apuntes de biología

Aproximaciones proteómicas a los sistemas biológicos

Desde hace mucho tiempo, los científicos conocen que desde las moléculas más pequeñas que conforman las células, como los genes o las proteínas, hasta los propios organismos, pasando por las células y los tejidos, interactúan entre sí de manera muy compleja, y que estudiar una pequeña parte de todo este intrincado sistema es insuficiente. No obstante, la comunidad científica ha tenido que conformarse con realizar estudios reduccionistas de estos sistemas complejos debido principalmente a limitaciones técnicas. Afortunadamente, día a día, estas carencias tecnológicas se van superando y, hoy por hoy, es posible abordar multitud de estudios de sistemas complejos con una perspectiva más amplia, algo que hace tan sólo unos años era pura utopía. Así, por ejemplo, se han desarrollado una serie de disciplinas que poseen el sufijo «ómica», como las genómica, proteómica, metabolómica y otras, que pretenden dar una visión de conjunto que se aproxime un poco mejor, si cabe, a lo que sucede realmente in vivo.

De entre estas disciplinas que pretenden dar una visión de conjunto de lo que ocurre en un tipo celular o un tejido, la que se centra en las proteínas se denomina proteómica. La proteómica se podría definir como una serie de métodos y técnicas destinados a estudiar el conjunto de proteínas que se expresan en una célula o tejido bajo unas condiciones dadas, lo que se conoce como el proteoma. Además, las técnicas proteómicas permiten estudiar los cambios postraduccionales que sufren las proteínas y las interacciones que se producen entre las proteínas, y de éstas con otras moléculas. Las proteínas que se expresan en un tipo celular o en un tejido concreto actúan de un modo coordinado para responder ante un estímulo dado como, por ejemplo, la presencia de un fármaco. Estudiar estos cambios globales desde el punto de vista del proteoma es lo que se propone esta aproximación: la proteómica.

Dentro de las aproximaciones proteómicas podemos distinguir principalmente dos bloques de técnicas de análisis de proteínas. En el primero se incluyen técnicas en las que las proteínas a estudiar no se separan, por ejemplo, las matrices de anticuerpos y de otras moléculas como alérgenos, glúcidos, otras proteínas, etc. En el segundo bloque se incluyen técnicas que implican una separación de las proteínas, como es el caso de la electroforesis bidimensional (electroforesis-2D) y la cromatografía líquida (LC).

Las matrices de anticuerpos permiten estudiar la expresión de un elevado número de proteínas en una sola matriz diseñada para tal fin. Esta técnica consiste en «pegar» anticuerpos a una superficie sólida de manera ordenada y localizada en puntos (spots). A continuación se pone en contacto la muestra objeto de estudio, por ejemplo un lisado celular, con la matriz, con lo que se consigue el reconocimiento y la unión específica proteína-anticuerpo. Esta unión se puede detectar de diversos modos: bien utilizando un anticuerpo secundario, o bien marcando las proteínas de la muestra con un fluoróforo o isótopo radioactivo en un paso previo a la incubación con la matriz. De modo análogo, se pueden «pegar» a la matriz otro tipo de moléculas (azúcares, sustratos enzimáticos o incluso ácidos nucleicos) para estudiar su interacción con las proteínas de la muestra de estudio. A modo de ejemplo de trabajos en los que se han usado estos métodos, Sreekumar et al. [Cancer Res., 61: 7585-93 (2001)], desarrollaron una matriz con 149 anticuerpos y la aplicaron a un modelo de células de carcinoma de colon. Como resultado, encontraron no sólo varias proteínas cuya regulación por radioterapia se conocía (p53; DR5: death receptor-5), sino también algunas para las que dicha regulación era desconocida (DFF40/CAD:DNA fragmentation factor-40/caspase-activated DNase; CEA: antígeno carcinoembrionario).

Entre las técnicas que sí separan las proteínas, la LC está cobrando cada vez más importancia por su utilidad cuando se quieren separar proteínas pequeñas. En esta técnica, las proteínas de la muestra interaccionan con una fase estacionaria de un modo característico, lo que se aprovecha para su separación.Utilizando la LC se pueden resolver un gran número de proteínas. Por ejemplo, mediante la LC y la espectrometría de masas (MS) se separaron e identificaron 1484 proteínas de levadura en un único experimento [Yates et al., Nat. Biotechnol., 19: 242-47 (2001)]. Por otra parte, la técnica de separación de proteínas por excelencia es la electroforesis-2D. En este caso, las proteínas se separan en una primera dimensión en función de su punto isoeléctrico para, posteriormente, separarse ortogonalmente en una segunda dimensión en función de su masa. Esto da lugar a una serie de puntos, cada uno de los cuales corresponde a una proteína. Con esta técnica se pueden separar varios miles de proteínas en un solo gel. Como ejemplo, obsérvese el ingente número de puntos resuelto en un único gel realizado en nuestro laboratorio a partir de una minúscula biopsia de intestino delgado (ver figura 1).

Figura 1. Gel 2D realizado con un extracto de proteínas de intestino delgado humano. Se indican las direcciones de la primera y segunda dimensión. Tinción: azul de Coomassie coloidal.

Tanto la LC como la electroforesis-2D requieren otras técnicas para identificar las proteínas separadas, siendo de especial importancia para ello el desarrollo de la MS. Con esta técnica se puede calcular de forma muy precisa y exacta la masa de las moléculas. Inicialmente, las moléculas se volatilizan en forma de iones. A continuación, dichos iones pasan a un sistema analizador de masas en vacío, que usa campos eléctricos (sistemas cuadrúpolos y trampas iónicas) o no (sistemas de tiempo de vuelo), capaz de separar los iones en virtud de su relación masa/carga (m/z). Finalmente, los iones llegan a un detector y se determina su masa gracias a la separación efectuada en el paso anterior. Existen distintas variantes para la volatilización/ionización de las moléculas, entre las que destacan, por su aplicabilidad a los péptidos y las proteínas, la ionización por electrospray (ESI) y la desorción/ionización mediante láser asistida por una matriz (MALDI). En el primer caso (ESI), las moléculas en disolución se hacen pasar por un fino capilar sometido a un intenso campo eléctrico. Así, se obtiene una dispersión de la solución en microgotas en las que el solvente se evapora y las moléculas pasan a la fase gaseosa y adquieren carga. En el segundo caso (MALDI), las moléculas se mezclan con una matriz sólida absorbente de luz. Sobre esta matriz se hace incidir un láser que provoca la ionización y desorción de las moléculas, que quedan en fase gaseosa. Tras la ionización de las moléculas por un método u otro, éstas se someten a la MS. Aunque es posible emplear la MS para calcular la masa de proteínas completas, cuando se quieren identificar éstas, habitualmente se digieren con proteasas (por ejemplo: tripsina) y son los péptidos resultantes los que se someten a la MS para obtener sus masas moleculares. Cada proteína presenta un patrón muy específico de péptidos o "huella dactilar peptídica" tras digerirla con proteasas concretas que cortan por sitios específicos. Esta característica permite identificar las proteínas contrastando las masas moleculares de los péptidos obtenidos, tras la digestión de la proteína a analizar, con las bases de datos que contemplan las masas moleculares de los péptidos que se obtendrían, teóricamente, tras digerir cada proteína codificada por el genoma de un organismo. Este proceso es posible cuando se encuentra secuenciado el genoma completo de la especie objeto del estudio.

Otra técnica utilizada habitualmente en las aproximaciones proteómicas es la espectrometría de masas en tándem (MS/MS). Este método consiste en someter una mezcla de péptidos a una primera MS donde se separan en función de su relación m/z. A continuación, se ajustan los instrumentos para seleccionar una relación m/z determinada correspondiente a un péptido concreto, el cual se introduce en una cámara de colisión. En dicha cámara, el esqueleto de enlaces peptídicos de las moléculas del péptido escogido se fragmenta predominantemente una sola vez. Con este procedimiento se obtiene una mezcla de «péptidos hijos» que se somenten a una segunda MS, lo que da lugar a una "escalera" de tamaños en la que la diferencia entre cada "peldaño" corresponde a un solo aminoácido, lo que permite deducir la secuencia peptídica. Obtenida esta secuencia "real" de la proteína, se puede buscar en las bases de datos a qué proteína "teórica" corresponde.

Las aproximaciones proteómicas también incluyen estudios de las modificaciones postraduccionales que sufren las proteínas, las cuales con frecuencia juegan un papel fundamental en la regulación de su actividad. Existen multitud de modificaciones postraduccionales: fosforilaciones, metilaciones, acetilaciones… (http://av.bmbq.uma.es/bma/apuntes/T16/modCov.ht), muchas de ellas relacionadas con las vías de transducción de señales y los procesos celulares. La importancia de estas modificaciones ha llevado al desarrollo de técnicas para conocer qué tipos de modificaciones ocurren y en qué residuos de la proteína se producen. Algunas de estas técnicas se centran en un tipo de modificación concreta, como las fosforilaciones. En este caso, se puede enriquecer la muestra en proteínas fosforiladas utilizando una inmunoprecipitación con anticuerpos específicos para fosfopéptidos y, tras digerir con tripsina, los fragmentos resultantes se pueden analizar por MS e identificar las proteínas que han sufrido esta modificación. Existen otras metodologías (entre ellas la MS/MS) que permiten estudiar múltiples modificaciones de forma simultánea. Utilizando algunas de estas técnicas, en un trabajo reciente se identificaron 73 modificaciones postraduccionales, entre las que se incluyen fosforilaciones, metilaciones, oxidaciones y acetilaciones, en 11 familias de proteínas del cristalino [MacCoss et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99: 7900-5 (2002)].

Para dar una pincelada de la utilidad de las aproximaciones proteómicas en la resolución de una gran diversidad de incógnitas, sirvan de ejemplo algunos de los estudios que se han llevado a cabo utilizando estas técnicas. Así, se ha conseguido encontrar potenciales marcadores diagnósticos de infecciones de Neisseria meningitidis, con el consiguiente beneficio para detectar dichas infecciones de manera inequívoca y poder aplicar así un tratamiento adecuado [Steller et al., Proteomics, 5: 2048-55 (2005)]. Se han podido estudiar en detalle la virulencia y la respuesta de un patógeno fúngico (de gran repercusión en la agricultura) al tratamiento con un antifúngico de uso generalizado, lo que hace posible conocer mejor los mecanismos de infección y patogenia, aspectos clave para poder mejorar los tratamientos y disminuir los efectos colaterales del antifúngico [Hooshdaran et al., Methods Mol. Med., 118: 57-70 (2005)]. En otro estudio, se han identificado potenciales marcadores tempranos en la hepatocarcinogenia que podrían servir para disminuir el tiempo de diagnóstico y mejorar el tratamiento de esta enfermedad [Fella et al., Proteomics, 5: 1914-27 (2005)]. También se han identificado proteínas marcadoras implicadas en la iniciación de los procesos apoptósicos en los colonocitos preneoplásicos, que podrían ser muy útiles en el desarrollo de nuevas estrategias contra la prevención del cáncer [Herzog et al., Int. J. Cancer, 109: 220-9 (2004)]. Finalmente, se han identificado unas proteínas del polen que actúan como alérgenos, por lo que este trabajo es muy útil para el diagnóstico clínico y la inmunoterapia de las alergias [Cortiet al., Proteomics, 5: 729-36 (2005)].

Metaloproteinasas de la matriz extracelular 
como dianas antineoplásicas

Imaginemos un tumor: todo comienza con acontecimientos puntuales en una célula sana que forma parte de un tejido. Esta célula va a ir desarrollando una serie de capacidades que constituyen el denominado fenotipo tumoral: a) la proliferación en ausencia de señales de crecimiento, b) la insensibilidad a las señales de parada de la proliferación, c) el escape de la apoptosis, d) la capacidad de replicación ilimitada, e) la activación continuada de angiogénesis y f) la invasión de los tejidos y la metástasis (Hanahan y Weinberg, 2000 Cell, 100, 57-70).

Muchos grupos de investigación estudian aproximaciones terapéuticas para frenar el desarrollo tumoral, fundamentándose en un riguroso estudio de los mecanismos moleculares que se dan en el tumor. Uno de los acontecimientos clave en la «malignización» del tumor es la degradación de la matriz extracelular (MEC). Pensemos que, tanto para el crecimiento del tumor como para la invasión del tejido, las células neoplásicas deben degradar los distintos componentes de la matriz en la que están embebidas. Igualmente, la degradación de la MEC es fundamental para la angiogenia [formación de vasos sanguíneos a partir de la red sanguínea preexistente, (I. Fajardo, 1997 Encuentros en la Biología, 38)].

La MEC está formada por muchos componentes distintos interconectados que se pueden clasificar en tres grandes grupos: proteoglucanos y glucosaminoglucanos, proteínas estructurales (como el colágeno y la elastina), y proteínas de adhesión (como la fibronectina y la laminina). Tal variedad de componentes requieren toda una familia de enzimas líticas para su degradación: las metaloproteinasas de matriz extracelular (MMP), que son endopeptidasas dependientes de zinc.

Se han descrito 24 genes distintos que codifican diferentes MMP; éstas se clasificaron en un primer momento en función de la especificidad del sustrato (colagenasas, gelatinasas, estromelisinas y matrilisinas), pero actualmente se clasifican en función de la estructura de la enzima. La estructura básica de las MMP presenta una serie de dominios característicos: un péptido señal que dirige la secreción al exterior de la célula, un propéptido que mantiene a la enzima inactiva hasta que sufre un corte proteolítico y un dominio catalítico carboxiterminal que une zinc. Sobre esta estructura básica aparecen diversas variantes, como un dominio de tipo hemopexina que media en la especificidad del sustrato y las interacciones con inhibidores endógenos, o un dominio transmembranario en el caso de las MMP asociadas a la membrana plasmática (véase la figura). Así, en la clasificación estructural se distinguen ocho grupos: cinco grupos de MMP secretadas y tres de MMP asociadas a la membrana (MT-MMP por membrane type MMP) (Egeblad y Werb, 2002 Nature Reviews Cancer 2, 163-176; Folgueras y cols., 2004 Int. J. Dev. Biol., 48, 411-424).

Las MMP se sintetizan como zimógenos (inactivas) y es necesario activarlas con un corte proteolítico en el propéptido del dominio aminoterminal. El proceso de activación de las proMMP varía según la enzima, pero suelen intervenir otras proteasas, como el activador de plasminógeno del tipo urocinasa (uPA) y las propias MMP.

Como contrapartida a la actividad de las MMP, existen muchas moléculas endógenas capaces de inhibir su acción: los inhibidores hísticos de las metaloproteinasas (TIMP) y los inhibidores plasmáticos, como la macroglobulina a2. Además, las MMP están reguladas también tanto trascripcional como post-transcripcionalmente (estabilización del mRNA, glucosilaciones...), y su transcripción se induce en respuesta a las citocinas, los factores de crecimiento, los agentes químicos, el estrés físico, los oncogenes activados y las interacciones con la MEC. Con estas herramientas se ejerce una fina regulación de la actividad de las MMP y su acción se restringe a determinados procesos fisiológicos como el desarrollo embrionario, procesos reproductivos y la remodelación de los tejidos. Por el contrario, muchos estados patológicos están asociados a una desregulación de las MMP, entre ellos el cáncer.

En el cáncer, además de por razones estructurales relacionadas con el crecimiento de la masa tumoral y la invasión de los tejidos, la acción degradativa de las MMP sobre la MEC es muy importante porque es capaz de alterar las uniones célula-MEC y célula-célula, mediar la liberación, activación o desactivación de moléculas señalizadoras autocrinas o paracrinas (activadores de angiogénesis, por ejemplo) y activar o inactivar los receptores de la superficie celular(Sternlicht y Werb 2001, Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 17, 463–516). En general, lo que hacen las MMP es crear un ambiente favorable para el desarrollo de un tumor, un microambiente que promueve la «malignización». Por este motivo, se estudian terapias antineoplásicas sobre la base de modificar la acción de las MMP. Existen muchas referencias en este sentido en las que se generan ratones transgénicos y genosuprimidos (knock-out) en los genes de las MMP, los cuales se usan como modelos para los estudios de desarrollo neoplásico, con lo que se identifican cuáles son las mejores dianas de uso terapéutico. Por poner algunos ejemplos, se ha visto que el ratón genosuprimido para Mmp2 (Mmp2-/-) presenta un menor crecimiento tumoral y una disminución de la carcinogenia pancreática; el ratón Mmp9-/- presenta una disminución de la carcinogenia de la piel y del páncreas, y menos metástasis (para una revisión, véase Folgueras y cols., 2004 Int. J. Dev. Biol., 48, 411-424). El problema con este tipo de metodología es que existe una gran variedad de MMP, con lo que el bloqueo de una de ellas no suele ser suficiente para frenar su acción. Aún así, se obtienen resultados muy interesantes para su aplicación terapéutica. Las estrategias que se están usando para la inhibición de las MMP en terapia antineoplásica son las siguientes:

- Interceptar la transcripción para bloquear su síntesis. Esto se consigue de tres maneras distintas: bloqueando la acción de factores extracelulares (la propia molécula o su receptor), bloqueando las rutas de transmisión de señales (vías de MAPK, p38MAPK, Ras o TGF-ß) y bloqueando los factores de transcripción que controlan los promotores de las MMP (AP-1 y NF-kB, entre otros).

- Impedir la activación de las proMMP. Existen algunas MMP que juegan un papel muy importante en la activación de otras MMP, como es el caso de MT1-MMP: al bloquear la MT1-MMP se evita la activación de la cascada proteolítica. Existen, además, inhibidores directos de las MMP, como la trombospondina-1, que se une a la proMMP2 y la proMMP9 con lo que impide su activación. En este apartado se incluyen también las endostatinas y angiostatinas.

- Inhibir la acción de las MMP activas. Pueden emplearse varios métodos como el uso de TIMP, aunque aparecen problemas debido a que estas moléculas presentan otras funciones aparte de la inhibición de las MMP y, además, suelen tener un amplio espectro de acción, o como el uso de inhibidores sintéticos de MMP (MMPI) (Folgueras y cols., 2004 Int. J. Dev. Biol., 48, 411-424).

Aunque parece que estamos ante un método bastante bueno para atajar el crecimiento de un cáncer, las pruebas clínicas no siempre han tenido mucho éxito. Esto se debe a varios factores. Uno de ellos es que este tipo de pruebas suele hacerse en pacientes con tumores en fases muy avanzadas, en los que la vascularización del tumor está ya plenamente establecida, con lo que la inhibición de la angiogenia por medio del bloqueo de las MMP no sirve de mucho. Hay que pensar que las MMP realizan un papel muy importante en las fases tempranas, con lo que la mayoría de las veces se están usando los tratamientos fuera de contexto. Además, hay que considerar otro aspecto muy importante: existen algunas MMP que tienen acción antiangiógena. Es el caso de las metaloproteinasas con actividad de desintegrina con motivos de trombospondina (ADAMTS). Este subgrupo dentro de las MMP presenta en su molécula dominios del tipo trombospondina, y se ha visto que algunos de sus miembros son capaces de bloquear la activación de la angiogenia inducida por el VEGF (factor de crecimiento del endotelio vascular, una de las importantes moléculas inductoras de angiogenia), (Iruela-Arispe y cols., 2003 Ann. N. Y. Acad. Sci. 995, 183-190). Se dan muchos casos en los que las MMP liberan factores antiangiógenos por degradación de los componentes de la MEC, como es el caso de las MMP2 y MMP9, que están muy implicadas en la progresión tumoral pero que, además, intervienen en la hidrólisis de plasminógeno para liberar angiostatina, un potente antiangiógeno. Otras, como la MMP8, están muy implicadas en procesos inflamatorios, de manera que los ratones genosuprimidos para su gen presentan una respuesta inflamatoria anómala que propiciaría un ambiente favorable para el desarrollo de los tumores (Gueders y cols., 2005 J. Immunol. 175 (4), 2589-2597).

¿Significa todo esto que las aproximaciones terapéuticas anteriormente comentadas no son válidas? No se trata de eso, simplemente hay que estudiar en profundidad todos los procesos en los que intervienen las MMP, así como establecer en qué fases del desarrollo tumoral está actuando cada una de ellas. De esta forma, y aplicando un diagnóstico preciso del estadio exacto del tumor a tratar, estos tratamientos podrán dar mejores resultados en un futuro esperemos que no muy lejano.