Bioquímica - Biología molecular

Fitohormonas : Las poliaminas son moléculas de naturaleza policatiónica presentes en plantas, animales y microorganismos. En las primeras actúan como fitohormonas, esto es, reguladores del desarrollo, aunque algunos científicos cuestionan dicha actuación,¹ debido a que suconcentración en la planta es muy elevada, lo que es opuesto a la idea de que intervengan como hormonas, sustancias, que por definición, son activas en muy baja dosis. Podría ser, por ello, que actuaran simplemente como segundos mensajeros.¹ No obstante, queda claro que afectan a aspectos del desarrollo, crecimiento, senescencia y respuesta a estrés. Las poliaminas son biosintetizadas a partir de la cadaverina y por transferencia de un grupo aminopropilo proporcionado por una molécula de S-adenosil metioninadescarboxilada.

Las poliaminas más eminentes en plantas son la diamina putrescina, la triamina espermidina y la tetraamina espermina. Debido a su naturaleza policatiónica, pueden unirse y estabilizar a polímeros ricos en cargas negativas como es el DNA,² pero también a fosfolípidos y proteínas.¹ Dichas funciones se postulan igualmente para animales y microorganismos.

Un ejemplo de su importancia es que cuando su síntesis está inhibida, el ciclo celular se detiene o retarda, a no ser que se añadan exógenamente. La mayoría de célulaseucariotas poseen un sistema de transporte de poliaminas ubicado en la membrana plasmática que facilita la captación de poliaminas exógenas. Dicho sistema, de vital importancia en tejidos animales que se encuentran en proliferación, es una diana farmacológica en el desarrollo de nuevos compuestos quimioterapéuticos.³

En animales, las poliaminas derivan del metabolismo de los aminoácidos o bien proceden del metabolismo de bacterias intestinales o dieta, entrando en el organismo por circulación enterohepática.

Por su carácter básico, interactúan con los ácidos nucleicos, con papel estabilizante o como factores de crecimiento, de ahí que cada vez se les atribuya mayor importancia en la proliferación celular.

En mamíferos, los ejemplos más importantes de poliaminas son si cabe la espermina (cuatro grupos amino) y la espermidina (tres grupos amino), ambas formadas a partir de la descarboxilación de la ornitina, la cual forma un intermediario de dos grupos amino, la putrescina. De ahí que en animales en putrefacción se acumule putrescina, la ornitina pierde CO₂, pero la putrescina formada no se puede transformar en espermidina sin la coenzima AdoMet.

Cabe mencionar que el grupo butilamino de la espermidina se usa para modificar postraduccionalmente algunos factores de iniciación proteica en eucariotas, mientras que la putrescina parece tener un papel importante en la protección del organismo tras crisis epilépticas.

Las poliaminas son un grupo de sustancias básicas de bajo peso molecular que están presentes en prácticamente todos los organismos vivos y cumplen múltiples funciones esenciales tanto en la biosíntesis de ácidos nucleicos y proteínas como en la proliferación y diferenciación celular. La inhibición de la biosíntesis de poliaminas es una de las estrategias más adecuadas en la búsqueda de drogas antiproliferativas eficientes. Las concentraciones endógenas de poliaminas en células de mamíferos están reguladas por mecanismos de retroinhibición e interconversión que pueden contrarrestar el bloqueo del metabolismo de dichas sustancias en las células mencionadas. Contrariamente, los protozoarios Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruzi y diferentes especies de Leishmania tienen un metabolismo de poliaminas más simple y carecen de capacidad para regularlo. Esto explica la dependencia de los parásitos del transporte de poliaminas desde el medio externo. Por otra parte el compuesto bis-glutationil espermidina (tripanotiona), un cofactor esencial para mantener el equilibrio intracelular de óxido-reducción, se ha encontrado exclusivamente en protozoarios tripanosomátidos y este hecho también contribuye al efecto selectivo antiparasitario de algunas drogas que inhiben la biosíntesis de poliaminas. Trypanosoma cruzi es el único organismo eucariótico incapaz de sintetizar poliaminas “de novo” pues carece de las decarboxilasas de ornitina y arginina que son las enzimas que catalizan el primer paso de los dos posibles caminos metabólicos en la síntesis de poliaminas. Investigaciones de nuestro laboratorio han demostrado que la carencia mencionada no se debe a factores inhibitorios del medio interno del parásito sino a la ausencia de los genes correspondientes en el genoma de T. cruzi. Por esta razón el protozoario se comporta como una mutante de deleción natural de los genes que codifican las enzimas de biosíntesis de putrescina, sustancia precursora de las demás poliaminas. Después de transformar T. cruzi con plásmidos recombinantes que contienen genes exógenos que codifican ornitina o arginina decarboxilasa de otros organismos, estudiamos la expresión de los genes heterólogos en los parásitos transgénicos.

Palabras Clave: biosíntesis de poliaminas; epimastigotes de T. cruzi; ornitina decarboxilasa; arginina decarboxilasa; parásitos transgénicos.

 

Molecular Biology of polyamine metabolism in trypanosomatid parasites. Expression of heterologous ornithine and arginine decarboxylase genes in T. cruzi.

ABSTRACT

Trypanosoma cruzi is the etiological agent of Chagas disease, which affects millions of people in Latin America. Many studies on the biochemistry and molecular biology of  parasites try to find whether their metabolic pathways are markedly different from those of the mammalian host in order to detect appropriate targets useful for the design of antiparasitic chemotherapies. Polyamine metabolism in T. cruzi is a good candidate due to its unique properties.

Polyamines, a group of low molecular weight basic substances, are present in practically all living organisms and play essential roles in the biosynthesis of nucleic acids and proteins as well as in cell proliferation and differentiation. The inhibition of polyamine biosynthesis is a promising strategy in the search for antiproliferative drugs. The endogenous concentrations of polyamines in mammalian cells are regulated by several mechanism of retroinhibition and interconversion which can compensate the effect of specific inhibitors. In contrast, polyamine metabolism in many parasites such as T. brucei, T. cruzi and different species ofLeishmania, is simpler and cannot be regulated. Therefore, these protozoa need the uptake of polyamines from the external medium for their proliferation. On the other hand, bis-glutathionyl spermidine (trypanothione), a cofactor responsible for the endogenous redox balance, has been found exclusively in trypanosomatid protozoa; this fact can explain the selective antiparasitic effect of some drugs blocking polyamine biosynthesis.

Trypanosoma cruzi is the only eukaryotic organism unable to synthesize polyamines “de novo” due to the absence of ornithine and arginine decarboxylases, the enzymes catalysing the first step of both metabolic pathways in polyamine biosynthesis. Studies carried out in our laboratory have shown that the lack of these enzymatic activities is not caused by internal inhibitory factors in the parasite, but to the absence of the corresponding genes in the T. cruzi genome. Therefore, this parasite behaves as a natural deletion mutant of genes coding for putrescine biosynthetic enzymes. We have prepared transformed T. cruzi by electroporation with recombinant plasmids bearing exogenous ornithine and arginine decarboxylase genes from other organisms, and the expression of the heterologous genes in the transgenic parasites have been investigated.

Key words: polyamine biosynthesis; T. cruzi epimastigotes; ornithine decarboxylase; arginine decarboxylase; transgenic parasites.

 

Introducción

Las poliaminas son un grupo de sustancias básicas de bajo peso molecular que están presentes en prácticamente todas las células procarióticas, eucarióticas y arqueobacterias con muy pocas excepciones. Desempeñan múltiples funciones esenciales tanto en la biosíntesis de ácidos nucleicos y proteínas, como en la proliferación y diferenciación celular (1-3). Su flexible esqueleto alifático y su naturaleza policatiónica con cargas positivas distanciadas entre sí (Figura 1) les permite interactuar con diferentes regiones de macromoléculas o estructuras cargadas negativamente como el DNA, RNA, nucleoproteínas, fosfolípidos, partículas ribosomales y membranas, lo que explica su participación en procesos tan diversos como la replicación del DNA, transcripción, síntesis proteica y multiplicación celular. La determinación de los niveles de poliaminas y de la enzima que cataliza el primer paso de su biosíntesis durante el ciclo celular ha indicado que aumentan significativamente en la interfase G1/S y durante G2 antes del comienzo de la mitosis. Estos resultados confirman la importancia de las poliaminas en la  proliferación celular (4-6).

H2N-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2

H2N-CH2-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2

H2N-CH2-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-CH2-NH2

Putrescina

Espermidina

Espermina

Figura 1: Estructura de poliaminas

 

La síntesis de poliaminas en células eucarióticas se inicia con la decarboxilación de ornitina para producir putrescina en una reacción catalizada por la enzima ornitina decarboxilasa (ODC). La putrescina a su vez puede añadir uno o dos grupos aminopropilos formando espermidina o espermina, respectivamente (Figura 2). En estos casos el dador de grupos aminopropilos es el compuesto S-adenosil metionina decarboxilado que se forma a partir de S-adenosil metionina. La degradación intracelular de poliaminas se inicia por un proceso de reconversión que consiste en dos etapas: acetilación y posterior oxidación, o una reacción directa de oxidación (7,8).

Figura 2: Metabolismo general de las poliaminas.

La concentración endógena de poliaminas en las células de mamíferos se encuentra estrictamente regulada por una serie de mecanismos de homeostasis que comprende tanto su biosíntesis y transporte desde el medio externo como su degradación y excreción. Las enzimas limitantes de la biosíntesis son la ODC y la S-adenosil metionina decarboxilasa (SAMDC). Ambas tienen una reducida estabilidad metabólica con vidas medias del orden de 30 minutos y tanto su inducción como su degradación varían por mecanismos compensatorios que responden a la reducción o aumento de los niveles intracelulares de poliaminas (9). La ODC de células animales, como otras proteínas metabólicamente inestables contienen en su estructura regiones PEST que son segmentos ricos en los aminoácidos prolina, ácido glutámico, serina y treonina. En general en estos casos las secuencias PEST se encuentran ubicadas cerca del extremo C-terminal de la cadena polipeptídica. La degradación de la enzima está regulada por una proteína específica llamada antizima, que al unirse a los monómeros de ODC impide la formación de los dímeros activos, dejando expuestas las regiones PEST. Los monómeros unidos a antizima son entonces reconocidos por el proteosoma 26S que degrada rápidamente la enzima ODC liberando al mismo tiempo la antizima en un proceso independiente de ubiquitina (10-12). La cantidad de antizima aumenta en las células cuando se incrementan los niveles endógenos de poliaminas, que de esta manera tienden a regularse por destrucción de ODC.

En células de plantas y en bacterias se ha descripto una segunda vía biosintética de poliaminas que comprende dos etapas: la decarboxilación de arginina por arginina decarboxilasa (ADC) para dar agmatina, y la posterior hidrólisis de esta sustancia dando lugar a la formación de putrescina mediante una reacción catalizada por la enzima agmatinasa (Figura 2).

La síntesis de difluormetilornitina (DFMO) permitió disponer del primer inhibidor específico e irreversible de ODC (13-15). Esta droga análoga a ornitina causa la supresión del contenido intracelular de poliaminas, y como consecuencia la detención de la proliferación celular en cultivos “in vitro”. Estos resultados llevaron a probar DFMO como posible agente antitumoral, pero los ensayos en modelos “in vivo” indicaron que en estas condiciones el inhibidor sólo ejerce efectos citostáticos y no citotóxicos, debido a mecanismos celulares compensatorios como el aumento del transporte de poliaminas o la inducción de las enzimas responsables de su biosíntesis (16,17).

Metabolismo de poliaminas en parásitos.

Los tripanosomátidos constituyen un grupo de protozoarios parásitos que utilizan uno o dos organismos hospedadores para completar su ciclo de vida. Entre los tripanosomátidos monogenéticos cuyos únicos huéspedes son insectos se han caracterizado diversas especies de los géneros Crithidia, Leptomonas yHerpetomonas. Los tripanosomátidos digenéticos utilizan como hospedadores a insectos y a vertebrados (o plantas) y tienen ciclos de vida complejos durante los cuales sufren procesos de diferenciación que involucran grandes cambios fisiológicos y bioquímicos que les permiten adaptarse a los ambientes que encuentran en sus hospedadores (18,19). El grupo de protozoarios tripanosomátidos digenéticos incluye parásitos patógenos para el hombre que causan graves enfermedades como el Mal de Chagas producido por Trypanosoma cruzi, la Enfermedad del Sueño causada por Trypanosoma brucei y varios tipos de leishmaniasis originadas por la infección con diferentes especies del género Leishmania.

Los organismos parásitos se caracterizan porque muchas veces no poseen caminos metabólicos que están presentes en sus hospedadores mamíferos de los cuales pueden obtener metabolitos que necesitan para su supervivencia y proliferación sin necesidad de sintetizarlos de novo. Se ha demostrado que durante la evolución el genoma de algunos parásitos ha perdido conjuntos de genes que codifican las enzimas responsables de las vías metabólicas cuyos productos sintetizados por los hospedadores son internalizados y utilizados directamente por los parásitos. Este es el caso de la putrescina en T. cruzi, que la transporta a su interior y la usa como precursor de espermidina y tripanotiona.

Numerosos estudios sobre la bioquímica y biología molecular de los tripanosomátidos digenéticos intentan buscar diferencias en el metabolismo entre los parásitos y las células de sus hospedadores mamíferos, con el propósito de detectar blancos adecuados para el diseño de estrategias quimioterapéuticas efectivas contra las enfermedades parasitarias. El metabolismo de poliaminas de los parásitos presenta propiedades significativamente diferentes al de las células humanas. Por lo tanto se puede esperar que algunas drogas antipoliamínicas puedan eliminar selectivamente los parásitos sin mayores efectos sobre los hospedadores.

Trabajos realizados en diferentes laboratorios sobre protozoarios tripanosomátidos han demostrado que la biosíntesis de poliaminas en Trypanosoma brucei,Crithidia fasciculata y distintas especies de Leishmania ocurre mediante la acción inicial de la enzima ornitina decarboxilasa (18-20), y que el transporte de putrescina y espermidina desde el medio externo es relativamente reducido pero puede inducirse significativamente al disminuir los niveles endógenos de poliaminas. Es interesante señalar que algunas propiedades de la enzima ODC en tripanosomátidos digenéticos son muy diferentes a la de la misma enzima en células animales y parásitos monogenéticos. La ODC de Trypanosoma cruzi y Leishmania es metabólicamente estable, con una vida media mayor a 8 horas en contraposición a lo que sucede en células de mamíferos y en Crithidia fasciculata donde es inestable (vida media de 30 minutos). Coffino y su grupo (21-24) demostraron que aunque la ODC de T. brucei y de células de ratón tienen una estructura relativamente homóloga, a la primera le falta el segmento del extremo C-terminal del polipéptido de aproximadamente 35 aminoácidos, presente en la enzima de células de mamíferos, que contiene la región PEST responsable de la rápida degradación de la proteína. Esta conclusión fue confirmada al preparar moléculas recombinantes con la estructura de ODC de T. brucei fusionada a la región del extremo C-terminal de la enzima de ratón, que resultó inestable. En el caso de la ODC de Crithidia fasciculata se determinó que aunque tiene una alta identidad de secuencia (69 %) con la enzima de Leishmania donovani, y tampoco contiene la región PEST del extremo C-terminal, sin embargo es inestable, indicando que las señales de degradación pueden estar en regiones aún no determinadas de su estructura (24). La diferencia de estabilidad de la ODC de parásitos digenéticos y de células animales parece ser la razón del efecto antiparasitario selectivo de la droga DFMO, inhibidor específico de ODC. El rápido recambio de la enzima en células de mamíferos determina la continua síntesis de nueva enzima que permite eludir el efecto del DFMO; en cambio la ODC estable del T. brucei permanece permanentemente inhibida por la droga, produciendo la drástica reducción de los niveles endógenos de poliaminas y el consecuente bloqueo de la proliferación del parásito (25). Estas consideraciones están de acuerdo con resultados de Bacchi y colaboradores que encontraron que la inhibición de la actividad de ODC por DFMO puede curar infecciones agudas de conejos con Trypanosoma brucei brucei (26,27). La misma droga ha sido efectiva en el tratamiento de la enfermedad del sueño en humanos provocada por el Trypanosoma brucei gambiense (28).

El compuesto bis-glutationil espermidina (tripanotiona) se ha encontrado exclusivamente en parásitos tripanosomátidos (29). Esta sustancia mantiene el balance endógeno de oxido-reducción de los parásitos y es su principal defensa contra superóxidos y radicales libres (30), por lo que el bloqueo de su síntesis puede ser un punto clave de terapias antiparasitarias específicas (Figura 3).

Cys GlyNH (CH2)3                  NH (CH2)4   Cys GlyNH

Glu

Glu

Tripanotiona N1,N8 (bis) glutationilespermidina

Figura 3: Estructura de la tripanotiona.

Como ya se ha mencionado la síntesis, interconversión y transporte de poliaminas en células de mamíferos puede ser regulada por múltiples mecanismos de inducción, represión, activación y retroinhibición (7,8). En contraposición, en muchos parásitos los caminos biosintéticos que producen poliaminas son más simples y en general poco sensibles a mecanismos de regulación (18).

Metabolismo de poliaminas en T. cruzi.

El Trypanosoma cruzi es un caso único ya que la actividad enzimática de ODC es no detectable y los nivelas endógenos de poliaminas dependen de un activo sistema constitutivo de transporte (31,32).

Estudios realizados en nuestro laboratorio usando formas epimastigotes de T. cruzi han demostrado que este parásito es el único organismo eucariótico conocido que carece de la capacidad de sintetizar poliaminas de novo (31,33). Esta deficiencia se debe a la falta de las actividades enzimáticas de ornitina y arginina decarboxilasas que en todas las condiciones de ensayo dieron valores despreciables en diferentes cepas del protozoario. Estos resultados concuerdan con experimentos “in vivo” en los que demostramos que T. cruzi no puede mantener su crecimiento en un medio de cultivo semisintético que no contiene poliaminas. El agregado de ornitina o arginina al medio no reinicia la proliferación, confirmando que estos dos aminoácidos no pueden ser precursores de poliaminas en epimastigotes de T. cruzi. Sólo el agregado de putrescina o espermidina permite reiniciar la multiplicación del parásito (34) (Figura  4).

Figura 4: Crecimiento de T. cruzi en medio semisintético SDM₇₉ con distintos suplementos.

Existe una correlación entre el crecimiento de T. cruzi en diversas condiciones y los correspondientes niveles intracelulares de poliaminas. Se pudo determinar que la proliferación del parásito depende exclusivamente de las concentraciones endógenas de espermidina, ya que el agregado al cultivo de putrescina junto con ciclohexilamina, que inhibe su conversión a espermidina, no permite la multiplicación de T. cruzi aunque el nivel de putrescina se encuentre marcadamente aumentado. La espermidina debe ser indispensable, porque además de cumplir las múltiples funciones de las poliaminas, es el sustrato obligado para sintetizar tripanotiona (35) (Figura  5).

Figura  5: Metabolismo de poliaminas en T. cruzi.

1: ornitina decarboxilasa; 2: arginina decarboxilasa; 3: arginasa; 4: agmatinasa; 5: espermidina sintetasa; 6: tripanotiona sintetasa; 7: tripanotiona reductasa.

Ornitina decarboxilasa, arginina decarboxilasa, arginasa y agmatinasa están ausentes en T.cruzi.

          La ausencia de las actividades enzimáticas de ODC y ADC en T. cruzi pueden deberse a varias causas (Tabla 1).

Tabla 1: Causas de falta de actividad enzimática de ADC en T. cruzi

·         Transporte deficiente de arginina

·         Presencia de inhibidores de ADC en T. cruzi

·         Represión del gen de ADC

·         Ausencia del gen de ADC en el genoma de T. cruzi

Hemos investigado todas estas posibilidades y encontramos que los aminoácidos ornitina y arginina se transportan eficientemente  y son normalmente utilizados por los parásitos. Además no se han podido detectar inhibidores de las enzimas ODC o ADC en los extractos de epimastigotes de T. cruzi. También se ha descartado que el medio interno del parásito pudiera contener represores de la expresión de los genes de ODC y ADC. Esta conclusión se basa en experimentos de transformación de cepas salvajes de T. cruzi con plásmidos recombinantes que contenían las regiones codificantes de genes heterólogos de ODC o ADC. En ambos casos se obtuvo parásitos transformados con altos niveles de expresión de los genes exógenos (31, 33 ,36).

Los análisis de bioinformática basados en los datos disponibles de la secuenciación del genoma de T. cruzi y los ensayos de hibridización del DNA total del parásito con sondas específicas homólogas a regiones conservadas en genes de ODC o ADC de muchos organismos indicaron que el genoma de cepas salvajes deT. cruzi no contiene secuencias de nucleótidos relacionadas a las presentes en los genes de ODC y ADC (33,36).

Transformación de Trypanosoma cruzi con genes exógenos de ODC y ADC

 Dado que el Trypanosoma cruzi se comporta como una mutante de deleción natural de los genes de ODC y ADC, hemos transformado parásitos salvajes con plásmidos recombinantes que contienen la región codificante completa del gen de ODC de Crithidia fasciculata o de ADC de avena. Para ambas construcciones se usó el vector de expresión pRIBOTEX, específico para transformaciones de T. cruzi, y las regiones polinucleotídicas correspondientes a los genes de ODC o ADC obtenidas por amplificación PCR con los templados de DNA y los “primers” adecuados (Figura  6).

Figura 6  Plásmido p-ODC7

Los parásitos transfectados con el gen exógeno de ODC mostraron altos niveles de actividad enzimática. Al mismo tiempo se volvieron autótrofos para putrescina ya que podían proliferar continuamente en medios de cultivo sintéticos sin necesidad del agregado de poliaminas. Asimismo se pudo observar que los T. cruzi transformados que expresaban ODC se volvían sensibles a la droga DFMO que entonces podía bloquear la proliferación de estos parásitos cultivados en medios sintéticos (Figura  7). Pero después de un período de inhibición del crecimiento de varias semanas y en presencia continua de DFMO a altas concentraciones se producía la reiniciación espontánea del crecimiento de los T. cruzi transformados que se habían vuelto resistentes a la droga (Figura  8).

días

días

        Crecimiento en medio sintético                        Respuesta a la presencia de DFMO

                 Figura 7                                                              Figura 8

Se pudo determinar que la resistencia al DFMO no se debía a la aparición de impermeabilidad a la droga ni a ninguna mutación de la enzima blanco (ODC) que pudiera disminuir su afinidad por el inhibidor, sino a la amplificación del gen de ODC en los parásitos resistentes. Esta conclusión está apoyada por análisis de hibridización Southern con sondas específicas para ODC en DNA de parásitos sensibles (Tul 7) y resistentes (Tul 7R) a DFMO (Figura 9A). Estos últimos también contienen una actividad aumentada de la enzima ODC (Figura  9B).

             Figura 9A                                                                Figura 9B

 Hibridización con sonda específica                                     Actividad enzimática

                                                       

Al transfectar T. cruzi con un plásmido recombinante que contiene el gen de ADC de avena, se observó actividad enzimática a los pocos días de la transformación y los valores fueron decreciendo en las semanas siguientes. Pero la presencia continuada de geneticina (antibiótico usado para seleccionar parásitos transformados) en los cultivos, provocó la reaparición de la actividad ADC que aumentó posteriormente hasta niveles elevados cuando se alcanzó la transformación estable (Figura 10).

2

0

20

40

60

0

1

2

4

6

Geneticina

2

0

20

40

60

0

1

2

4

6

              

  

Figura  10 Actividad de ADC después de electroporación.

 

Organización genómica de los parásitos transgénicos.

Con el propósito de determinar si el plásmido transformante se integra al genoma del parásito o queda libre como un episoma, realizamos ensayos de PCR con DNA obtenido de T. cruzi transgénicos cosechados a distintos tiempos después de la transformación y dos pares de “primers”: 1) T7 que es específico para la región promotora del vector pRIBOTEX junto al “primer” RIB que corresponde al locus ribosomal del genoma del parásito y 2) el mismo T7 y el “primer” 7C, que es específico para la región codificante del gen de ODC. Se puede predecir que si el plásmido recombinante queda libre, el producto de PCR con los “primers” T7 y 7C debiera ser un segmento amplificado de DNA de alrededor de 2500 pares de bases, sin ningún producto con el otro par de “primers”. En cambio después de una integración total de una copia del plásmido en el genoma del parásito, el único producto de amplificación de los dos ensayos de PCR sería un segmento de 890 pares de bases obtenido con el par de “primers” T7 y RIB. Si dos o más copias del plásmido se integraran en “tandem” al genoma se obtendrían los dos productos mencionados en los experimentos de PCR (Figura 11A y 12 A). Los ensayos descriptos sólo produjeron el segmento de 890 pares de bases con el DNA de parásitos obtenidos después de la transformación estable (Figura  11B). Estos resultados indican la integración de una copia del plásmido en el genoma.

Figura 11 A                                                                 Figura  11B

A Esquemas posibles de organización génica. B Productos de PCR obtenidos

El estudio por PCR de la organización genómica de los parásitos transfectados con el gen exógeno de ADC mostró una estricta  correlación con la expresión del gen indicada en la Figura 10. Los resultados señalaron que durante los primeros días después de la transfección el plásmido recombinante queda como episoma libre, porque el único producto originado en uno de los ensayos de amplificación con dos pares de “primers” similares a los descriptos anteriormente fue un segmento de 2030 pares de bases, generado cuando se usó el par de “primers” T7 y ADC2 (correspondiente a una secuencia interna del gen de ADC) (Figura 12B calles 1 y 2). En el período siguiente de 2 a 3 semanas después de la transformación posiblemente ocurre la degradación del plásmido recombinante hasta niveles casi no detectables (calles 3 y 4 de Figura 12B). Luego, durante la presión selectiva del antibiótico, se induce la integración de dos o más copias del plásmido transformante hasta alcanzar una estructura estable entre 6 a 8 semanas después de la transfección, como lo demuestra la producción de los dos segmentos de amplificación en los experimentos de PCR con los distintos pares de “primers” (calles 7 y 8  de Figura 12B) (36).

                                    A                                                                                            B

p-ADC

ADC

ADC probe

ADC

ADC

ADC

Integration

Ribosomal locus

p-ADC

8

p-ADC

8

Amp

Amp

CHROM.

rDNA

rDNA

Neo

Neo

Neo

CHROM.

8

Amp

Nhe

I

Nhe

I

Nhe

I

Nhe

I

Nhe

I

Nhe

I

Nhe

I

Sal

I

Sal

I

Sal

I

Sal

I

Sal

I

Sal

I

Sal

I

Sal

I

CHROM

CHROM.

CHROM.

Amp

pADC

8

Neo

2d

2w

4w

6w

1

2

3

4

5

6

7

8

           Figura 12A Esquemas posibles de organización génica. B Productos de PCR.

          

El gen heterólogo de ADC introducido en el plásmido recombinante se encuentra bajo el control del promotor ribosomal. Por esta razón la enzima responsable de la transcripción del gen resultó ser la RNA polimerasa I (que también sintetiza el RNA ribosomal) y no RNA polimerasa II que transcribe la mayoría de los genes que codifican proteínas. Estas conclusiones se basan en la sensibilidad a alfa-amanitina de la transcripción del gen de ADC (Figura 13).

Figura 13: Sensibilidad a alfa-amanitina de la transcripción de ADC y cruzipaína