apuntes de biología

Análisis fractal de la estructura terciaria de las proteínas

La estructura de las proteínas se ha podido observar mediante rayos X y resonancia magnética nuclear, descubriéndose en su estructura regular distintos tipos de conformación que aparecen después de cuidadosos análisis de su estructura terciaria. Esta es muy compleja y tan sólo puede ser descrita de forma meramente cualitativa. Es necesario obtener un método de análisis de la conformación de las proteínas, que sea cuantitativo y objetivo, y que extraiga información de la irregularidad de las estructuras de las moléculas. Hasta hace poco, las herramientas más usuales eran las geometrías euclídea y diferencial, limitándose estas técnicas al estudio de formas como el círculo, la elipse, la parábola, la esfera y curvas o superficies diferenciables. Para las formas extremadamente irregulares estas geometrías no sirven. Es en este contexto donde se aplica la teoría de los fractales. La teoría trata con formas irregulares y proporciona medios cuantitativos para extraer una regularidad tras una aparente forma irregular.Dimensión fractal
El advertir el contraste entre la geometría euclídea y la naturaleza es una idea antigua. El objetivo que hay tras la geometría fractal es una matematización de las formas naturales que va más allá de la geometría euclídea. La dimensión euclídea coincide con el número de coordenadas. La comprensión de los procesos de irregularidad y de fragmentación no se puede producir de forma satisfactoria con la definición de este tipo de dimensión. Se puede distinguir entre dos tipos de dimensiones. La euclídea DT que es un número entero y la dimensión D formulada por Hausdorff en 1919, que puede ser un número real. Todos los conjuntos euclídeos cumplen D= DT mientras que los fractales son aquellos conjuntos para los que D> DT (B. B. Mandelbrot, Fractals: Form, Chance, and Dimension, Freeman, San Francisco, 1977).
Estudiemos un perfil de una costa. Mientras desde el punto de vista topológico tiene dimensión 1, la dimensión fractal o de Hausdorff difiere de unas costas a otras. Si nos detenemos a pensar por un instante en la longitud de una línea de costa, concluiremos que no está unívocamente determinada. Si medimos una costa de kilómetro en kilómetro, su longitud tiene un cierto valor. Si la medimos de metro en metro, la longitud aumenta muchísimo, ya que nos podemos introducir en calas, por ejemplo, de las que antes habíamos contado a lo sumo, la amplitud de la boca. Si la medimos de milímetro en milímetro, tenemos un nuevo incremento espectacular de longitud. Así, la línea de costa es una curva matemática no rectificable, cuya longitud depende de la unidad de medida. A pesar de que desde el punto de vista topológico tiene dimensión unidad, se define según Hausdorff-Besicovitch la dimensión D como
1-D = lim(eÔ0) log L(e)/log e donde L es la longitud de la curva medida con el patróne. Esta dimensión indica cómo crece la longitud al disminuir la unidad de media. Lo mismo se puede hacer en el caso de las superficies o de las distribuciones irregulares de puntos, como la disminución de galaxias en el universo.
Significado de la dimensión fractal
Una idea intuitiva de la dimensión fractal la podríamos obtener al considerar la trayectoria errática de una partícula en un fluido en el movimiento browniano. A pesar de ser de dimensión unidad, esta curva cubre casi toda la superficie. Además, al considerar un fragmento pequeño de esta línea, un fragmento que a primera vista era rectilíneo, se observa que, en realidad, está compuesto por una línea irregular muy parecida a la línea total. Al considerar fragmentos cada vez más pequeños, esta característica se mantiene. Esto permite intuir que una curva de estas características tiene una dimensión fractal comprendida entre 1 y 3, ya que a pesar de ser una línea, prácticamente llena todo el espacio.
Desde 1980, las revistas científicas de todas las especialidades han publicado centenares de artículos sobre la dimensión fractal [B. H. Kaye, A Random Walk through Fractal Dimensions, VCH, Weinheim, (1994)].
Dimensión fractal de las proteínas
Ilustraremos cómo se puede determinar la dimensión fractal de la estructura terciaria de las proteínas. Definimos la longitud de la proteína L como una función del patrón de medida e a partir de la siguiente definición (véase la figura).

A partir del átomo Ca del residuo N terminal se dibuja una línea en zigzag que conecte los átomos Ca de la proteína a intervalos de e en eresiduos. Si al llegar al último tramo de la molécula quedan una cantidad inferior a e residuos, se detiene el proceso en ese punto. Notemos que cuanto menor es e mayor es el nivel de detalle con que se observa la molécula.La longitud de la proteína se calcula como la suma de las longitudes de los distintos tramos de la línea en zigzag más la contribución del tramo final que se puede evaluar a partir de conocer el número de residuos, el tamaño e de la escala y la longitud media de los distintos tramos de la línea en zigzag. De esta forma puede construirse en función de e, a partir de la información contenida en los bancos de datos referentes a las proteínas. Al representar en función de se obtiene una zona rectilínea. Las dimensiones fractales se obtienen de las pendientes de estas rectas.
Isogai e Itoh analizaron las estructuras terciarias de 43 proteínas seleccionadas para cubrir las cinco clases estructurales de moléculas proteicas: proteínas con sólo hélices a (a), casi exclusivamente hoja b (b), hélice a y hoja b tendiendo a estar segregadas a lo largo de la cadena(a+ b), hélice a y hoja b tendiendo a alternar a lo largo de la cadena (a/b) y ninguna hélice a ni hoja b (miscelánea) [Y. Isogai y T. Itoh, J. Phys. Soc. Jpn., 53, 2162 (1984)]. Aplicaron la teoría fractal con la intención de idear una herramienta nueva para la descripción cuantitativa de la estructura terciaria de las proteínas. Sus resultados para la dimensión fractal D se resumen promediados por clases en la tabla siguiente, donde N es el número de residuos para cada clase.

Clase estructural                                                                                                       N         D____

Sólo hélices a                                                                                                         136       1,39

Casi exclusivamente hojab                                                                                 191       1,29

Hélice a  y hoja b  tienden a estar segregadas a lo largo de la cadena      180       1,34

Hélice a  y hojab  tienden a alternar a lo largo de la cadena                      292       1,34

Ninguna hélice a  ni hoja b                                                                             109        1,40

Media de las cinco clases estructurales                                                               211        1,34

Cadena Gaussiana                                                                                                   -            1,50

En promedio, se encuentra que la dimensión fractal vale 1,34. Este valor puede compararse con la dimensión fractal que se obtendría para una cadena gaussiana, que vale 1,50. Vemos que la dimensión fractal es menor que la de la cadena gaussiana.
La interpretación correspondiente es que la molécula está más alargada que una cadena aleatoria, debido a la repulsión estérica entre átomos próximos. Vemos pues cómo la idea de interacción repulsiva se traduce en un coeficiente fractal menor, en comparación con el caso sin interacciones.
La clase b se distingue cuantitativamente de otras clases
A continuación se examinan separadamente las dimensiones fractales de varias clases estructurales. La magnitud de los valores medios de la dimensión fractal para las cinco clases estructurales disminuye en el orden de la clase miscelánea, a, a+b, a/b y b, y la clase de tipob muestra diferencias significativas entre las otras clases excepto la de tipo misceláneo. La clase miscelánea muestra el valor mayor de la dimensión fractal, pero esto no debe acentuarse mucho porque esta clase incluye sólo dos proteínas. Es una consecuencia natural que las clases a y b muestran los valores mayor y menor de la dimensión fractal, respectivamente, entre las clases excepto la clase miscelánea, porque la estructura local de la clase b se extiende más que la de la clase a y las de las clases á+b y á/b caen en medio.
La explicación correspondiente es que la capacidad del análisis fractal está restringida a límites estrechos y no es capaz de distinguir las diferencias pequeñas de las estructuras locales de los tipos a+b y a/b. La dimensión fractal se define con las estructuras locales en el intervalo de 10 residuos de aminoácidos. Este intervalo es demasiado corto para distinguir las diferencias pequeñas de las estructuras locales de los tipos a+b y a/b cuyas estructuras locales notables se caracterizan más allá de este intervalo.

Vasculogénesis postnatal y macrófagos taladradores: La sorpresas no acaban

En el número 38 de Encuentros en la Biología (febrero 1997) nos dedicamos de forma monográfica al tema del desarrollo y crecimiento vascular. Alli establecíamos una distinción que ha sido paradigmática durante los últimos veinte años. El desarrollo del sistema vascular, decíamos, se produce por dos mecanismos, vasculogénesis y angiogénesis. Definíamos la vasculogénesis como la formación de novo de vasos por diferenciación y ensamblaje de precursores mesodérmicos indiferenciados. Estos precursores se unen, se alinean formando cordones que desarrollan una cavidad interna y dan lugar a capilares primitivos. Por otra parte la angiogénesis consistía en un proceso celular, exquisitamente regulado, por el que vasos ya establecidos producen ramificaciones e invaden tejidos en respuesta a estímulos normales o patológicos. Hace tres años afirmábamos que vasculogénesis y angiogénesis coexistían en el embrión mientras que la angiogénesis era el único mecanismo de desarrollo vascular presente en el organismo adulto.

Sin embargo, se acaban de publicar interesantes novedades que no sólo sugieren la existencia de procesos de vasculogénesis en el adulto, sino que además postulan la posible existencia de mecanismos inéditos de angiogénesis.

La primera sorpresa saltó precisamente en 1997, cuando un grupo de investigadores de la Universidad Tufts mostraron la existencia de células circulantes en la sangre que eran capaces de incorporporarse a la pared de vasos en crecimiento y diferenciarse en células endoteliales [Asahara et al.,Science 275:965-967 (1997)]. En concreto, estos autores aislaron, en sangre humana, una fracción de células sanguíneas mononucleares caracterizadas por expresar en su superficie el antígeno CD34 así como el receptor para el VEGF, un factor de crecimiento del que hablaremos más adelante. Cuando estas células eran cultivadas sobre colágeno o fibronectina, se adherían al sustrato y expresaban marcadores exclusivos de células endoteliales. Además, dependiendo de las condiciones de cultivo, las células formaban tubos o incluso se diferenciaban en estructuras similares a los islotes sanguíneos embrionarios, con células sanguíneas rodeadas de endotelio.

Para confirmar este resultado, los investigadores concentraron células mononucleares CD34+ procedentes de ratones transgénicos en los que se expresa el enzima beta-galactosidasa bajo control de un promotor exclusivamente endotelial, el del gen Tie-2, que codifica para un receptor de la angiopoyetina. Esto quiere decir que todas las células endoteliales expresan beta-galactosidasa de forma constitutiva y son fácilmente reconocibles en los tejidos [Schlaeger et al. Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:3058-3063 (1997)]. Las células CD34+ procedentes de estos ratones Tie-2 fueron transfundidas a ratones sometidos a una operación consistente en la ligadura de la arteria femoral. En este modelo se produce una isquemia (una falta de riego) en la parte distal de la pata, lo cual se compensa en cuestión de días con el desarrollo de vasos que salvan la zona ligada y restablecen el riego de la extremidad. Pues bien, en el endotelio de los vasos de neoformación se reconocen abundantes células que expresan beta-galactosidasa y que sólo pueden derivar de la diferenciación endotelial de las células CD34+ inyectadas. Por supuesto, al tratarse de endotelio diferenciado in situ a partir de precursores circulantes indiferenciados, era preciso hablar de vasculogénesis y no de angiogénesis. La vasculogénesis postnatal aparecía como nuevo paradigma en el campo de la biología vascular.

Este descubrimiento, que fue recibido con no poco escepticismo, planteaba interesantes expectativas. Imaginemos un tumor sólido en fase de crecimiento, que estimula el crecimiento de los vasos próximos a través de los cuáles recibe su suministro de nutrientes y oxígeno. Imaginemos que obtenemos células CD34+ del paciente y logramos modificarlas genéticamente para expresar agentes antitumorales o antiangiogénicos. Dichas células, liberadas de nuevo en la sangre del paciente, se alojarían preferentemente en los vasos en crecimiento del tumor, donde podrían liberar sus agentes terapéuticos. Del mismo modo imaginemos un miocardio que ha sufrido una isquemia a consecuencia de un infarto. El crecimiento de vasos hacia la zona afectada podría acelerarse "convenciendo" a las células CD34+ para que produzcan y liberen factores angiogénicos (es decir, promotores del crecimiento vascular) en el lugar en el que se incorporen a la pared de los vasos.

Pero el descubrimiento planteaba también importantes incógnitas: ¿De dónde proceden dichas células? Esta pregunta se respondió muy pronto. Las células mononucleares CD34+ proceden de la médula ósea, el tejido que alberga las células madre hematopoyéticas [Shi et al., Blood 92, 362-367 (1998); Asahara et al. Circ.Res. 85:221-228 (2000)]. En cuanto a los mecanismos que regulan su liberación a la sangre, se ha puesto de relieve la participación de un elemento fundamental en la biología de las células endoteliales, el VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor). Este factor de crecimiento es un potente mitógeno específico de células endoteliales, y es liberado por muchos tipos celulares en respuesta a la falta de oxígeno. Desempeña también un papel fundamental en la diferenciación de los precursores endoteliales y hematopoyéticos en el embrión, por lo que interviene tanto en angiogénesis como en vasculogénesis. Lo que se acaba de comprobar es que VEGF moviliza también los precursores endoteliales albergados en la médula ósea aumentando su abundancia en la sangre [Asahara et al., EMBO J, 18:3964-3972 (1999)]. La situación es análoga a la que ocurre con diversas citoquinas que movilizan precursores hematopoyéticos desde la médula ósea a la sangre. De esta forma las funciones de VEGF se amplían, desde las de un factor paracrino local, actuando en las distancias cortas, hasta las de una hormona capaz de producir efectos en tejidos muy alejados.

No sólo inesperados mecanismos de vasculogénesis postnatal han agitado recientemente las aguas de la biología cardiovascular. Acaba de publicarse un interesantísimo trabajo acerca de la inesperada función que los macrófagos podrían desempeñar en fenómenos de neovascularización, nada menos que taladrando túneles en tejidos que han sufrido isquemia, fundamentalmente en el miocardio. Pero vayamos por partes. Es bien conocido que tras un episodio no fatal de isquemia en el miocardio, producido por un infarto, comienza la revascularización del tejido afectado mediante crecimiento de vasos desde la periferia del área isquémica. Este crecimiento, un típico caso de angiogénesis, implica la proliferación y migración del endotelio para formar capilares que aportan nuevo suministro sanguíneo. Pues bien, un grupo de investigadores estadounidenses han descubierto un fenómeno inesperado en un nuevo modelo de miocardio isquémico [Moldovan et al., Circ.Res. 87:378-384 (2000)]. Dicho modelo consiste en ratones que sobreexpresan la proteína quimioatrayente de monocitos (MCP-1), una citoquina, bajo control del promotor de la cadena pesada de miosina cardiaca alfa, que se expresa sólo en el corazón. Esto provoca que el miocardio de estos ratones produzca una gran cantidad de MCP-1 atrayendo a los monocitos circulantes. Contrariamente a lo que esperaban y deseaban los investigadores, los monocitos se acumulan en los capilares cardiacos hasta tal punto que los obliteran progresivamente, causando en ocasiones insuficiencia cardiaca y muerte prematura. La sorpresa saltó al examinar el miocardio isquémico de estos ratones. Este músculo aparece acribillado literalmente por pequeños táneles tapizados por células planas. El aspecto es el de pequeños capilares, y de hecho en ocasiones se observa sangre en su interior. Sin embargo, las células que los revisten no expresan ningún marcador de células endoteliales, por lo que se desconoce su naturaleza. Lo que sí parece claro es que los túneles son excavados por los numerosos macrófagos que han invadido el tejido cardiaco. Los autores del trabajo sugieren la posibilidad de que dichos túneles recluten precursores endoteliales circulantes (las células CD34+), y acaben conectando con la circulación general y formando auténticos vasos.

La cuestión es intrigante y polémica, aunque también abre interesantes expectativas. Una de las principales interrogantes es el origen y la naturaleza de las células que tapizan los túneles. Y esto lleva a otro intrigante y controvertido fenómeno, el del "mimetismo vascular", un término recientemente acuñado [Maniotis et al., Am.J.Pathol. 155:739-752 (1999)]. Se ha observado que células tumorales (en melanomas) son capaces de imitar a las células endoteliales y formar conductos vasculares complejos y ramificados, en los que se detecta la presencia de sangre. No olvidemos que incluso en situaciones normales células no endoteliales son capaces de asumir sus funciones. El caso más conocido es el de las células del citotrofoblasto placentario, que invaden la red vascular materna en el útero y adoptan la apariencia de células endoteliales.

Como decíamos al principio, muchas son las sorpresas que nos ha deparado la biología vascular en los últimos años, y probablemente son más las que nos esperan, sobre todo en lo que concierne a las aplicaciones terapéuticas de los nuevos conocimientos.