apuntes de biología

Predicción de estructura de proteínas empleando software libre

Las técnicas experimentales de caracterización estructural, principalmente cristalografía de rayos X y resonancia magnética nuclear, proporcionan estructuras de alta resolución, aunque desafortunadamente sólo una pequeña parte de las proteínas se pueden caracterizar así. Para una gran parte de la fracción de secuencias cuya estructura no se puede determinar experi-mentalmente, los métodos computacionales de predicción de estructura nos ofrecen información valiosa, útil para explicar gran parte de los aspectos funcionales que se pueden derivar del conocimiento estructural.

Por otro lado, es obvio que la implementación de estas técnicas pasa por el desarrollo de software apropiado y que para resolver problemas biológicos mediante esta aproximación necesitamos usar ordenadores y programas específicos. Existe a nuestra disposición gran variedad de servidores y programas asequibles a coste ínfimo. En este artículo explicaré las bases de la predicción estructural de proteínas y las ventajas de realizar esta tarea empleando herramientas de código abierto o con más propiedad software libre.

Métodos de predicción de estructura

El primer grupo de métodos de predicción de estructura que consideraré se denomina genéricamente métodos de novo o ab initio.

Estos métodos parten de la asunción de que la información necesaria para conocer la estructura tridimensional de una proteína está en su secuencia de aminoácidos. Buscan la estructura nativa como la conformación que corresponde al mínimo global de una función potencial determinada, que «representa» a la proteína y que se construye desde su secuencia. Para optimizar la función potencial emplean distintos métodos de búsqueda en el espacio de las conformaciones, los cuales suelen implementar algoritmos de mecánica molecular combinados con dinámica molecular [van Gunsteren W.F. y Beredsen H.J.C. 1977. Molecular Physics 34:1311], simulaciones Monte Carlo (Combination, Rosseta [Simons K. et al. (2000) J. Mol.Biol. 306:1191]) o el empleo de bases de datos de elementos de estructura secundaria estándar (FRAGFOLD [Jones D.T. 2001. Proteins ;Suppl 5:127]).

Los métodos ab initio son computacionalmente costosos y su fiabilidad disminuye con el tamaño de la proteína, generalmente funcionan bien con péptidos menores a 150 aminoácidos. La principal ventaja que tienen es que sólo se necesita la secuencia como información de partida, de modo que en principio es posible modelar proteínas que corresponden a plegamientos no conocidos.

En la práctica no se emplean para deducir la estructura de una proteína completa, sino como apoyo a otras técnicas más potentes y que consiguen más éxitos. Este conjunto de técnicas constituyen el segundo grupo de métodos de predicción, el modelado por homología (Homology, Comparative Modelling).

La idea básica de la que surge esta aproximación descansa en el hecho de que todas las parejas de proteínas que presentan una identidad de secuencia mayor al 30% tienen estructura tridimensional similar [Sander C. y Schneider R. 1991. Proteins 9:56]. De este modo se puede construir el modelo tridimensional de una proteína de estructura desconocida, partiendo de la semejanza de secuencia con proteínas de estructura conocida [Blundell T.L. et al. 1987. Nature 326:347].

Las estapas necesarias para el modelado por homología son básicamente cuatro:

• Identificación de estructuras conocidas (moldes) relacionadas con la secuencia diana. Se emplean métodos de comparación de secuencias como FASTA [http://fasta.bioch.virginia.edu/], BLAST o PSI-BLAST [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/].

• Alineamiento de la diana con los moldes. Es la etapa más importante y la más delicada ya que la construcción del modelo se realizará conforme a este alineamiento. En este paso se emplean programas típicos de alineamiento de secuencias como CLUSTAL [http://www.ebi.ac.uk/ clustalw/].

• Construcción del modelo. Existen varias aproximaciones para construir las coordenadas espaciales de la secuencia diana desde el alineamiento realizado. Como ejemplo tenemos ProModII en el servidor SWISS-MODEL [http://www.expasy.org/swissmod/SWISS-MODEL.html].

• Evaluación del modelo. La información que se puede obtener del modelo depende de su calidad, de modo que es importante poder evaluarla. Existen muchas pruebas que se pueden realizar sobre un modelo que incluyen comprobaciones estéricas, químicas, representaciones de Ramachandran, etc.

Para una revisión más detallada de estas etapas ver Martí-Renom et al. 2000. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 29:291.

Se estima que el modelado por homología es aplicable a un tercio de todas las secuencias proteicas conocidas [Rost B. y Schneider R. Pedestrian Guide to Analysing Sequence Databases. http://www.cbi.cnptia.embrapa.br/SMS/bbnet/pedestrian/Springer96.html] y esta cifra aumenta un 4% cada año, a medida que se determinan más estructuras correspondientes a nuevos plegamientos por vías experimentales. Aún así ¿qué pasa con el resto?

Cuando la similitud entre la secuencia diana y el molde es demasiado baja no es posible realizar un buen alineamiento y no se puede aplicar con éxito el modelado por homología. En estos casos aún podemos obtener información estructural de la proteína empleando técnicas de threading. En resumen consiste en colocar la secuencia problema en diferentes plegamientos conocidos y evaluar cómo se «encuentra de bien» o cómo encaja en cada uno de ellos. Por «encajar» se entienden cosas diferentes según el programa de threading: coincidencia de estructura secundaria, residuos en ambientes parecidos a como se encuentran en la base de datos, etc.

Pero para hacer todo esto hay que usar programas, ¿de qué tipo?.

Programas libres

Existe una gran variedad de programas para realizar predicciones de estructura de proteínas. Gran parte de ellos son desarrollados por investigadores que construyen sus propias herramientas para ser empleadas en la investigación, y que se ponen a disposición de la comunidad científica con el código fuente y permiso de realizar las copias necesarias, es decir, como software libre (no confundir con shareware. En la dirección http://www.fsf.org/ hay abundante información sobre este tipo de software).

Estos programas además de herramientas son resultado de investigación científica, de modo que es de esperar que ese conocimiento sea puesto al alcance de toda la comunidad. Este intercambio de conocimiento, entre otras cosas, es lo que favorece el desarrollo de programas de ordenador libres.

Para una discusión más extensa sobre la difusión libre del conocimiento ver El futuro de la información: ¿vamos hacia donde queremos? de Jesús M. González Barahona, disponible en http://sindominio.net/biblioweb/telematica/futuroinfo.pdf

En definitiva, el uso de programas de ordenador libres en el ámbito científico ofrece muchas ventajas y pocos inconvenientes, los cuales, por otro lado, son fácilmente resueltos si se consigue vencer la inercia al cambio.

Un conductor de carga llamado ADN

Durante las últimas semanas pocos medios de comunicación han olvidado dedicar algunas palabras o ediciones especiales acerca de la celebración de los 50 años de la publicación del modelo de la doble hélice del ácido desoxirribonucleico (ADN). Como se indica en la presentación del suplemento especial que la revista Nature dedicó el pasado mes de enero [Nature, 421, (2003)] a este evento, hay pocas moléculas que cautivan del modo en que lo hace la molécula de ADN. Atrapa intelectualmente a científicos de muy diferente formación, inspira a artistas y ha sido capaz de cambiar las ideas de la tecnosociedad de comienzos del siglo XXI. La mayoría de nosotros hemos aprendido que la singular estructura del ADN proporciona la base química para entender la genética y cómo la disciplina que denominamos Biología Molecular tiende el puente entre la compleja química del ADN y su manipulación y posterior expresión en los seres vivos, pero en muy pocas ocasiones se nos informa acerca de las propiedades físicas de esta macromolécula. Propiedades, además, que no se diferencian mucho de la de los polímeros de síntesis que la química del siglo pasado fue capaz de desarrollar. Entre ellas se pueden destacar las propiedades mecánicas y eléctricas. Ambas son consecuencia del comportamiento microscópico de la materia, en este caso de las peculiares características estructurales de la macromolécula. En este artículo se pretende proporcionar una actualizada y breve información sobre algunas de las características eléctricas del ADN.

A lo largo de las dos últimas décadas tuvo lugar un gran controversia sobre la cuestión de si la molécula de ADN proporciona un conducto efectivo para el transporte de carga. Este tema ha fascinado a muchos científicos. El empaquetamiento de los pares de bases de la doble hélice, empaquetamiento o "stacking" de las bases aromáticas, no sólo confiere estabilidad al edificio estructural que supone el ensamblaje de la macromolécula, sino que también podría constituir la base molecular para la comunicación de electrones. En este sentido se han llevado a cabo un buen número de experimentos con el objetivo principal de extraer información concluyente sobre las propiedades de transferencia de carga del ADN.

Antes de pasar a exponer el mecanismo a través del cual se produce la conducción de electrones en el ADN, hay que aclarar que se trata de un mecanismo bastante complejo, y que existen multitud de factores que pueden influir en él, como son el sistema de inyección de la carga, la existencia o no de donadores y aceptores de electrones, la naturaleza de los mismos, la fuerza directriz de la reacción y la secuencia de nucleótidos que va a ser soporte de la transferencia de carga. Pero, a grandes rasgos, puede hablarse de dos tipos de mecanismos: el denominado mecanismo de superintercambio de una etapa, que se produce en condiciones oxidantes; y un segundo mecanismo, multietapa, denominado de saltos ("hopping") y que es característico de condiciones reductoras o bien de aquellos casos en que el estado electrónico excitado del donador de electrones y los niveles vibrónicos del ADN están prácticamente en resonancia. Estos dos mecanismos son bastante distintos entre sí, siendo una de las diferencias más relevantes el hecho de que en el primero la velocidad de transferencia de carga depende de la distancia entre el donador y el aceptor de electrones y en el segundo no se ha observado esta dependencia.

Condiciones oxidantes. Mecanismo de superintercambio en una sola etapa.

En condiciones oxidantes, la inyección de una carga positiva en el ADN provoca la oxidación de una guanina (G), con menor potencial de ionización y mayor afinidad electrónica que adenina (A), timina (T) y citosina (C). Esta transferencia de carga positiva se produce en un solo paso desde el inyector a la guanina más cercana a lo largo de la misma hebra, de manera que los pares A:T no son oxidados, sino que actúan sólo como puentes de la transferencia. La carga positiva se transferirá a la siguiente guanina y así sucesivamente, saltando de guanina en guanina, hasta que llegue a un sumidero de carga, es decir, un "locus" de la molécula donde la energía de estabilización de la carga positiva es mayor que en el resto, como, por ejemplo, una secuencia rica en guaninas. La velocidad de la transferencia de carga no está influida por la naturaleza del puente pero sí por su longitud, disminuyendo con ésta: se puede establecer una correlación logarítmica de la velocidad con la distancia entre dos guaninas consecutivas. Por otro lado, la presencia de bucles, uniones, cruces, hebras triples, etc, no afectan a la transferencia de electrones; sólo los errores en los emparejamientos G:C podrían impedir la transferencia de carga ya que favorecen la desprotonación de la guanina: la migración de la carga positiva está asociada a un desplazamiento de un protón de la guanina hacia la citosina, con lo que si existe un error de emparejamiento aumenta notablemente la acidez de la guanina. [Chem. Com., 667, (2002)].

Condiciones reductoras. Mecanismo multietapa o de "hopping".

En condiciones reductoras el mecanismo es distinto porque, en primer lugar, la conducción de electrones está en este caso asociada a la formación de aniones, y, en segundo lugar, porque la carga negativa está deslocalizada en el sistema p de los pares de bases. De nuevo, si comparamos los potenciales de ionización y afinidades electrónicas de los pares G:C y A:T, el par G:C es el mejor donador y aceptor de electrones ya que, debido a los puentes de hidrógeno entre G y C, la conjugación de los sistemas p de ambas bases es mayor, y, por tanto, la energía de estabilización por resonancia. No obstante, la diferencia entre las afinidades electrónicas de G:C y A:T es de sólo 4 kcal/mol, del orden de la energía térmica a temperatura ambiente. Esto significa que una vez que se produjera la reducción del primer par G:C, el electrón saltaría al sistema p del próximo par de bases, ya sea G:C o A:T, y así sucesivamente. La conducción de electrones se produce gracias a las interacciones existentes entre los sistemas p de las parejas de bases a causa del apilamiento de éstas. No se observa, en este caso, una dependencia de la velocidad de conducción con la distancia entre donador y aceptor. Sólo puede hablarse de un factor entrópico en el sentido de que sí existe una dependencia con la temperatura y que las bases deben estar perfectamente apiladas para que la transferencia de carga sea efectiva. No obstante, la estabilización del electrón adicional lleva asociado unos cambios estructurales en cada par de bases: los puentes de hidrógeno se deforman en un movimiento denominado de "ábaco" y la base pirimidínica se desplaza fuera del plano definido por ambas bases en otro movimiento conocido como "flapper" (aleteo). Esto da lugar a una distorsión del apilamiento, que contribuye al balance global de energía para la conducción del electrón. De esta manera, podríamos imaginar el movimiento del electrón a lo largo de la doble hélice saltando de un par de bases al siguiente en una especie de efecto "dominó". [Bioelectrochemistry amd Bioenergetics, 46,15,(1998)].

Consideraciones biológicas

La existencia de procesos de transferencia de carga en el ADN permite llevar a cabo una serie de consideraciones de indudable importancia biológica. Así podríamos destacar las posibilidades de uso de estos procesos como sensores de ADN y para el desarrollo de nuevos métodos de secuenciación del mismo. Es conocida la relevancia, especialmente en investigaciones moleculares del cáncer, de las interacciones entre el ADN de doble cadena y moléculas aromáticas de geometría plana y cíclica. Estas moléculas, denominadas de modo genérico agentes intercalantes, se sitúan entre el empaquetamiento de los pares de bases pudiendo, debido a sus peculiares características electrónicas, dado que suelen ser buenos aceptores de electrones, interrumpir el transporte electrónico a través del ADN. Las moléculas intercalantes de naturaleza metálica, tales como los complejos de rutenio (III) y rhodio (III), son los más usados como "sondas" moleculares, proporcionando interesantes informaciones sobre el alcance de la migración de electrones a través del ADN.

Los agentes intercalantes no están sólo restringidos a moléculas de "diseño químico" que interaccionan con el ADN. Las proteínas que se unen a esta macromolécula pueden influir también en la eficiencia de la transferencia electrónica a larga distancia. Así se ha demostrado que la metiltransferasa HhaI reduce el transporte de carga a la mitad y, más recientemente, que el enzima de restricción BamHI reduce la eficacia del transporte electrónico disminuyendo la densidad electrónica de la base guanina a través del enlace de hidrógeno por mediación del grupo guanidinio, cargado positivamente. Por el contrario, se ha documentado también recientemente que otros enzimas, que interaccionan preferentemente con el surco mayor de la doble hélice, pueden aumentar la eficacia del transporte de carga. Es interesante recordar que aún no se conoce en detalle la base molecular del reconocimiento del sitio de unión entre determinadas proteínas y el ADN. Algunos autores postulan que, además de factores intrínsecos de geometría molecular, puede tener lugar un reconocimiento basado en la especial especificidad electrónica que supone las características electrónicas de los pares de bases. Dichas características están basadas en un modo peculiar de "huella electrónica": los correspondientes potenciales de ionización y afinidades electrónicas de cada una de las bases, funcionando a modo de "código de barras" para un reconocimiento molecular. Los viejos conceptos de naturaleza quimicofísica ayudan, una vez más, a la moderna biología molecular.

Otro interesante impacto del transporte de carga a través del ADN radica en el papel de dicho transporte en la protección de genes frente a mutaciones. Bajo condiciones de estrés oxidativo las bases del ADN, especialmente las guaninas, son oxidadas, pudiendo causar mutaciones en el curso del proceso de replicación. Como sabemos, si la mutación tiene lugar en la región codificante, una proteína mutante puede llegar a ser sintetizada. No obstante, hay determinados genes que poseen secuencias ricas en pares guanina-citosina (G:C) localizadas justo fuera de la región codificante. Se postula que dichas secuencias actúan como sumideros de carga positiva, a la vez que como fuerza directriz, para la migración de carga a través del ADN ionizado. Esta protección de naturaleza "catódica" de genes, tal y como se le ha denominado, está siendo objeto de importantes investigaciones. De todos modos, no deja de ser intrigante cómo la naturaleza parece explotar procesos de transporte de carga en el ADN para detectar y resolver potenciales modificaciones de su información genética.

Partenogénesis en primates: huérfanos de padre

El término partenogénesis, derivado del griego nacimiento a partir de una virgen, se usa en biología para referirse a una forma de reproducción en la cual un óvulo se desarrolla sin la participación de la célula sexual masculina. Entre los animales, muchas especies de insectos se reproducen de manera natural por partenogénesis. Conocido es el caso de las abejas, en las que los huevos no fertilizados dan lugar por partenogénesis a zánganos. Desde comienzos del siglo XX este proceso se realiza in vitro en muchas otras especies animales, si bien en la mayoría de los casos se han obtenido desarrollos anormales.

Pero, ¿y en humanos? ¿Es posible una producción partenogenética? Si creyésemos en la mitología griega, ya se habría producido la producción de un ser partenogenético, aunque se trate de una deidad. El nacimiento de la diosa Atenea se produjo de una forma algo especial. Zeus, temeroso de que un hijo pudiese arrebatarle el trono del Olimpo, se tragó a su primera esposa Tetis cuando ésta quedó embarazada. Tuvo un fuerte dolor de cabeza que se curó cuando el dios Hefestos se la abrió con un hacha. En ese momento emergió Atenea, totalmente desarrollada y enfundada en una especie de armadura, de la cabeza de Zeus.

Tan sólo se trata de mitología, una especie de ciencia-ficción histórica. Igual de fantástico podría parecer hace años la producción partenogenética de embriones de primates. Y, sin embargo, ya se ha logrado por parte de científicos de la Clínica Mayo, el Centro de estudios sobre Cáncer Sloan Kettering y la Universidad Wake Forest [Cibelli y cols. Science 295:819-820 (2002)]. Los embriones son normalmente el resultado de la reproducción sexual, cuando un espermatozoide y un óvulo combinan su DNA. El trabajo de estos investigadores consistió en estimular un óvulo de mono para que se desarrollara sin la participación de espermatozoides. Usaron sustancias químicas para evitar que el óvulo expulsara la mitad de sus cromosomas y para que iniciase su división. Ninguno de los blastocitos resultantes dio lugar a un individuo viable, pero de uno de ellos se pudo derivar una línea de células madre.

Las células madre pueden, con una estimulación apropiada, ser empleadas en la producción, al menos teóricamente de cualquier tipo celular. Esto hace de la partenogénesis un proceso interesante como posible alternativa en los programas de terapia celular. Estos programas de Tecnología Celular Avanzada (en inglés Advanced Cell Technology, A.C.T.) están basados en la obtención de células madre, fundamentalmente células madre embrionarias. La industria biotecnológica tiene la esperanza de diseñar nuevas terapias a partir de estas células, como por ejemplo neuronas para el tratamiento de las enfermedades de Parkinson o el mal de Huntington; células cardiacas para tratamientos cardiovasculares, cartílago para el tratamiento de la artritis; células pancreáticas para la diabetes, etc. Una aplicación potencialmente interesante sería la diferenciación de células madres en células sanguíneas y de la médula ósea. Se abriría así un campo prometedor en el tratamiento de enfermedades autoinmunes tales como la esclerosis múltiple y la artritis reumatoide.

Las células madre embrionarias, por muy prometedor que pueda parecer su uso en técnicas de terapia celular, no solucionan el problema de la histocompatibilidad y la subsecuente posibilidad de rechazo del tejido transplantado. Las células madre obtenidas a partir de embriones humanos producidos por técnicas de fertilización in vitroson generalmente células de otro individuo con el cual el paciente no tiene por qué guardar ninguna relación de parentesco biológico. Para solucionar este problema, los programas de Tecnología Celular Avanzada están llevando a cabo investigaciones sobre tres procedimientos para la obtención de células embrionarias idénticas a las de un humano adulto (células embrionarias autólogas), entre los cuales se encuentra la producción partenogenética de embriones. Se trata de técnicas de clonación terapéutica que buscan emplear el material genético de las células del paciente para generar nuevas células. En principio se trata de técnicas diferentes a las de clonación reproductiva que buscan la implantación de un embrión clonado en una mujer, para el desarrollo de un nuevo individuo. Tales procedimientos son:

- Transferencia nuclear en células somáticas. En esta técnica, una célula del paciente, se combina con una célula huevo cuyo DNA ha sido eliminado. Como consecuencia, el DNA de la célula corporal del paciente es reprogramado a un estado embrionario, obteniéndose células madre totipotentes idénticas a las del paciente.

- Partenogénesis. En este caso, un óvulo de una mujer es estimulado para que se desarrolle directamente, tal como se ha indicado anteriormente, formando un embrión en fase de preimplantación a partir del cual se obtienen células totipotentes. En el caso de varones se podría emplear una técnica similar denominada androgénesis si bien implicaría transferir dos núcleos de células espermáticas en el óvulo al que se habría despojado de su núcleo.

- Transferencia oogénica. En el ángulo opuesto a la transferencia nuclear, esta técnica implica la eliminación del citoplasma de un oocito previamente a la transferencia en una célula del paciente, que se transforma en una célula madre pluripotente.

¿Y cuándo oiremos hablar del primer ser humano partenogenético? Ya se ha anunciado la clonación de embriones humanos, si bien no han crecido más allá de unas pocas células. A ello hay que unir las dudas que surgen respecto a la seguridad y eficacia de esta técnica. Muchos investigadores creen que el DNA de la célula masculina que se combina con el DNA de la femenina para formar el cigoto, probablemente juegue un papel importante en la activación genética, al menos en algunos tipos de células madre. Así, estudios en ratones obtenidos partenogenéticamente muestran que las células madre se diferencian más fácilmente en neuronas que en otros tipos celulares.

Y a los condicionantes técnicos y biológicos habría que añadir los éticos, derivados de la experimentación con cualquier material de origen humano. De hecho, los autores de la investigación consultaron previamente con un equipo asesor formado por abogados, especialistas en bioética y especialistas en fertilidad. Sin embargo, todas estas técnicas, a pesar de las diversas trabas, avanzan a pasos agigantados. No obstante, será difícil que como en el caso de los zánganos, se pueda encontrar algún día un ser humano que, no teniendo padre, tenga abuelo.