"DNA chips", la penúltima revolución en el análisis molecular
La Ingeniería Biomolecular tal y como la conocemos se sustenta en dos grandes pilares que en su día supusieron una auténtica revolución. El primero, establecido en la segunda parte de los setenta, consistió en el desarrollo de los métodos de secuenciación de ácidos nucleicos y de obtención y aplicación de las enzimas de restricción. El segundo pilar, fue la posibilidad de la amplificación «in vitro» de secuencias mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), que revolucionó, a finales de los ochenta, toda la tecnología del DNA recombinante. Al cabo de otra década, cuando parecía que las bases técnicas de la Biología Molecular estaban firmemente establecidas, surge una nueva tecnología que promete revolucionar de nuevo el análisis molecular. La técnica, conocida en inglés como «microarray technology», y que mientras aparece el término en castellano traduciremos como Tecnología de análisis en micromatriz, está siendo aplicada en los mejores laboratorios del mundo, que han incluido líneas de investigación y desarrollo sobre el tema (por ejemplo el EMBL en Heidelberg Alemania). Al mismo tiempo, las compañías multinacionales más potentes han renovado sus catálogos, incluyendo productos, infraestructura y servicios relacionados con esta tecnología. El volumen de negocio es enorme, y según algunas predicciones el mercado de estos productos alcanzará la cifra de mil millones de dólares en los próximos 5 años [Resúmenes de la reunión sobre micromatrices : "Microarray meeting", Scottsdale, Arizona 22-25 Septiembre 1999 (http://www.bioedge.net)].
¿En qúe consiste esta técnica? Como todas las grandes ideas es conceptualmente sencilla, aunque requiere de una infraestructura notable. El proceso comenzaría con la construcción de un «chip» de secuencias, es decir, con la inmovilización de forma ordenada, sobre una placa de sílice o de nylon, de cientos o miles de fragmentos de ácidos nucleicos (oligonucleótidos o cDNA), de secuencias diferentes, construyendo así un panel de sondas [Robert, Science, 282, 396 (1998)]. La naturaleza de estas secuencias estará en función de las aplicaciones que queramos darle a nuestro «chip». Por ejemplo, si queremos elaborar un «chip» para diagnóstico y caracterización tumoral, lo confeccionaríamos con secuencias portando distintas mutaciones en protooncogenes o en genes supresores de tumor, cuya presencia en las células tumorales atribuye distintas características al tumor en cuestión, y por tanto, supone un tratamiento distinto del mismo.
Los ácidos nucleicos de las muestras que queramos analizar (en el caso anterior podría ser una biopsia), preferentemente DNA genómico o cDNA, se marcan radiactivamente, o con algún otro medio que permita un revelado mediante emisión fluorescente. La muestra así marcada se incuba sobre el panel de sondas, permitiendo la hibridación de secuencias homólogas. Tras unos lavados que eliminen la hibridación inespecífica, se visualiza el resultado a través de un detector de emisiones radiactivas de alta resolución o a través de microscopía confocal, en el caso de que el marcaje sea por fluorescencia [Shalon et al. Genome Res. 6, 639 (1996)].
Sin embargo, y en la actualidad, uno de estos análisis no está al alcance de cualquiera, pues su precio puede oscilar entre las 150 y las 500 mil pesetas. Entonces, ¿cuál es el interés de esta técnica? Hay que tener en cuenta que los métodos tradicionales de análisis de secuencias (Northern, Southern, etc.), son laboriosos a la hora de analizar sobre una misma muestra la abundancia o tamaño de varios fragmentos de ácidos nucleicos de secuencias diferentes. Por tanto, un análisis de la magnitud del que se puede conseguir con la tecnología del análisis en micromatriz, necesitaría, si se pretendiera su consecución a través de técnicas tradicionales, de uno o varios analistas altamente formados, trabajando a tiempo completo durante varios meses. El resultado es que a la larga es más barato un análisis a través de la nueva técnica. Por otro lado, la ganancia de tiempo que supone este tipo de análisis, puede ser muy interesante a la hora de diagnosticar patologías de rápida evolución (cáncer, etc.), o para desarrollar fármacos de alta competitividad. Para hacernos una idea de la potencia de la técnica sólo hay que recordar que el primer «chip» comercializado medía 12.8 mm. de lado (en la actualidad pueden hacerse hasta cuatro veces más pequeños), y que es utilizado en la actualidad de forma rutinaria para el análisis de mutaciones del virus VIH por LabCorp, dando el resultado en cinco horas.
El número de aplicaciones del análisis en micromatriz es enorme. Su valor como instrumento de diagnóstico es incalculable, pudiéndose aplicar a la caracterización de procesos tumorales y de otras patologías, así, se está preparando un «chip» con secuencias provenientes de todas las micobacterias conocidas, para poder identificar con precisión la especie presente en una extracción pulmonar de un paciente. No sólo se identificaría el agente causal de la patología sino que se podrían detectar cualquier mutación que confiriera resistencia a antibióticos. En este último ejemplo hablamos de un «chip» con más de 40000 oligonucleótidos.
Por otro lado, si podemos determinar con precisión qué patrón de expresión de determinados genes produce un cierto agente tóxico de origen biológico o químico, se podría almacenar toda esta información en un banco de datos, de manera que ante una eventual intoxicación sería posible, en un breve espacio de tiempo, y a partir de muestras de los afectados, determinar el agente causante de la intoxicación y por tanto obrar en consecuencia.
Son destacables también sus aplicaciones en el campo de la industria. Así, será posible detectar agentes infecciosos en la cadena de producción de alimentos, fármacos, etc.
En investigación puede aplicarse a estudios de polimorfismo genético, genotipado de poblaciones, estudios de desarrollo, caracterización molecular de procesos fisiológicos (p.ej: inflamación), y patológicos (cáncer, etc.) [Schena et al. Nature Genet. 14, 457 (1996)].
Sus aplicaciones en el ámbito de la generación de fármacos son especialmente numerosas. Podría contribuir a la identificación de las dianas más adecuadas para un tratamiento determinado. Permitiría conocer mejor el mecanismo de acción de los medicamentos con lo que podríamos sacarles el máximo rendimiento posible. Incluso sería posible determinar los efectos secundarios que conllevaría un cierto tratamiento, pudiéndose evitar así la pérdida de dinero y de tiempo que suponen los ensayos clínicos.
Sin embargo no todo es tan fácil. El principal problema de esta técnica radica precisamente en la gran cantidad de información que puede proporcionar, sobre todo porque habrá que saber discriminar qué genes son claves a la hora del diagnóstico de una enfermedad o en la caracterización de un determinado proceso. Para colaborar en la interpretación de los datos proporcionados ya se está trabajando en el desarrollo de software que facilitaría el trabajo de integrar la información que proporciona cada sonda dentro de un chip. En cualquier caso, estos problemas parecen perfectamente salvables sobre todo si los comparamos con la magnitud de los beneficios que podremos obtener, y que posiblemente revolucionen tanto las labores de diagnóstico como las de investigación.
¿En qúe consiste esta técnica? Como todas las grandes ideas es conceptualmente sencilla, aunque requiere de una infraestructura notable. El proceso comenzaría con la construcción de un «chip» de secuencias, es decir, con la inmovilización de forma ordenada, sobre una placa de sílice o de nylon, de cientos o miles de fragmentos de ácidos nucleicos (oligonucleótidos o cDNA), de secuencias diferentes, construyendo así un panel de sondas [Robert, Science, 282, 396 (1998)]. La naturaleza de estas secuencias estará en función de las aplicaciones que queramos darle a nuestro «chip». Por ejemplo, si queremos elaborar un «chip» para diagnóstico y caracterización tumoral, lo confeccionaríamos con secuencias portando distintas mutaciones en protooncogenes o en genes supresores de tumor, cuya presencia en las células tumorales atribuye distintas características al tumor en cuestión, y por tanto, supone un tratamiento distinto del mismo.
Los ácidos nucleicos de las muestras que queramos analizar (en el caso anterior podría ser una biopsia), preferentemente DNA genómico o cDNA, se marcan radiactivamente, o con algún otro medio que permita un revelado mediante emisión fluorescente. La muestra así marcada se incuba sobre el panel de sondas, permitiendo la hibridación de secuencias homólogas. Tras unos lavados que eliminen la hibridación inespecífica, se visualiza el resultado a través de un detector de emisiones radiactivas de alta resolución o a través de microscopía confocal, en el caso de que el marcaje sea por fluorescencia [Shalon et al. Genome Res. 6, 639 (1996)].
Sin embargo, y en la actualidad, uno de estos análisis no está al alcance de cualquiera, pues su precio puede oscilar entre las 150 y las 500 mil pesetas. Entonces, ¿cuál es el interés de esta técnica? Hay que tener en cuenta que los métodos tradicionales de análisis de secuencias (Northern, Southern, etc.), son laboriosos a la hora de analizar sobre una misma muestra la abundancia o tamaño de varios fragmentos de ácidos nucleicos de secuencias diferentes. Por tanto, un análisis de la magnitud del que se puede conseguir con la tecnología del análisis en micromatriz, necesitaría, si se pretendiera su consecución a través de técnicas tradicionales, de uno o varios analistas altamente formados, trabajando a tiempo completo durante varios meses. El resultado es que a la larga es más barato un análisis a través de la nueva técnica. Por otro lado, la ganancia de tiempo que supone este tipo de análisis, puede ser muy interesante a la hora de diagnosticar patologías de rápida evolución (cáncer, etc.), o para desarrollar fármacos de alta competitividad. Para hacernos una idea de la potencia de la técnica sólo hay que recordar que el primer «chip» comercializado medía 12.8 mm. de lado (en la actualidad pueden hacerse hasta cuatro veces más pequeños), y que es utilizado en la actualidad de forma rutinaria para el análisis de mutaciones del virus VIH por LabCorp, dando el resultado en cinco horas.
El número de aplicaciones del análisis en micromatriz es enorme. Su valor como instrumento de diagnóstico es incalculable, pudiéndose aplicar a la caracterización de procesos tumorales y de otras patologías, así, se está preparando un «chip» con secuencias provenientes de todas las micobacterias conocidas, para poder identificar con precisión la especie presente en una extracción pulmonar de un paciente. No sólo se identificaría el agente causal de la patología sino que se podrían detectar cualquier mutación que confiriera resistencia a antibióticos. En este último ejemplo hablamos de un «chip» con más de 40000 oligonucleótidos.
Por otro lado, si podemos determinar con precisión qué patrón de expresión de determinados genes produce un cierto agente tóxico de origen biológico o químico, se podría almacenar toda esta información en un banco de datos, de manera que ante una eventual intoxicación sería posible, en un breve espacio de tiempo, y a partir de muestras de los afectados, determinar el agente causante de la intoxicación y por tanto obrar en consecuencia.
Son destacables también sus aplicaciones en el campo de la industria. Así, será posible detectar agentes infecciosos en la cadena de producción de alimentos, fármacos, etc.
En investigación puede aplicarse a estudios de polimorfismo genético, genotipado de poblaciones, estudios de desarrollo, caracterización molecular de procesos fisiológicos (p.ej: inflamación), y patológicos (cáncer, etc.) [Schena et al. Nature Genet. 14, 457 (1996)].
Sus aplicaciones en el ámbito de la generación de fármacos son especialmente numerosas. Podría contribuir a la identificación de las dianas más adecuadas para un tratamiento determinado. Permitiría conocer mejor el mecanismo de acción de los medicamentos con lo que podríamos sacarles el máximo rendimiento posible. Incluso sería posible determinar los efectos secundarios que conllevaría un cierto tratamiento, pudiéndose evitar así la pérdida de dinero y de tiempo que suponen los ensayos clínicos.
Sin embargo no todo es tan fácil. El principal problema de esta técnica radica precisamente en la gran cantidad de información que puede proporcionar, sobre todo porque habrá que saber discriminar qué genes son claves a la hora del diagnóstico de una enfermedad o en la caracterización de un determinado proceso. Para colaborar en la interpretación de los datos proporcionados ya se está trabajando en el desarrollo de software que facilitaría el trabajo de integrar la información que proporciona cada sonda dentro de un chip. En cualquier caso, estos problemas parecen perfectamente salvables sobre todo si los comparamos con la magnitud de los beneficios que podremos obtener, y que posiblemente revolucionen tanto las labores de diagnóstico como las de investigación.
Sistemas de transporte electrónico en "las otras membranas". El caso de la membrana plasmática
Las células pueden ser definidas termodinámicamente como sistemas abiertos en continuo intercambio de materia, energía e información con su medio. Las membranas biológicas son esenciales no sólo para la integridad sino también para la identidad de las células, porque a su través se producen todos los intercambios de materia, energía e información requeridos para mantenerlas vivas. No es una exageración afirmar que los principales acontecimientos bioenergéticos suceden en las membranas biológicas, es decir, que la bioenergética es, fundamentalmente, una bioenergética de membranas. Las reacciones redox son esenciales en el papel activo que las membranas juegan en la bioenergética. La membrana mitocondrial interna y la tilacoidal contienen los sistemas de transporte electrónico mejor conocidos, esto es, las cadenas de transporte electrónico respiratoria y fotosintética, respectivamente. Sin embargo, éstos no son los únicos sistemas de transporte electrónico membranales; antes al contrario, hay que remarcar que todas las membranas biológicas bioenergéticamente competentes contienen sistemas redox. Así, con mayor o menor detalle, se han descrito sistemas redox en el retículo endoplásmico, el tonoplasto vegetal, las membranas glioxisomal y peroxisomal y, por supuesto, también en la membrana plasmática. Sorprendentemente, el paradigma de la presencia universal de sistemas redox en las membranas biológicas no está aún firmemente asentado en la literatura científica, y la existencia de sistemas redox de membrana distintos de los presentes en las membranas mitocondrial interna y tilacoidal es simplemente desconocida para un importante porcentaje de biólogos y no tenida en consideración por la mayoría del resto.
Las membranas plasmáticas son membranas bioenergéticamente competentes y, como tales, cabría esperar que contuviesen sistemas de transporte electrónico, como -de hecho- es el caso. Se han encontrado sistemas de transporte electrónico en las membranas plasmáticas de todas las células en las que se han estudiado. Sin embargo, resulta cuanto menos chocante comprobar que incluso investigadores especialistas en el estudio de reacciones redox en membranas plasmáticas parecen ignorar este hecho. En la literatura más actual y en revistas del prestigio de Nature todavía puede econtrarse la afirmación «en general, no se encuentran sistemas de transporte electrónico en las membranas plasmáticas», que es completamente errónea. La NADPH oxidasa no es la excepción que confirma la regla, sino simplemente un sistema de transporte electrónico de membrana plasmática especializado que se induce en diversos tipos celulares como una rápida respuesta al estímulo de un patógeno. De hecho, la NADPH oxidasa pertenece a la primera línea de defensa celular contra patógenos y se puede inducir en ciertos tipos celulares del sistema inmune de mamíferos, pero también en células de peces, de insectos, de plantas y en los oocitos de metazoos durante la fertilización. Hay, al menos, otro sistema de transporte electrónico de membrana plasmática bien definido a nivel molecular; es también un sistema inducible y juega un papel clave en la incorporación de hierro al interior de las plantas y levaduras. Sin embargo, estos sistemas inducibles no son los únicos sistemas de transporte electrónico presentes en las membranas plasmáticas. Es más, en las membranas plasmáticas de todas las células existe un transporte electrónico constitutivo que parece estar implicado en diversas funciones vitales, no sólo la defensa y la incorporación de hierro sino también el control del crecimiento y la proliferación celular o la bioenergética, entre otras.
En conclusión, todas las membranas celulares bioenergéticamente competentes contienen sistemas de transporte electrónico implicados en diversas funciones metabólicas de importancia. Conceptualmente, todas ellas son similares y su funcionamiento puede ser explicado en un marco de referencia general en el que queda de manifiesto la excepcional importancia de las reacciones de oxido-reducción que tienen lugar en las membranas.
Las membranas plasmáticas son membranas bioenergéticamente competentes y, como tales, cabría esperar que contuviesen sistemas de transporte electrónico, como -de hecho- es el caso. Se han encontrado sistemas de transporte electrónico en las membranas plasmáticas de todas las células en las que se han estudiado. Sin embargo, resulta cuanto menos chocante comprobar que incluso investigadores especialistas en el estudio de reacciones redox en membranas plasmáticas parecen ignorar este hecho. En la literatura más actual y en revistas del prestigio de Nature todavía puede econtrarse la afirmación «en general, no se encuentran sistemas de transporte electrónico en las membranas plasmáticas», que es completamente errónea. La NADPH oxidasa no es la excepción que confirma la regla, sino simplemente un sistema de transporte electrónico de membrana plasmática especializado que se induce en diversos tipos celulares como una rápida respuesta al estímulo de un patógeno. De hecho, la NADPH oxidasa pertenece a la primera línea de defensa celular contra patógenos y se puede inducir en ciertos tipos celulares del sistema inmune de mamíferos, pero también en células de peces, de insectos, de plantas y en los oocitos de metazoos durante la fertilización. Hay, al menos, otro sistema de transporte electrónico de membrana plasmática bien definido a nivel molecular; es también un sistema inducible y juega un papel clave en la incorporación de hierro al interior de las plantas y levaduras. Sin embargo, estos sistemas inducibles no son los únicos sistemas de transporte electrónico presentes en las membranas plasmáticas. Es más, en las membranas plasmáticas de todas las células existe un transporte electrónico constitutivo que parece estar implicado en diversas funciones vitales, no sólo la defensa y la incorporación de hierro sino también el control del crecimiento y la proliferación celular o la bioenergética, entre otras.
En conclusión, todas las membranas celulares bioenergéticamente competentes contienen sistemas de transporte electrónico implicados en diversas funciones metabólicas de importancia. Conceptualmente, todas ellas son similares y su funcionamiento puede ser explicado en un marco de referencia general en el que queda de manifiesto la excepcional importancia de las reacciones de oxido-reducción que tienen lugar en las membranas.
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