apuntes de biología

Aplicación clíinca de células madres: un largo camino con problemas por resolver

Las células madre (stem cells) o células troncales han hecho irrupción en el mundo científico de tal forma que hoy resulta imposible sustraerse al impacto que están causando en la biología y la biomedicina. Las posibilidades demostradas, y sobre todo las que se intuyen con todo fundamento, son de tal importancia que el sitio que la investigación con células madre reclama es difícil de disputar. Ni siquiera la controversia ética o moral que suscitan ha hecho sino aumentar su interés y su impacto social. La posibilidad, nada remota, de encontrar a través de ellas tratamiento para patologías que hasta ahora no presentan solución o ésta es muy parcial, desborda todas las expectativas. Poder tratar la diabetes autoinmune (tipo 1), el Parkinson o el Alzheimer de manera cuasi revolucionaria, con eficacia insospechada y con parámetros más propios de la medicina natural que de la convencional (sustancias químicas, drogas, etc.) ha hecho que la sociedad occidental se haya movilizado para allegar recursos, reunir voluntades y vencer barreras aparentemente infranqueables.

Pero es que además, bajo el punto de vista meramente científico, el estudio de la biología de las células madre va a aumentar sensiblemente el conocimiento de los mecanismos moleculares que gobiernan la proliferación y diferenciación de estas células, lo que va a servir no sólo para entender las posibilidades clínicas que encierran sino también para avanzar en asuntos tan importantes como el desarrollo y mantenimiento de los organismos, el envejecimiento o la aparición y progreso de neoplasias.

¿Significa esto que la biomedicina se ha encontrado súbitamente con un campo nuevo de grandes posibilidades que ha permanecido oculto al avance científico? En realidad desde hace tiempo se sabe que tras el nacimiento quedan unas células embrionarias remanentes, diseminadas por los diferentes órganos y tejidos, que son capaces de responder a estímulos regenerativos e iniciar un proceso de autorrenovación, tras el cual algunas de ellas son capaces de diferenciarse hacia linajes especializados, propios del tejido en el que se encuentran. Así sabemos que reparamos nuestra piel, renovamos nuestras células sanguíneas, cicatrizamos los huesos o incluso reponemos la masa hepática amputada. Estas son las que han sido llamadas células madre del adulto o somáticas (adult stem cells) por encontrarse como parte constituyente de los individuos durante toda su vida postnatal (Anderson et al. Nat. Med., 7:393-395. 2001).

Lo más novedoso ha sido el hallazgo de que las células embrionarias, constituyentes de la masa interna del blastocisto temprano (de 4-5 días en el caso del humano) puedan multiplicarse en el laboratorio, y a partir de ellas diferenciarse en los diferentes tipos celulares, y ahora sí, procedentes de cualquiera de las tres hojas blastodérmicas. Esto fue lo que consiguieron en la Universidad de Wisconsin,. en 1998. Nacieron así las células madre embrionarias (embryonic stem cells) (Thomson et al. Science 282:1145-1147. 1998).

Todavía existe un tercer tipo denominado células madre germinales o fetales (embryonic germ stem cells) que tienen parecidas potencialidades que las anteriores y que pueden encontrarse en la llamada cresta gonadal de los fetos humanos de 5 a 10 semanas (Shamblott et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13726-13731. 1998). De ellas se derivarán las células gaméticas durante la vida fértil del individuo.

Las diferencias entre unas y otras son apreciables, aunque no muy bien establecidas. Por ejemplo, se dice que las embrionarias y germinales son pluripotentes, es decir pueden dar lugar a células de cualquiera de las tres hojas embrionarias (ectodermo, mesodermo y endodermo). Por el contrario, las del adulto parecen capaces de originar otras de alguna de las hojas pero no de todas; por ello se les atribuye la cualidad de la multipontencialidad, reservando la totipotencialidad para las células de la mórula, anteriores a la segregación de la masa interna del blastocisto, cuando cualquiera de ellas puede dar lugar a un embrión completo. Esta es la razón por la que se dice que las células madre del adulto presentan menos plasticidad que las embrionarias, aunque cada vez hay más datos que indican que esta "deficiencia" puede ser claramente superable, y que cualquier célula del adulto puede ser genéticamente reprogramable en las condiciones ambientales adecuadas, para dar lugar a células especializadas de cualquier tejido.

Otra característica que diferencia a unos tipos de otros es la posibilidad de replicación indefinida en cultivo. Mientras que las embrionarias sí presentan esa cualidad, las del adulto la tienen más limitada. Esto podría ser un serio handicap para el uso de este tipo celular en terapia regenerativa, toda vez que se necesita un gran número de ellas para hacerla posible. Sin embargo, los datos que aparecen diariamente en la literatura apuntan la posibilidad de que la mejora de las condiciones técnicas de cultivo acabarán con el problema. No obstante, se sabe fehacientemente que las células humanas pluripotentes son relativamente fáciles de cultivar durante muchas generaciones hasta conseguir su inmortalidad. A partir de ese momento, las líneas celulares podrían mantenerse indefinidamente y obtener de ellas células diferenciables hacia cualquier tipo celular, sin necesidad de nuevos embriones. Hasta la actualidad se han establecido casi medio centenar de líneas celulares pluripotentes humanas que muestran interesantes características tales como mantenimiento del número normal de cromosomas y posibilidad de dar lugar a células que expresan cualidades de diferenciadas, producir insulina, presentar actividad contráctil propia de células cardiacas, células sanguíneas, producción de determinadas sustancias propias del tejido nervioso, del hueso, del cartílago, etc. Además, las células humanas pluripotentes presentan telomerasa activa. La telomerasa es una enzima que mantiene la longitud de los telómeros cromosómicos que, a su vez, son importantes para mantener la capacidad de replicación. Es decir, telómeros largos indican mantenimiento de la capacidad proliferativa por muchas generaciones. Y este es el caso de las células pluripotentes humanas (Amit et al. Dev. Biol., 227:271-278. 2000).

Aunque la polémica, o más bien la incertidumbre, sobre la conveniencia de usar células madre embrionarias o del adulto para terapias celulares en humanos sigue abierta, hay algunas consideraciones que deben tenerse en cuenta: los dos tipos son diferentes pero los dos presentan grandes posibilidades potenciales de uso clínico. Los trabajos futuros deberán decir cuáles son sus posibilidades proliferativas, de diferenciación, supervivencia y rechazo por el huésped. Probablemente unas de ellas sean mejores para ciertas aplicaciones, mientras otras lo serán para otras. De momento no es posible predecir casi nada. Más bien lo único que cabe es hacerse múltiples preguntas al respecto, cuyas respuestas sólo las podrán atisbar los avances imprescindibles en la biología celular de las células madre.

Algunas de las preguntas que necesitan repuesta antes de pasar a la realización de aplicaciones clínicas concretas pueden ser de este tipo:

¿Existe una célula madre universal capaz de circular y situarse en un tejido determinado para, ante la necesidad, generar células de ese tejido? ¿Cuáles son los factores responsables de la permanencia de las células madre en los lugares donde existe un daño a reparar? ¿Cuáles son los controles que dirigen un camino de diferenciación celular y no otro? ¿Mediante qué mecanismos pueden mantenerse en cultivo las células embrionarias en proliferación y cuáles son los que disparan su diferenciación? ¿Podemos conocer los mecanismos genéticos que permiten la diferenciación de células embrionarias en cada una de las procedentes de las tres hojas blastodérmicas, de tal forma que podamos manipular las del adulto para que inicien tal o cual camino de diferenciación? ¿Cuáles son las fuentes de células madre adultas en el cuerpo? ¿Cómo permanecen indiferenciadas en un "entorno diferenciado"? ¿Cuántos tipos de células madre adultas hay y en qué tejidos las podemos encontrar? ¿Cómo podremos manipularlas para mejorar su baja capacidad proliferativa actual? ¿Cuál será el estado de diferenciación más apropiado para el transplante?…

Estas y otras muchas preguntas esperan respuesta de los cientos de laboratorios que actualmente están empeñados en esta investigación. A los problemas científicos por resolver debemos añadir las medidas de seguridad que precisan tomarse antes de transferir a un organismo células que deben ser "manipuladas" en el laboratorio. Es decir, sólo después de conocer los procesos básicos que subyacen en la proliferación y diferenciación de este tipo de células y de desarrollar todo un programa de seguridad pre- y post-implante, podremos embarcarnos en programas de terapia celular con garantías de éxito y sin peligros gratuitos. Las células madre transplantadas son entidades biológicas dinámicas que interactúan y son influenciadas por la fisiología del receptor. Antes de ser transplantadas deben mantenerse en condiciones que promueven su expansión por autorrenovación de progenitores indiferenciados o la adquisición de propiedades de diferenciación indicativas de cada fenotipo. El transplante de tipos celulares no completamente diferenciados supone el reajuste de su metabolismo, de su programa genético, como consecuencia de las órdenes recibidas en el microambiente en el que son incluidas. La capacidad de proliferación y diferenciación inherente a este tipo de células son un reto para evaluar su seguridad. El desorden proliferativo o los errores de diferenciación post-implante son asuntos de extremada gravedad y de impredecibles consecuencias para no ser tenidos en cuenta con todo rigor.

Aunque todo el mundo científico está de acuerdo en la necesidad de ser cautelosos antes de iniciar casos clínicos con células madre, existen matices entre unos y otros. Mientras unos proponen esperar los próximos cinco años para estar seguros de introducir células madre con fines reparativos, otros piensan, sencillamente, que es necesario saber mucho más sobre la biología básica de las células madre humanas antes de explotar su valor terapéutico, independientemente de los años que deban transcurrir.

MEDIDA DE PROTECCIÓN	CME	CMG	CMA (autólogas)
Examen del donante: Agentes infecciosos Valoración genealogía Pruebas genéticas moleculares	++	++	++
Uso controlado y prácticas estandarizadas de procedimientospara el establecimiento de líneas celulares	++	++	++
Desarrollo de alternativas al cultivo con fibroblastosirradiados de ratón (cell feeder layer) (Cheng y cols. 2003)	++	++	No necesario
Caracterización detallada de líneas celulares: Morfología celular, antígenos de superficie, marcadores Bioquímicos, expresión de genes, análisis de cariotipo, Actividad biológica…	++	++	++
Estudios preclínicos en modelos animales: Enfermedades modelo: migración e integración celular Análisis exhaustivo de toxicidad Potencial proliferativo	++	++	+
Monitorización de pacientes y seguimiento intensivo alargo plazo	++	++	++

++, más importante; +, menos importante.

CME: células madre embrionarias; CMG: células madre germinales; CMA: células madre del adulto

En el cuadro se reproducen en parte las medidas de seguridad que deben implementarse, según la propuesta realizada por el National Institute of Health de los Estados Unidos de América, antes de arriesgarse en la aplicación clínica de las células madre, independientemente de su origen (NIH, 2001).

Como puede observarse, todas tienen riesgo potencial y a todas deben afectar las medidas de seguridad, pero las embrionarias lo precisan en mayor grado. Finalmente, el riesgo seguro de rechazo inmunológico que presentan las embrionarias es algo que preocupa menos, ya que se confía en poder "domesticar" las células mediante terapia génica para suprimirles esa capacidad. En todo caso, el desarrollo farmacológico permite dominar con garantías el rechazo inmunológico, aunque no exento de toxicidad y riesgo de inducción neoplásica. Así mismo, según avance el conocimiento, la clonación terapéutica podría ser una solución definitiva a este problema. Pero este es otro asunto que deberá tratarse separadamente.

Lo mínimo que se despacha... Para la vida celular

Uno de los aspectos que más ha intrigado a biólogos moleculares y celulares ha sido la idea o el concepto de "genoma mínimo", en otras palabras, la estimación e identificación del número mínimo de genes suficientes para construir o mantener un organismo con organización celular. Este problema ha sido abordado desde dos aproximaciones diferentes. La primera de ellas se llevó a cabo a mediados de los años 90 cuando los primeros genomas bacterianos comenzaron a estar disponibles; la idea consistía en identificar mediante un análisis computacional los genes que eran compartidos entre taxones diversos. La segunda aproximación perseguía identificar los genes esenciales para el crecimiento de una especie dada mediante mutagénesis con transposones. No obstante, estos experimentos se parecen mucho a algunos ya realizados por la naturaleza. Por ejemplo, hace unos pocos de cientos de millones de años un antepasado de Escherichia coli fue "domesticado" por los áfidos, lo que resultó en la eliminación del 75% del genoma original.

Los patógenos transmitidos por vectores usan a los insectos como lanzaderas para transferir individuos entre la población del hospedador, típicamente sin daño o con uno muy limitado para los tejidos o células del insecto. En contraste a tales acomodaciones esporádicas, algunos insectos han desarrollado relaciones obligadas con bacterias que no implican una transmisión posterior a otros eucariotas. Estas bacterias dependientes de hospedador han sido identificadas en insectos chupadores de floema de plantas o que se alimentan de la sangre de los animales. Las células bacterianas normalmente están contenidas en células especializadas del insecto denominadas bacteriocitos y la infección se transmite verticalmente a través de los huevos a la siguiente generación de insectos. En estos sistemas el papel de los microorganismos es producir compuestos que no están disponibles en la dieta habitual de estos insectos. Así, el floema de las plantas es rico en azúcares pero relativamente deficiente en aminoácidos, vitaminas y lípidos esenciales; es por ello por lo que estos áfidos son dependientes del endosimbionte Buchnera aphidicola que le aporta aminoácidos. De igual manera, la sangre de los vertebrados es escasa en las vitaminas del complejo B y por ello la dieta de insectos como la mosca tsetsé es complementada por endosimbiontes como Wigglesworthia glossinidia que es esencial para la producción de vitaminas.

Las bacterias dependientes de hospedador tienen los genomas más pequeños conocidos en la naturaleza, a menudo de un tamaño inferior a 1 Mb. En una revisión muy interesante, Klasson y Anderson [Trends Microbiol. 12: 37-43 (2004)] con objeto de identificar el conjunto mínimo de genes requeridos para la vida comparan las dotaciones mínimas de genes que se han desarrollado de forma natural en estas bacterias, con las inferidas a través de los análisis computacionales y mutacionales. Los endosimbiontes de áfidos tienen genomas que oscilan entre las 618 y 641 kb y se ha estimado que estas bacterias han divergido de bacterias de vida libre con genomas que oscilarían entre 2 y 2,5 Mb que contendrían entre 1800 y 2500 genes. Se han propuesto dos posibles escenarios que explicarían el proceso de minimización sufrido por estos genomas. Por un lado, se argumenta que este proceso fue continuo, con genes que se fueron perdiendo individualmente a través de un elevado número de pequeñas deleciones. Por otro lado, está la sugerencia de que muchos de estos genes se perdieron de forma simultánea, de manera que a través de unos pocos eventos de deleción se hubieran podido perder múltiples genes. Según las tasas de deleción estimadas para los genomas de los endosimbiontes, esta segunda explicación parece la más plausible, de manera que a partir de procesos de recombinación entre secuencias repetidas pudieron perderse grandes bloques de DNA de forma muy rápida, tras lo cual la tasa de pérdida de genes se redujo gradualmente hasta alcanzar a las estimadas para los genomas de endosimbiontes actuales.

La primera comparación entre los genomas de Haemophilus influenzae y Mycoplasma genitalium sugería que aproximadamente 250 genes estaban conservados entre estas especies filogenéticamente divergentes [Mushegian y Koonin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 10268-10273 (1996)]. Un número similar de genes esenciales se estimó para Mycoplasma tras el análisis de mutantes insercionales [Hutchinson et al, Science 286: 2165-2169 (1999)]. Un análisis computacional posterior que incluía los genomas de M. genitalium y los de los parásitos intracelulares Rickettsia prowazekii y Chlamydia trachomatis sugería que sólo 156 genes estaban conservados entre los genomas bacterianos y que no más de 81 de éstos estaban universalmente conservados [Koonin, Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 1: 99-116 (2000)]. Los genomas de los endosimbiontes de áfidos secuenciados comparten un total de 426 genes. Estos genes incluyen los genes seleccionados por el huésped para la síntesis de aminoácidos y un núcleo de genes necesarios para la división celular, replicación, transcripción y traducción. Si los genomas de W. glossinidia y B. floridanus se suman a la comparación anterior, el número de genes de endosimbiontes conservados se reduce a 276, de los cuales aproximadamente el 50% (156) están también conservados entre parásitos dependientes de hospedador. Las enzimas más importantes para la célula son aquellas que convierten el mensaje genético en proteínas y aseguran que el DNA sea adecuadamente copiado y transferido a las células hijas. Los endosimbiontes comparten 131 genes dedicados al procesado de la información, 99 de los cuales están conservados en bacterias, de éstos 86 están también presentes en parásitos intracelulares y 62 en todos los genomas secuenciados. La síntesis proteica es la categoría predominante con 99 genes compartidos por los genomas de endosimbiontes. El proceso de replicación aporta 10 genes conservados entre los endosimbiontes y otros genomas bacterianos, mientras que la transcripción depende de 7 genes conservados en endosimbiontes.

Las células asociadas a estos conjuntos mínimos de genes nunca crecen aisladas en la naturaleza. Hasta la fecha, todas las especies bacterianas con los genomas más pequeños están íntimamente asociadas a células eucarióticas ya sea en forma de endosimbiontes o parásitos. En total, 302 genes de B. aphidicola no pertenecen al grupo de genes conservados entre bacterias. Algunos de estos genes complementarios representan funciones seleccionadas por el huésped tales como las capacidades biosintéticas de aminoácidos, codifican componentes celulares estructurales, funciones bioenergéticas o proteínas hipotéticas. Las diferencias entre los tres genomas deBuchnera residen en 53 pseudogenes y 86 genes que están ausentes en una o más cepas. Los genes defectivos específicos de linaje representan a todas las categorías funcionales, por lo tanto, las fuerzas evolutivas reduccionistas que actúan sobre los genomas de los endosimbiontes parecen afectar a una gran variedad de procesos celulares. Hay unos pocos ejemplos palpables de deterioro génico que parecen ser resultado de los niveles cambiantes de selección que actúan sobre el hospedador. Así, se ha observado que varias especies de Buchnera están en proceso de perder parte de sus capacidades biosintéticas, lo cual es sorprendente porque se piensa que ésa es la razón misma de su existencia. En concreto, genes implicados en la reducción del sulfato y la biosíntesis de cisteína están acumulando mutaciones sin sentido y de desfase del marco de lectura. Esto puede estar asociado a daños en la planta durante el proceso de alimentación del insecto que conduzca a un aumento de niveles de aminoácidos esenciales disponibles en el floema, y como resultado, los genes biosintéticos correspondientes pueden no estar bajo una presión selectiva importante. Algo similar se ha observado en el áfido Diuraphia noxia que ha empezado a acumular mutaciones en genes de biosíntesis de triptófano. B. aphidicola ha ido más allá y los genes de biosíntesis de cisteína y arginina han sido eliminados de su genoma.

Todas estas observaciones han conducido a la formulación de una serie de preguntas como: ¿Existe un conjunto mínimo de genes que explique el rango de tamaño observado de los genomas de los endosimbiontes? ¿Continuarán estos genomas disminuyendo hasta que finalmente se colapsen? ¿Evolucionarán estos endosimbiontes hasta orgánulos especializados con material genético transferido al genoma nuclear como mitocondrias y cloroplastos? La transmisión materna de los endosimbiontes a través de los huevos a la siguiente generación de áfidos establece el escenario para la transferencia de DNA bacteriano al genoma nuclear de sus hospedadores. Dicha transferencia ha sido documentada en Wolbachia, otra bacteria que se hereda maternalmente. Esta observación demuestra que los genes de los endosimbiontes, al igual que los genes de los orgánulos, pueden ser transferidos a los genomas nucleares de sus huéspedes, aunque todavía permanece por determinar si estos genes son expresados y si contribuyen a funciones bacterianas vitales [Kondo et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99: 14280-14285 (2002)]. Sin embargo, es preciso tener en cuenta una notable diferencia entre orgánulos y endosimbiontes, ya que los primeros se multiplican libremente en el citoplasma de todas las células mientras que los segundos están compartimentalizados en células altamente especializadas. Esta localización puede imponer limitaciones especiales a la regulación de la expresión de cualquier gen de localización nuclear y también sobre los sistemas de transporte que mediaran el proceso de comunicación entre el núcleo y los endosimbiontes.

Según lo anteriormente expuesto, los genomas mínimos no representan el contenido genético de ninguna célula de vida libre y, por tanto, no parece posible consensuar una lista de genes candidatos que constituyan la dotación génica mínima óptima, ya que tal mínimo desnudo probablemente no rindiera un fenotipo que sea competitivo bajo condiciones naturales de vida libre. Por lo tanto, para que tenga sentido, las discusiones sobre genomas mínimos tienen que tener en cuenta los genomas ancestrales de los que derivan y los ambientes en los que los genomas mínimos originados sostienen formas de vida competitivas. La idea original del concepto de genoma mínimo era la de definir el grupo de genes más pequeño que sería suficiente para permitir vida celular en las condiciones más favorables imaginables, pero a tenor de lo que hemos aprendido de los genomas de endosimbiontes ¿sigue teniendo esta idea un verdadero interés?