apuntes de biología

Avances en la regeneración del miocardio infartado

En los últimos años, la mortalidad asociada a infartos de miocardio ha disminuido muy significativamente gracias a la implementación de eficientes procedimientos para la rápida reperfusión dentro de una estrecha ventana temporal. Sin embargo, los fallos cardíacos causados por el remodelado ventricular posterior al infarto se están haciendo cada vez más frecuentes, alcanzando ya proporciones epidémicas. El proceso de remodelado ventricular se caracteriza por una progresiva expansión del área inicial infartada y una dilatación de la luz del ventrículo izquierdo, con reemplazamiento de cardiomiocitos por deposiciones de tejido fibroso en la pared del ventrículo. Para millones de personas al año esta progresión desde el ataque cardíaco al fallo cardíaco es una dramática evidencia de que los actuales tratamientos farmacológicos no son, a largo plazo, un sustituto válido para los miocardiocitos muertos.

Para evitar el fallo cardíaco en circunstancias extremas se recurre al transplante de corazón. Una alternativa atractiva sería la reversión del remodelado ventricular gracias a la regeneración de miocardiocitos in situ.

Por otra parte, una componente integral del proceso de remodelado es el desarrollo de neoangiogénesis en el área miocárdica infartada. Sin embargo, en circuntancias normales la contribución de la neoangiogénesis a la red capilar del área infartada no es suficiente para garantizar las mayores demandas de oxígeno y nutrientes del miocardio hipertrofiado pero viable. Así pues, cabe sugerir que una estimulación de la neoangiogénesis podría mejorar la función cardíaca evitando la pérdida de cardiomiocitos hipertrofiados pero viables.

Muy recientemente (en abril de 2001), dos grupos de investigación independientes han publicado sendas contribuciones que suponen muy significativos avances en la búsqueda de procedimientos para regenerar el miocardio infartado.

Orlic et al. (Nature 410: 701-705, 2001) han demostrado que una población específica de células derivadas de la médula ósea podría ser clave para producir células cardíacas funcionales en corazones dañados. Dentro de la heterogénea población celular de la médula ósea de ratón, estos autores han podido determinar que la presencia de la proteína de superficie c-Kit y la ausencia de Lin caracterizan a una subpoblación de células multipotentes capaces de generar cardiomiocitos in situ una vez transferidos a una zona sana en contacto con el área dañada del corazón infartado. Cuando los autores realizaron esta transferencia en corazón infartado de un ratón, comprobaron que en un plazo de nueve días las células transferidas se habían adaptado notablemente a su nuevo ambiente y más de la mitad del área dañada estaba cubierta con células con las características propias de los cardiomiocitos. Estas células mantuvieron su capacidad replicativa y la función cardíaca mejoró significativamente.

Por otra parte, Kocher et al. (Nat. Med. 7: 430-436, 2001) han demostrado que en la médula ósea de humano adulto hay precursores endoteliales con las propiedades características de los hemangioblastos y que estas células pueden ser movilizadas, expandidas y usadas para inducir tanto vasculogénesis como angiogénesis, protegiendo de esta forma a los miocardiocitos hipertrofiados para que no entren en apoptosis y evitando el remodelado ventricular y el fallo cardíaco posterior a un infarto de miocardio experimental.

En conclusión, parece haberse encontrado el camino adecuado para favorecer la regeneración del miocardio infartado, tanto por la sustitución de los miocitos vivos por células multipotentes que se diferencien in situ a nuevos miocitos funcionales cuanto mediante la inducción de neoangiogénesis que garantice el suficiente abastecimiento de oxígeno y nutrientes para mantener funcional el miocardio hipertrofiado.

Un FGF-2 modificado acelera la cicatrización de las heridas

El proceso de cicatrización de una herida puede dividirse generalmente en tres etapas que se solapan. La primera etapa es la de inflamación, que se presenta en los tres primeros días de haberse herido el tejido; la lesión del tejido da lugar a la liberación de componentes de la sangre en la herida, que activan una cascada de formación de coágulos y proporcionan una matriz para la afluencia de células inflamatorias. La segunda etapa se inicia con la formación del tejido primario de cicatrización, que se presenta desde tres días después de haberse producido la herida a aproximadamente el décimosegundo día; se origina una población densa de fibroblastos, macrófagos, y neovasculatura embebida en una matriz holgada de colágeno, fibronectina y ácido hialurónico, es decir de matriz extracelular (MEC). La formación de nuevos vasos (angiogénesis) sobreviene por la abundante proliferación de células endoteliales en la herida, fundamental para asegurar el suministro de nutrientes y oxígeno a la zona de la lesión. Esta aportación de nutrientes es esencial para la síntesis, el depósito y la organización de la MEC [Satoh et al., Jpn. J. Pharmacol. 73: 59-71 (1997)]. La tercera etapa es la de remodelación de la MEC formada, que se extiende hasta aproximadamente seis meses después de producida la lesión; el tejido primario de cicatrización va siendo sustituido por tejido conectivo, con desvascularización y pérdida de células, fibronectina y colágeno tipo III. El tejido conectivo consta de un armazón de colágeno y fibras de elastina, que proporcionan al nuevo tejido propiedades elásticas y resistencia mecánica. Este armazón llega a saturarse luego con proteoglucanos y glucoproteínas. La remodelación implica la síntesis de nuevo colágeno (tipo I) y la degradación del colágeno viejo. El producto final de la formación y remodelación de la matriz es el tejido de la cicatriz.

A nivel bioquímico los procesos que intervienen en la cicatrización de una herida se conocen tan sólo superficialmente, aunque es evidente que, sobre el componente celular, al menos in vitro, ejercen efectos factores de crecimiento tales como el transformante-beta (TGF-ß), el derivado de plaquetas (PDGF), epidérmico (EGF), o fibroblástico (FGF). Este último factor es el que ocupa nuestro interés.

Los FGFs fueron aislados por primera vez en los años 70 a partir de extractos de cerebro bovino, basándose en su carácter mitogénico y angiogénico. Posteriores estudios establecieron que los FGFs constituyen una familia de veinte proteínas monoméricas estructuralmente relacionadas (peso molecular entre 16.000 y 18.000), con diversas actividades y producidas en algún momento durante el desarrollo de tejidos tales como epitelio, músculo, conectivo y nervioso. Debido a que los FGFs han perdido la secuencia del péptido señal, el cual determina en otros factores de crecimiento su secreción extracelular vía retículo endoplásmico rugoso/aparato de Golgi, se ha sugerido que su liberación fuera de la célula puede darse siguiendo una ruta exocítica independiente [Mignatti et al., J. Cell Biochem. 47: 201-207 (1991)]. Las lesiones por heridas provocan una importante liberación de FGFs, ya que la membrana plasmática de las células dañadas se vuelve permeable a moléculas grandes, permitiendo una difusión libre hacia el espacio extracelular [Mutsukrishnan et al., J. Cell Physiol. 148: 1-16 (1991)].

La forma básica del FGF (bFGF o FGF-2) es un factor de crecimiento multifuncional que ejerce una profunda influencia en la fisiología de la cicatrización de las heridas. Su modo de acción incluye la modulación de poblaciones de células madre, así como de la expresión de genes específicos que codifican para las proteínas de MEC, receptores celulares, proteasas de MEC e inhibidores de las mismas. Numerosos estudios en animales han demostrado la eficacia del FGF-2 exógeno al favorecer la cicatrización de las heridas, lo que ha llevado también a su utilización clínica, para ser empleado en las heridas que se producen como consecuencia de la práctica quirúrgica cotidiana, para la reparación ósea, así como para el tratamiento de úlceras (de piel y digestivas) y quemaduras en pacientes diabéticos, cuya velocidad de cicatrización está reducida a la mitad [Gospodarowicz et al., Endocr. Rev. 8: 95-114 (1987)]. A pesar de su gran potencia angiogénica y mitogénica, el FGF-2 se degrada rápidamente cuando se inyecta o es ingerido, llegándose a perder hasta un 99% de su actividad mitogénica en poco tiempo. En los últimos años, se han realizado estudios para preservar su actividad biológica, así como para aumentar la estabilidad proteica del FGF-2 [Edelman et al., Biomaterials 12: 619-626 (1991)].

Los estudios clínicos realizados hasta ahora, usando el FGF-2 como agente terapéutico, no han llegado muy lejos debido a la disponibilidad limitada de este factor en las cantidades que se necesitan. Se requieren grandes cantidades de FGF-2 de grado farmacéutico, es decir, de constatada eficacia y libre de contaminantes de fácil transmisión, omnipresentes en productos extraídos de animales y en particular de fuentes humanas. Por lo tanto, es deseable desarrollar mecanismos para preparar grandes cantidades de FGF-2 maduro, sintético, donde, además, se elimine cualquier posibilidad de presencia de material contaminante en el producto final. Esas dos características se consiguen a través del diseño genético y la expresión a gran escala de FGF-2 recombinante humano (rhFGF-2) en Escherichia coli, así como su purificación y renaturalización hasta alcanzar su máxima actividad biológica. De esta manera se pueden generar grandes cantidades de rhFGF-2 biológicamente activo a partir de microorganismos procariotas que, a diferencia del desarrollado en células eucariotas a partir de ARNm, donde la disponibilidad de material es el factor limitante, representan una fuente prácticamente inagotable para la expresión, síntesis y secreción de proteínas. Además, la inocuidad de la proteína sintética, frente a la obtenida de extractos de origen animal, está asegurada.

Puesto que el FGF-2 es un agente pleiotrópico, es decir, que estimula, inhibe y modula procesos celulares de manera tiempo- y dosis-dependiente, es esencial controlar su liberación en el lugar deseado y su biodisponibilidad mientras se necesite de su acción como agente terapéutico. En este sentido, nuestro grupo de investigación ha producido recientemente un rhFGF-2 cuya novedad reside en la incorporación de una secuencia aminoacídica auxiliar (correspondiente al dominio molecular modificado del factor de von Willebrand), de alta afinidad de unión específica al colágeno tipo I, que confiere al factor propiedades únicas y exclusivas [Andrades et al., Growth Factors 18: 261-275 (2001)]. De esta forma, este factor de crecimiento, que hemos llamado rhFGF-2-F2, puede ser almacenado por tiempos prolongados, y ser dirigido a dianas celulares-tisulares específicas donde se precise su actuación, controlando su liberación y preservando su estabilidad o vida media, acentuando así su potencial como agente terapéutico en la cicatrización de heridas y en otros procesos de reparación tisular. El tratamiendo de heridas cutáneas incisivas por aplicación ectópica de rhFGF-2-F2 en animales diabéticos acelera significativamente la cicatrización de las mismas, cuando se compara con la misma aplicación del factor comercial. La especial utilidad de este factor se ve reforzada aún más cuando se aplica ectópicamente mezclado con un gel de colágeno tipo I, provocando una mayor velocidad en la reparación de las heridas, reduciendo el tiempo de cicatrización en animales diabéticos, hasta llevarlo a valores comparables a los animales normales. Según los estudios realizados in vitro, podemos pensar que la secuencia aminoacídica de unión específica al colágeno estaría incorporando al rhFGF-2-F2 la capacidad de unirse específicamente al colágeno tipo I, que actuaría de carrier. Una vez que este apósito (factor + colágeno) es colocado en la herida fresca, la presencia de enzimas del tipo colagenasa, cuya aparición en los primeros días de cicatrización ha sido demostrada, ocasionaría una lenta liberación del rhFGF-2-F2 desde la matriz colagénica a la que está unido hacia el componente celular implicado en la cicatrización (células responsables de la inflamación, células endoteliales, fibroblastos encargados de sintetizar más matriz de colágeno). En este caso, el colágeno tipo I ejercería como modulador fisiológico en la liberación de la proteína hacia las células diana, consiguiéndose así una mayor y mejor disponibilidad del factor por dichas células. El hecho de que la máxima tasa de cicatrización, tanto en animales normales como diabéticos, se consiga cuando el rhFGF-2-F2 se aplica combinado con colágeno tipo I, refuerza la idea de que la secuencia polipeptídica introducida está incorporando a la proteína de fusión resultante una mayor y/o más duradera actividad biológica. Este hecho también ha sido discutido para un rhTGF-ß1 producido por nosotros con similares características, y empleado con éxito en la inducción condro-osteogénica [Gordon et al., Hum. Gene Ther. 8: 1385-1394 (1997); Andrades et al., Exp. Cell Res. 250: 485-498 (1999); Becerra et al., Med. Clin. 116: 23-34 (2001)]. Las posibilidades que ofrece el uso de factores de crecimiento modificados como agentes terapéuticos, suponen un avance primordial en el desarrollo de procedimientos alternativos para mejorar la capacidad de reparación tisular.

¿Existe un citosqueleto en procariotas?

La transición de procariotas a eucariotas ha sido uno de los hitos más importante en la evolución de los seres vivos. En la comprensión de cómo se produjo dicha transición han sido importantísimas las aportaciones conceptuales de Lynn Margulis, y en especial su audaz propuesta, hoy generalmente aceptada, de que mitocondrias y cloroplastos derivan de procariotas endosimbióticos que se asociaron a otros procariotas. La formación de un compartimento nuclear diferenciado del citoplasma y el desarrollo de un citosqueleto son otras dos marcas características de los eucariotas.
Hoy vamos a tratar del citosqueleto y su origen. Como es sabido, los filamentos de actina, junto con toda una serie de proteínas que modulan su funcionalidad, forman un entramado que no sólo es fundamental para dar forma y soporte mecánico a la célula, sino para procesos tales como la migración celular, la fagocitosis, la división celular, el movimiento de proteínas motoras que la utilizan como guía, etc. La actina es muy abundante, alcanzando el 5% de la proteína total en una célula animal típica. Otros elementos del citosqueleto son los filamentos intermedios, de diferentes tipos según la clase de célula, y los microtúbulos de tubulina.
El origen del citosqueleto se relaciona, como ya hemos dicho, con la transición procariota/eucariota, del mismo modo que el núcleo celular o las mitocondrias. La cuestión es cómo se produjo dicho origen. Esta cuestión ha recibido una sorprendente respuesta gracias a dos trabajos publicados en los últimos meses en una competencia que emula a la de las famosas regatas en el Támesis. Por un lado, el grupo de Jeffery Errington, en la Universidad de Oxford, ha descubierto que filamentos muy similares a los de actina, formados por las proteínas MreB y Mbl, controlan la forma de las bacterias [Jones et al., Cell 104:913-922 (2001)]. Por otro, el equipo de Jan Löwe en Cambridge ha demostrado que la proteína MreB polimeriza en filamentos estructuralmente muy similares a los de la F-actina [van den Ent et al., Nature 413:39-44 (2001)]. Vamos a intentar explicar el alcance de estos dos sorprendentes descubrimientos, que se unen a la constatación, hecha hace algunos años, de que las bacterias tienen una proteína similar a la tubulina, denominada FtsZ, que forma filamentos implicados en la división celular.
El estudio de estos grupos se ha centrado básicamente en dos proteínas que ya se conocían en bacterias, denominadas MreB y Mbl. Ambas presentan similaridades superficiales con las proteínas pertenecientes a la superfamilia de la actina, aunque esto, en principio, no quería decir nada. A esta superfamilia pertenecen también enzimas como la hexosaquinasa (que fosforila azúcares) o chaperonas como la DnaK/Hsp70 (por heat shock protein). Estas proteínas no tienen nada que ver con el citosqueleto. Lo que hizo el grupo de Oxford fue generar anticuerpos policlonales contra las dos proteínas, MreB y Mbl e intentar localizarlas por inmunofluorescencia al microscopio confocal en la bacteria Bacillus subtilis, que normalmente tiene forma de bastoncillo, es decir, alargada. Para su sorpresa observaron que las proteínas parecían disponerse en una estructura en forma de hélice dextrógira que recorría la bacteria inmediatamente por debajo de la membrana plasmática, en un plano transversal al eje mayor. Dicha estructura daba entre una vuelta y una vuelta y cuarto a la periferia celular. Por otro lado el número de bandas fluorescentes parecía pasar de una a dos o incluso más en los momentos previos a la división celular, sugiriendo algún proceso, acoplado al ciclo celular, de replicación o síntesis de la estructura. Por otro lado, procedieron a generar cepas mutantes inducibles de Bacillus subtilis que dejaban de expresar mreB cuando se retiraba un componente del medio de cultivo. Las bacterias morían al cabo de un tiempo, pero resultó interesante que antes de morir sufrieran espectaculares cambios en su forma. Se inflaban y redondeaban, perdiendo su aspecto alargado. La disrupción del gen mreB, por tanto, resultaba en una pérdida de control del diámetro celular.
En cuanto a la proteína Mbl, también aparecía en forma de estructuras filamentosas y helicoidales dextrógiras, pero situadas a lo largo de la bacteria, en lugar de transversalmente a ella. Esto le da a la estructura una forma de 8.
Los autores calcularon el número de moléculas de MreB y Mbl por bacteria, y obtuvieron una cifra de 8000 y 12000-14000, respectivamente. Esta cantidad es más que suficiente para justificar una estructura microscópica del tamaño observado.
Quizá uno de los resultados más llamativos obtenidos por estos investigadores fue el obtenido mediante la búsqueda de genes similares a mreB en distintas bacterias. Después de un exhaustivo recorrido por las bases de datos, pudieron establecer dos grupos de procariotas, según tuvieran o no genes similares a mreB. En el primer apartado se agrupaban bacterias alargadas como Bacillus subtilis, Escherichia coli, Pseudomonas fluorescens,Haemophilus influenzae y la arquea Methanobacterium thermoautotrophicum. También tienen genes mreB bacterias filamentosas como Streptomyces coelicolor y helicoidales como Treponema pallidum o Helicobacter pylori. En cambio, bacterias esféricas (cocos) como Streptococcus pneumoniae,Staphylococcus aureus, Synechocystis sp o las arqueas Pyrococcus horikoshii y Methanococcus janaschii, no tienen genes parecidos a mreB.
Varias consecuencias se pueden extraer de esta observación. Por otro lado parece que la presencia o ausencia de MreB está perfectamente correlacionada con la morfología de la bacteria. A menos que exista esta proteína, la bacteria adopta una forma esférica. Por otro lado, los genes que controlan la forma bacteriana mediante la síntesis de estas estructuras helicoidales, se distribuyen por los dos grandes grupos de procariotas, Eubacterias y Arqueas. Hubiera sido un hallazgo de gran interés filogenético que uno de los dos grupos compartiera con los Eucariotas un carácter derivado como son las proteínas citosqueléticas, pero no es así. Dichas proteínas debieron estar ya presentes en los antepasados comunes de los tres grandes grupos de seres vivos, Eubacterias, Arqueas y Eucariotas.
La comparación de la secuencia de MreB con la de la actina de los eucariotas revela un porcentaje total de homología muy bajo, pero con interesantes coincidencias en zonas especialmente importantes. Dichas zonas parecen estar bien conservadas, y probablemente son claves para la función de la proteína, ya que mutaciones puntuales, con sustitución de un sólo aminoácido, la convierten en no funcional. Por otra parte el alineamiento de las secuencias requiere muy pocos "gaps" o espacios, lo que indica no sólo un tamaño similar de ambas proteínas, lo que ya se sabía, sino además un espaciamiento similar de las zonas conservadas.
Los autores del artículo de Cell concluyen que MreB y Mbl forman estructuras filamentosas, probablemente por ensamblaje de los monómeros proteicos en polímeros. Dichas estructuras se dispondrían según el modelo representado en la figura, lo que explicaría que MreB y Mbl controlen, respectivamente, la anchura y la longitud de la célula.

La polimerización de MreB es exactamente lo que han demostrado los autores del segundo artículo. El grupo de Cambridge ha purificado la proteína MreB de la bacteria Thermotoga maritima y la ha sometido a ensayos de polimerización in vitro. Así han demostrado que MreB forma polímeros sólo si se encuentra en presencia de ATP o GTP. Es importante recordar que la polimerización de la actina también es dependiente de la hidrólisis de ATP. Los polímeros de MreB, observados al microscopio electrónico, recuerdan a los filamentos de actina, con una diferencia importante. Los protofilamentos de actina, formados por un alineamiento de monómeros, suelen asociarse por pares girando uno alrededor del otro, en forma de doble hélice. Los protofilamentos de MreB también están asociados por pares, pero dispuestos paralelamente. La distancia entre monómeros en los protofilamentos es de 51Å, ligeramente inferior a los 55 Å de la actina. Los autores del artículo de Nature lograron cristalizar MreB y determinar su estructura atómica mediante difracción de rayos X. La estructura tridimensional resultó ser casi idéntica a la de la actina, con dos dominios divididos cada uno en dos subdominios. Es decir, que a pesar de las grandes diferencias en estructura primaria, en la secuencia de aminoácidos, de las que hablábamos antes, las regiones conservadas parecen determinar una estructura terciaria muy similar en MreB y en actina.Conocida la estructura tridimensional de MreB, es posible calcular que las 8000 moléculas de MreB bastan para ensamblar un polímero de 41 micrómetros de longitud. Dado que los filamentos observados por Jones y cols. miden alrededor de 3 mm, deberían estar formados por una decena de protofilamentos, probablemente suficiente para garantizar rigidez mecánica y mantener la forma de la bacteria.
A partir de ahora se abren interesantes interrogantes. Por ejemplo, ¿existe un mecanismo regulador de la polimerización y despolimerización en MreB y Mbl, igual al existente en actina? Este mecanismo es fundamental para la motilidad de las células eucariotas, y quizá su precursor estuviera ya presente en procariotas. Por otro lado, puesto que en procariotas se han descubierto ya precursores de los filamentos de actina y de los microtúbulos, ¿que sucederá con los filamentos intermedios? ¿Serán los únicos elementos citosqueléticos realmente eucariotas?