se detecta un incremento de los niveles estacionarios del mRNA de GPX y SOD. Se han realizado experiencias en las que se ha observado que una sobreexpresión de alguna de las enzimas antioxidantes da lugar a un menor daño oxidativo. Cuando el DNA resulta dañado por radicales hidroxilo se produce la especie 8-oxo-2´-desoxiguanosina. La sobreexpresión de Cu/Zn-SOD y CAT causa un retardo en la acumulación de esta especie durante el crecimiento. Por otra parte, y como ejemplos del efecto protector de estas enzimas se expresó la catalasa peroxidasa de Cyanobacterium synechococcus en células animales, y las células transfectadas resultaron ser más resistentes a H2O2 que las células parentales. También, en otras cepas deficientes en SOD y CAT se observó un aumento de los niveles de O2.-. El descontrol de todas estas especies reactivas de oxígeno puede, por tanto, afectar a diferentes procesos esenciales del organismo, siendo una de las piedras angulares en la génesis de distintas patologías.
Superóxido dismutasa. Cataliza la reacción de destrucción de los radicales superóxido mediante su transformación en peróxido de hidrógeno, el cual puede ser destruido a su vez por las actividades catalasa o glutatión peroxidasa.
O2.- + O2.- + 2H+ -> H2O2 + O2
Se han identificado cuatro clases de SOD: una de ellas contiene un cofactor con dos átomos metálicos, uno de Cu y otro de Zn. Las demás presentan cofactores mononucleares de Fe, Mn o Ni. FeSODs y MnSODs presentan homologías en cuanto a sus secuencias y estructura tridimensional. Además poseen residuos quelantes idénticos en el sitio activo. En humanos existen tres tipos de SOD: la Mn-SOD mitocondrial, la Cu/Zn-SOD citosólica y la SOD extracelular (EC-SOD).
Mn-SOD es un homotetrámero de 96 kDa que contiene un átomo de Mn en cada subunidad. El átomo metálico cambia su estado de oxidación desde Mn(III) a Mn(II), volviendo de nuevo a Mn(III), durante los dos pasos que constituyen la reacción de dismutación del O2.-. La importancia biológica de la Mn-SOD se ha demostrado entre otros hechos por los siguientes:
Cu/Zn-SOD (SOD-1) posee dos subunidades idénticas de unos 32 kDa, aunque a elevadas concentraciones de proteína en E. coli se encontró una estructura monomérica. Cada subunidad contiene un cluster metálico, el sitio activo, constituido por un átomo de Cu y otro de Zn. Mientras que la Mn-SOD existe en todos los tumores, y la relación de actividades Cu/Zn-SOD/Mn-SOD no difiere de la encontrada en tejidos normales, los tumores poseen menos Cu/Zn-SOD que los tejidos metabólicamente más activos. Por otro lado, la Mn-SOD es esencial para la vida, mientras que la Cu/Zn-SOD no lo es: los ratones con el gen Cu/Zn-SOD truncado aparentan ser normales y sólo muestran anomalías después de un daño traumático, mientras que los que tenían truncado el gen Mn-SOD no sobreviven más de tres semanas. Por otra parte, la supervivencia de ratones expuestos al 100% de oxígeno aumentó cuando se les inyectaron intravenosamente liposomas conteniendo SOD y CAT antes y durante la exposición.
EC-SOD es una glucoproteína tetramérica, que contiene Cu y Zn. Se ha encontrado en los espacios intersticiales de tejidos y también en fluidos extracelulares. La EC-SOD no es inducida por su sustrato u otros oxidantes, y su regulación en tejidos de mamíferos ocurre en primer lugar de un modo coordinado por citocinas, en vez de como respuesta de las células individuales a los oxidantes.
Catalasa. Es una enzima tetramérica, con cuatro subunidades idénticas de 60 kDa dispuestas tetraédricamente y contiene cuatro grupos de ferro-protoporfirina por molécula. Es una de las enzimas conocidas más eficientes, tanto que no puede ser saturada por H2O2 a ninguna concentración, catalizando su conversión en H2O y O2, para proteger a las células del H2O2que se genera en su interior. Con dadores de H (metanol, etanol, ácido fórmico, fenoles...) presenta actividad peroxidasa.
2H2O2 -> 2H2O + O2
ROOH + AH2 -> H2O + ROH + A
Por lo tanto, el H2O2 es catabolizado enzimáticamente en organismos aerobios por la catalasa y otras peroxidasas. En animales, el peróxido de hidrógeno se detoxifica mediante las actividades de la catalasa y la glutatión peroxidasa. Aunque la catalasa no es esencial para algunos tipos de células en condiciones normales, tiene un importante papel en la adquisición de tolerancia al estrés oxidativo en la respuesta adaptativa de las células. La catalasa captura el H2O2 antes de que pueda escapar de la célula y lo convierte en oxígeno molecular.
Glutatión peroxidasa. Está formada por cuatro subunidades idénticas, y cada una de ellas contiene un residuo de selenocisteína, que es esencial para su actividad enzimática. La GPX comparte su sustrato con la catalasa, pero además puede reaccionar de manera efectiva con lípidos y otros hidroperóxidos orgánicos, catalizando la reducción de diferentes hidroperóxidos (ROOH y H2O2) usando glutatión reducido (GSH), y así contribuye a la protección de las células de mamíferos contra el daño oxidativo.
ROOH + 2GSH -> ROH + GSSG + H2O
Se han encontrado al menos cinco isoenzimas de GPX en mamíferos. Aunque su expresión es ubicua, el nivel de cada isoforma varía dependiendo del tipo de tejido. La GPX citosólica ó mitocondrial (GPX1) reduce los hidroperóxidos de ácidos grasos y el H2O2 a expensas del glutatión. La GPX1 y la GPX4 (PHGPX o fosfolípido hidroperóxido GPX) se encuentra en más tejidos. La GPX4 se localiza tanto en la fracción citosólica como en la membrana. PHGPX puede reducir directamente los hidroperóxidos de los fosfolípidos, peróxidos de ácidos grasos y hidroperóxidos de colesterol, que se producen en las membranas peroxidadas y en las lipoproteínas oxidadas. La GPX1 se encuentra predominantemente en eritrocitos, riñón e hígado, y la GPX4 se expresa mayoritariamente en células del epitelio renal y en los testículos. La GPX2 citosólica (o GPX-G1) y la GPX3 extracelular (o GPX-P) se detectan escasamente en la mayoría de los tejidos, excepto en el tracto intestinal y el riñón, respectivamente. Recientemente se ha encontrado un nuevo miembro, la GPX5, que es independiente de selenio y se expresa específicamente en el epidídimo de ratón.
El ciclo rédox del glutatión es la mayor fuente de protección contra bajos niveles de estrés oxidativo, pero la catalasa es más importante a la hora de proteger contra el estrés oxidativo severo. En células animales, y especialmente en eritrocitos humanos, la principal enzima antioxidante para la detoxificación de H2O2 es la GPX, ya que la catalasa presenta mucha menos afinidad por el H2O2.
Una de las consecuencias del estrés oxidativo es la peroxidación lipídica, cuya prevención es esencial en todos los organismos aerobios, ya que los productos derivados de este proceso pueden interactuar con el DNA y son potencialmente mutágenos. Los epóxidos formados pueden reaccionar espontáneamente con centros nucleofílicos en la célula o unirse a los ácidos nucleicos (DNA y RNA). Esta reacción puede dar lugar a citotoxicidad, alergia, mutagénesis o carcinogénesis, dependiendo de las propiedades del epóxido en cuestión. En los organismos aerobios existen una gran variedad de sistemas de defensa antioxidante tanto enzimáticos como no enzimáticos, que se coordinan cooperativamente y protegen al organismo de los riesgos que conlleva el estrés oxidativo. Entre ellos destacan las actividades enzimáticas superóxido dismutasa (SOD), glutatión peroxidasa (GPX) y catalasa (CAT); además del ácido ascórbico (vitamina C), alfa-tocoferol (vitamina E), glutatión (GSH), beta-caroteno, vitamina A, flavonoides y ácidos fenólicos.
Por otro lado , también existe una relación entre los niveles de ROS celulares y el incremento ó descenso de las actividades de las enzimas antioxidantes. La adición de H2O2 causa un incremento, dosis dependiente, del mRNA de catalasa en células que se encuentran en crecimiento exponencial. Además, también se detecta un incremento de los niveles estacionarios del mRNA de GPX y SOD. Se han realizado experiencias en las que se ha observado que una sobreexpresión de alguna de las enzimas antioxidantes da lugar a un menor daño oxidativo. Cuando el DNA resulta dañado por radicales hidroxilo se produce la especie 8-oxo-2´-desoxiguanosina. La sobreexpresión de Cu/Zn-SOD y CAT causa un retardo en la acumulación de esta especie durante el crecimiento. Por otra parte, y como ejemplos del efecto protector de estas enzimas se expresó la catalasa peroxidasa de Cyanobacterium synechococcus en células animales, y las células transfectadas resultaron ser más resistentes a H2O2 que las células parentales. También, en otras cepas deficientes en SOD y CAT se observó un aumento de los niveles de O2.-. El descontrol de todas estas especies reactivas de oxígeno puede, por tanto, afectar a diferentes procesos esenciales del organismo, siendo una de las piedras angulares en la génesis de distintas patologías.
Superóxido dismutasa. Cataliza la reacción de destrucción de los radicales superóxido mediante su transformación en peróxido de hidrógeno, el cual puede ser destruido a su vez por las actividades catalasa o glutatión peroxidasa.
Mn-SOD es un homotetrámero de 96 kDa que contiene un átomo de Mn en cada subunidad. El átomo metálico cambia su estado de oxidación desde Mn(III) a Mn(II), volviendo de nuevo a Mn(III), durante los dos pasos que constituyen la reacción de dismutación del O2.-. La importancia biológica de la Mn-SOD se ha demostrado entre otros hechos por los siguientes:
- 1) La inactivación de los genes de Mn-SOD en E. coli aumenta la frecuencia de mutaciones cuando las bacterias crecen bajo condiciones aerobias.
- 2) La eliminación del gen en Saccharomyces cerevisiae aumenta su sensibilidad al oxígeno.
- 3) La falta de expresión de la enzima en ratones transgénicos da lugar a miocardiopatías y elevada mortalidad neonatal.
- 4) El factor de necrosis tumoral alfa (TNF-alfa) induce selectivamente el mRNA de Mn-SOD, pero no el de Cu/Zn-SOD, CAT o GPX en tejidos de ratón y en células cultivadas.
- 5) La transfección de cDNA de Mn-SOD en células cultivadas les confiere resistencia a la citotoxicidad inducida por paraquat (una sustancia que induce la generación intracelular de O2.-), TNF-alfa y adriamicina.
- 6) La expresión de genes humanos de Mn-SOD en ratones transgénicos los protege de lesiones pulmonares inducidas por oxígeno y toxicidad cardiaca inducida por adriamicina.
Cu/Zn-SOD (SOD-1) posee dos subunidades idénticas de unos 32 kDa, aunque a elevadas concentraciones de proteína en E. coli se encontró una estructura monomérica. Cada subunidad contiene un cluster metálico, el sitio activo, constituido por un átomo de Cu y otro de Zn. Mientras que la Mn-SOD existe en todos los tumores, y la relación de actividades Cu/Zn-SOD/Mn-SOD no difiere de la encontrada en tejidos normales, los tumores poseen menos Cu/Zn-SOD que los tejidos metabólicamente más activos. Por otro lado, la Mn-SOD es esencial para la vida, mientras que la Cu/Zn-SOD no lo es: los ratones con el gen Cu/Zn-SOD truncado aparentan ser normales y sólo muestran anomalías después de un daño traumático, mientras que los que tenían truncado el gen Mn-SOD no sobreviven más de tres semanas. Por otra parte, la supervivencia de ratones expuestos al 100% de oxígeno aumentó cuando se les inyectaron intravenosamente liposomas conteniendo SOD y CAT antes y durante la exposición.
EC-SOD es una glucoproteína tetramérica, que contiene Cu y Zn. Se ha encontrado en los espacios intersticiales de tejidos y también en fluidos extracelulares. La EC-SOD no es inducida por su sustrato u otros oxidantes, y su regulación en tejidos de mamíferos ocurre en primer lugar de un modo coordinado por citocinas, en vez de como respuesta de las células individuales a los oxidantes.
Catalasa. Es una enzima tetramérica, con cuatro subunidades idénticas de 60 kDa dispuestas tetraédricamente y contiene cuatro grupos de ferro-protoporfirina por molécula. Es una de las enzimas conocidas más eficientes, tanto que no puede ser saturada por H2O2 a ninguna concentración, catalizando su conversión en H2O y O2, para proteger a las células del H2O2que se genera en su interior. Con dadores de H (metanol, etanol, ácido fórmico, fenoles...) presenta actividad peroxidasa.
Glutatión peroxidasa. Está formada por cuatro subunidades idénticas, y cada una de ellas contiene un residuo de selenocisteína, que es esencial para su actividad enzimática. La GPX comparte su sustrato con la catalasa, pero además puede reaccionar de manera efectiva con lípidos y otros hidroperóxidos orgánicos, catalizando la reducción de diferentes hidroperóxidos (ROOH y H2O2) usando glutatión reducido (GSH), y así contribuye a la protección de las células de mamíferos contra el daño oxidativo.
El ciclo rédox del glutatión es la mayor fuente de protección contra bajos niveles de estrés oxidativo, pero la catalasa es más importante a la hora de proteger contra el estrés oxidativo severo. En células animales, y especialmente en eritrocitos humanos, la principal enzima antioxidante para la detoxificación de H2O2 es la GPX, ya que la catalasa presenta mucha menos afinidad por el H2O2.
Péptidos troyanos
Conseguir que una molécula determinada entre en una célula no es tarea fácil en muchas ocasiones. Y sin embargo, la transferencia de sustancias al interior celular, citoplasma o núcleo, nos proporciona una herramienta básica para estudiar el funcionamiento celular, para bloquear la traducción de un determinado RNA mensajero o para marcar células y poderlas rastrear a lo largo de procesos de migración o diferenciación. Eso sin olvidar el potencial terapéutico de estas técnicas.
El problema fundamental es el de conseguir que nuestra molécula atraviese la membrana citoplasmática, especialmente cuando estamos trabajando con compuestos hidrofílicos. Soluciones radicales son la inyección directa o la electroporación, pero se trata de técnicas relativamente complejas y con limitaciones cuando se tienen que aplicar in vivo. Por este motivo se ha desarrollado un enfoque original, basado en las inesperadas propiedades de los péptidos denominados "penetratinas" o péptidos troyanos [Derossi et al., Trends in Cell Biology 8:84-87 (1998)]. El origen de dichos péptidos es sorprendente. Su descubrimiento arranca de la observación, hecha a principios de los 90, de que el homeodominio de Antennapedia, un factor de transcripción de Drosophila, entra dentro de las células cuando se adicional al medio de cultivo. Pronto se comprobó que el mecanismo de entrada debía ser diferente de la simple endocitosis, ya que el péptido podía ser recuperado del interior de las células sin haber sufrido degradación. Recordemos que el homeodominio es una región muy conservada, de unos 60 aminoácidos, presente en los factores de transcripción codificados por los genes homeobox. Los homeodominios son precisamente las regiones de estos factores de transcripción que interaccionan con el DNA.
El homeodominio de Antennapedia esta formado por tres alfa-hélices. Pues bien, los investigadores que descubrieron esta insólita propiedad, comprobaron que la tercera hélice, comprendida entre las posiciones 43 y 58, era esencial para la capacidad penetradora del homeodominio. De hecho, bastaba con sustituir un triptófano y una fenilalanina en las posiciones 48 y 49 para que el homeodominio no entrara en las células. La tercera hélice no sólo se manifestó como necesaria, sino también como suficiente. Un oligopéptido sintético de 16 residuos (Figura 1) con la secuencia de la tercera hélice, fue denominado penetratina-1 [Derossi et al., J. Biol. Chem. 269:10444-10450 (1994)]. Este péptido tiene las mismas propiedades que el homeodominio de Antennapedia, entra rápidamente dentro de cualquier tipo de célula, alcanza el núcleo celular y puede ser recuperado sin degradación. La penetratina-1 dio lugar a toda una serie de péptidos sintéticos que compartían sus propiedades, péptidos generados, por ejemplo, invirtiendo la secuencia, utilizando d-aminoácidos en lugar de l-aminoácidos o sustituyendo determinados residuos.
¿Cuál es el mecanismo de penetración de estos péptidos? No está bien establecido, pero se piensa que los péptidos, ricos en aminoácidos cargados positivamente, interaccionan con fosfolípidos o glúcidos con carga negativa situados en la parte externa de la membrana. Esto llevaría a una desestabilización de la bicapa lipídica y a la formación de una micela invertida (esto es, una vesícula hidrofílica en su cara interna e hidrofóbica en su superficie externa) que atravesaría la membrana arrastrando el péptido al interior celular. Lo que no se sabe es si las propiedades de la tercera hélice de Antennapedia y otros homeodominios son aplicadas de forma natural para alguna función determinada.
Los péptidos troyanos pueden ser utilizados para transportar oligopéptidos u oligonucleótidos al interior celular. La carga puede unirse al azufre de una cisteína presente en la región comprendida entre la segunda y la tercera hélice de Antennapedia. El puente disulfuro del complejo así formado se rompe en el citoplasma liberando la "mercancía". Otra interesante posibilidad es la de producir proteínas de fusión expresando el péptido que se desea introducir unido al extremo C-terminal del péptido troyano. Con estas dos combinaciones se han conseguido introducir oligonucleótidos de 55 bases y péptidos de hasta 100 aminoácidos.
Las aplicaciones para la investigación básica y aplicada pueden ser muy importantes. Se pueden utilizar oligonucleótidos antisentido para inactivar RNA mensajero y bloquear la traducción de una proteína concreta. Se pueden introducir en las células péptidos bioactivos. Y, por supuesto, si es posible comprender los mecanismos precisos de internalización, se pueden diseñar vías de penetración celular de moléculas con interés terapéutico, con las importantes aplicaciones clínicas que esto supondría.
El problema fundamental es el de conseguir que nuestra molécula atraviese la membrana citoplasmática, especialmente cuando estamos trabajando con compuestos hidrofílicos. Soluciones radicales son la inyección directa o la electroporación, pero se trata de técnicas relativamente complejas y con limitaciones cuando se tienen que aplicar in vivo. Por este motivo se ha desarrollado un enfoque original, basado en las inesperadas propiedades de los péptidos denominados "penetratinas" o péptidos troyanos [Derossi et al., Trends in Cell Biology 8:84-87 (1998)]. El origen de dichos péptidos es sorprendente. Su descubrimiento arranca de la observación, hecha a principios de los 90, de que el homeodominio de Antennapedia, un factor de transcripción de Drosophila, entra dentro de las células cuando se adicional al medio de cultivo. Pronto se comprobó que el mecanismo de entrada debía ser diferente de la simple endocitosis, ya que el péptido podía ser recuperado del interior de las células sin haber sufrido degradación. Recordemos que el homeodominio es una región muy conservada, de unos 60 aminoácidos, presente en los factores de transcripción codificados por los genes homeobox. Los homeodominios son precisamente las regiones de estos factores de transcripción que interaccionan con el DNA.
El homeodominio de Antennapedia esta formado por tres alfa-hélices. Pues bien, los investigadores que descubrieron esta insólita propiedad, comprobaron que la tercera hélice, comprendida entre las posiciones 43 y 58, era esencial para la capacidad penetradora del homeodominio. De hecho, bastaba con sustituir un triptófano y una fenilalanina en las posiciones 48 y 49 para que el homeodominio no entrara en las células. La tercera hélice no sólo se manifestó como necesaria, sino también como suficiente. Un oligopéptido sintético de 16 residuos (Figura 1) con la secuencia de la tercera hélice, fue denominado penetratina-1 [Derossi et al., J. Biol. Chem. 269:10444-10450 (1994)]. Este péptido tiene las mismas propiedades que el homeodominio de Antennapedia, entra rápidamente dentro de cualquier tipo de célula, alcanza el núcleo celular y puede ser recuperado sin degradación. La penetratina-1 dio lugar a toda una serie de péptidos sintéticos que compartían sus propiedades, péptidos generados, por ejemplo, invirtiendo la secuencia, utilizando d-aminoácidos en lugar de l-aminoácidos o sustituyendo determinados residuos.
Los péptidos troyanos pueden ser utilizados para transportar oligopéptidos u oligonucleótidos al interior celular. La carga puede unirse al azufre de una cisteína presente en la región comprendida entre la segunda y la tercera hélice de Antennapedia. El puente disulfuro del complejo así formado se rompe en el citoplasma liberando la "mercancía". Otra interesante posibilidad es la de producir proteínas de fusión expresando el péptido que se desea introducir unido al extremo C-terminal del péptido troyano. Con estas dos combinaciones se han conseguido introducir oligonucleótidos de 55 bases y péptidos de hasta 100 aminoácidos.
Las aplicaciones para la investigación básica y aplicada pueden ser muy importantes. Se pueden utilizar oligonucleótidos antisentido para inactivar RNA mensajero y bloquear la traducción de una proteína concreta. Se pueden introducir en las células péptidos bioactivos. Y, por supuesto, si es posible comprender los mecanismos precisos de internalización, se pueden diseñar vías de penetración celular de moléculas con interés terapéutico, con las importantes aplicaciones clínicas que esto supondría.
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