CURSO DE BIOLOGÍA

OTRAS CARACTERÍSTICAS DE LA REPLICACION. 

            Una vez demostrado el carácter semiconservativo de la replicación del DNA se plantearon nuevos interrogantes acerca de algunos aspectos del proceso. En primer lugar cabe preguntarse si en la replicación de una gran molécula de DNA ¿se desenrollan y separan primero las dos cadenas polinucleotídicas en toda su longitud para luego servir cada una de ellas como molde para la síntesis de su complementaria?, o bien ¿los procesos de separación de las cadenas y la síntesis de sus complementarias están de alguna manera acopladas en el espacio y en el tiempo?

            Los estudios realizados por John Cairns y otros investigadores en la década de los años 60 demostraron que la replicación del DNA es ordenada y secuencial, es decir, se inicia en unos puntos fijos del cromosoma, y el crecimiento de las nuevas cadenas de DNA se produce de manera simultánea al desenrollamiento de la doble hélice original.

            Para elucidar este y otros aspectos de la replicación del DNA, Cairns utilizó una técnica basada en isótopos radiactivos denominada autorradiografía. En un cultivo de E. coli  introdujo en el medio de cultivo timina tritiada (timina en la que los átomos de hidrógeno habían sido sustituidos por su isótopo radiactivo ³H),  de manera que esta base nitrogenada se incorporaba a las cadenas de DNA en crecimiento. Transcurridas dos generaciones procedió a la extracción del DNA bacteriano mediante una técnica que respetaba la integridad de las moléculas extraídas (lisis de la pared celular con enzimas específicos) y permitió que estas moléculas sedimentasen lentamente sobre un papel de filtro que después fue cuidadosamente montado sobre una placa con emulsión fotosensible. La placa se guardó en la oscuridad durante dos meses y a continuación se procedió a su revelado. Las emisiones β de los átomos de tritio incorporados al DNA en los restos de timina habían impresionado la placa fotográfica creando unas figuras que se correspondían con cromosomas bacterianos en distintos estadios de replicación (Figura 19.20). El análisis de estas imágenes, además de proporcionar la primera prueba directa del carácter circular del cromosoma bacteriano, condujo a la conclusión de que la replicación comienza en un único origen, en el que se forma una única “burbuja de replicación” que va creciendo a medida que el proceso avanza.

            Posteriores refinamientos de la técnica de autorradiografía, consistentes en el uso de “pulsos” de timina tritiada de pocos segundos de duración, permitieron obtener imágenes de las zonas del cromosoma en las que está teniendo lugar la replicación del DNA en un instante dado. El análisis de estas imágenes reveló que el proceso de replicación es bidireccional: dos horquillas de replicación avanzan simultáneamente en direcciones opuestas partiendo de un único origen.

            Años más tarde, usando las mismas técnicas, se pudo comprobar que en los cromosomas eucariotas la replicación se atiene a los mismos principios que en los procariotas, con la excepción de que en aquéllos existen varios orígenes de replicación que dan lugar a varios ojos de replicación por cromosoma. Estos ojos de replicación crecen de manera bidireccional hasta que se funden con sus vecinos completando el proceso.

4.3.-    SÍNTESIS ENZIMÁTICA DEL DNA.

            El proceso de replicación del DNA implica la adición de nucleótidos a una cadena polinucleotídica en crecimiento complementaria de la que le sirve como molde. Los sucesivos nucleótidos deben establecer enlaces fosfodiéster con los restos precedentes y la formación de estos enlaces requiere energía. Debido a ello, los nuevos nucleótidos que se incorporan al proceso no pueden ser nucleótidos monofosfato sino que las células deben recurrir a nucleótidos trifosfato, mucho más energéticos, cuya escisión pirofosforolítica proporciona la energía necesaria para la formación de dichos enlaces. La incorporación de un resto nucleotídico a la cadena en crecimiento supone pues la siguiente reacción química:

DNA _(n) + dNTP  à DNA _(n+1) + PP_i

            Es conveniente resaltar que esta reacción química, como la mayoría de las que ocurren en las células vivas, es reversible, por lo que altas concentraciones de pirofosfato inorgánico podrían hacer revertir esta reacción hacia la degradación (pirofosforólisis) del DNA celular, con la consiguiente muerte de la célula. Por ello, las células vivas disponen de un enzima de gran eficacia y ubicuidad, llamado pirofosfatasa inorgánica, que degrada rápidamente el pirofosfato (PP_i) a ortofosfato (2 P_i) con el objeto de preservar la integridad de los ácidos nucleicos celulares a pesar del considerable gasto energético que esta degradación supone.

            La reacción de polimerización del DNA, como todas las reacciones químicas celulares requiere de la actuación de enzimas específicos que catalicen y controlen este proceso. A mediados de los años 50 del S.XX, en paralelo con los estudios realizados acerca del mecanismo de la replicación, el equipo Arthur Kornberg (Figura 19.21) inició sus investigaciones acerca de la síntesis enzimática del DNA en la bacteria E. coli. Pronto consiguió identificar y aislar un enzima capaz de catalizar la reacción de polimerización que fue denominado DNA polimerasa I. Estudios posteriores pusieron de manifiesto que el proceso de replicación presentaba una gran complejidad y que era necesaria la concurrencia de toda una batería de enzimas y otras proteínas no enzimátitcas para que culminase con éxito. Hoy, tras 50 años de estudios, se tiene un amplio conocimiento acerca de todo este complejo proceso y de los enzimas implicados, tanto en lo tocante a las células procariotas como, aunque en menor medida, a las eucariotas.

            A continuación se describe el equipo de enzimas y proteínas no enzimáticas implicados en la síntesis del DNA con sus características más relevantes:

• Proteínas DNA A (producto del gen del mismo nombre).- Relajan la doble hélice en la zona donde ha de iniciarse la replicación preparándola para la acción de las siguientes proteínas.
• Helicasas.- Son de varios tipos (proteínas B, C, J, K). Su actividad consiste en desenrollar las dos cadenas de la doble hélice haciéndolas girar alrededor del eje central. En el inicio del proceso dan lugar a la llamada “burbuja” u “ojal” de replicación. A partir del origen dos equipos de helicasas se desplazan en sentidos opuestos haciendo avanzar las dos horquillas de replicación.
• Proteínas SSB (single strand binding).- Moléculas que se unen en gran número a las cadenas sencillas de DNA y las estabilizan con el objeto de evitar que vuelvan a asociarse y que se cierre así la burbuja de replicación.
• Girasas y topoisomerasas.- El desenrollamiento de la doble hélice por acción de las helicasas genera tensiones en la molécula de DNA que tiende a formar “superenrollamientos” del tipo de los que aparecen en el cable de un auricular telefónico cuando inadvertidamente lo hacemos girar sobre sí mismo. Para relajar estas tensiones unos enzimas llamados topoisomerasas cortan de trecho en trecho algún enlace fosfodiéster de la cadena molde y lo vuelven a soldar después de que otras proteínas, las girasas, liberan la tensión mediante el giro del extremo que queda temporalmente libre.
• Exonucleasas.- Enzimas que escinden nucleótidos a partir del extremo de una cadena polinucleotídica. Unas actúan en dirección 5’à3’ y otras lo hacen en dirección 3’à5’. Su función es eliminar fragmentos de cadenas polinucleotídicas en algunas fases del proceso de replicación.
• DNA Polimerasas.- Enzimas que añaden nucleótidos a una cadena de DNA en crecimiento que es complementaria de otra que utilizan como molde. Existen varios tipos de DNA polimerasas que difieren en sus características y actividades. En células procariotas se han identificado 3 DNA polimerasas (I, II y III) mientras que en células eucariotas se han identificado varias (α, β, γ, δ, ε). Todas las DNA polimerasas conocidas añaden nucleótidos a una cadena que crece en dirección 5’à3 recorriendo el molde en dirección 3’à5’, es decir, catalizan la condensación del grupo 3’ OH libre del último nucleótido de la cadena con el grupo α-5’fosfato del nucleótido que se añade. Por otra parte, todas necesitan de una cadena que actúe como molde, es decir, no pueden añadir nucleótidos sin más a una cadena polinucleotídica simple. Otro rasgo importante de todas las DNA polimerasas es que todas ellas pueden prolongar una cadena polinucleotídica pero ninguna de ellas puede iniciarlas, es decir, no pueden colocar el primer nucleótido de la cadena sino que precisan de un tramo preexistente, que en lo sucesivo llamaremos primer o cebador, al que añadir nuevos nucleótidos.
• Primasas.- Enzimas capaces de sintetizar una cadena corta de RNA utilizando un molde de DNA (en realidad son RNA polimerasas-DNA dirigidas). A diferencia de las DNA polimerasas, las  primasas sí pueden iniciar cadenas. Son las encargadas de crear los cebadores de RNA sobre los que después han de actuar las DNA polimerasas.
• DNA Ligasas.- Enzimas que establecen puentes fosfodiéster entre nucleótidos adyacentes que se encuentran en fragmentos diferentes de cadena  polinucleotídica. Son necesarias en distintos momentos del proceso replicativo para “soldar” los fragmentos sueltos.

            Además de los descritos existen algunos enzimas mixtos, que en una sola molécula presentan más de una actividad. Por ejemplo, las DNA polimerasas presentan en general actividad de exonucleasa en una o en ambas direcciones de la cadena.

            A continuación analizaremos el proceso de replicación del DNA deteniéndonos en el papel que desempeña cada uno de los distintos tipos de enzimas y proteínas no enzimáticas implicadas y en la secuencia temporal de su actuación. Por ser el más estudiado, adoptaremos como modelo el proceso de replicación en la bacteria E. coli, que con muy pequeñas modificaciones es extensible a todas las células procariotas. Seguidamente se analizarán algunas particularidades que presenta el proceso replicativo en las células eucariotas. Distinguiremos en el proceso tres fases: iniciación, elongación y terminación.

FASE DE INICIACIÓN.

            La replicación del DNA se inicia en un lugar concreto del cromosoma denominado origen de replicación. Existe un único origen por cromosoma en todas las especies bacterianas conocidas. El origen de replicación consiste en un tramo de 245 pares de base de longitud, conocido como oriC, que contiene varias repeticiones en serie de secuencias específicas de nucleótidos que han podido ser identificadas. Estas secuencias son ricas en pares A-T, lo que facilita la apertura de la doble hélice, y son reconocibles por proteínas específicas que se fijan a ellas.

            Un ciclo de replicación comienza cuando varias unidades monoméricas de la proteína específica DNA A se fijan sobre las correspondientes secuencias específicas repetidas de 9 pares de bases de longitud dentro del tramo oriC (Figura 19.22). A continuación se van añadiendo nuevas unidades monoméricas de DNA A que forman un complejo nucleoproteico con unas veinte de estas unidades y el tramo oriC de la doble hélice de DNA que se dispone formando un bucle alrededor de ellas. Algunos de los monómeros de DNA A quedan así situados sobre las secuencias específicas repetitivas de 13 pares de bases de longitud que se encuentran en el otro extremo de oriC, provocando en ellas una desestabilización de la doble hélice y la consiguiente apertura de la burbuja de replicación. La proteína DNA A tiene la función de reconocer el origen de replicación, provocar la apertura de la burbuja y facilitar la entrada de las demás proteínas que forman parte del complejo de iniciación.

            Una vez abierta la burbuja de replicación se introducen en ella las proteínas denominadas DNA B y DNA C. La primera de ellas tiene actividad helicasa y actúa agrandando la burbuja de replicación (dos moléculas de DNA B actúan en direcciones opuestas haciendo avanzar las recién creadas horquillas). La presencia de DNA C se requiere únicamente para que DNA B inicie su actuación, abandonando el complejo inmediatamente después. Por el contrario, la helicasa DNA B, a la que posteriormente se unen las helicasas DNA J y DNA K, permanece en su lugar y sigue actuando también durante la fase de elongación.

            A medida que la burbuja de replicación se va haciendo mayor van quedando expuestos tramos cada vez mayores de DNA de cadena sencilla. A estos tramos se unen las proteínas SSB con el objeto de protegerlos del ataque de nucleasas que podrían degradarlos y de evitar que se reconstruya la doble hélice cerrándose con ello la propia burbuja de replicación.

            Dado que no existe ninguna DNA polimerasa capaz de iniciar cadenas polinucleotídicas se hace necesaria ahora la concurrencia de una primasa (proteína DNA G) que inicia una cadena corta de RNA (unos 12 nucleótidos de longitud) que actuará como cebador al  que la DNA polimerasa podrá añadir nucleótidos en la fase de elongación (Figura 19.25). La primasa DNA G junto con la helicasa DNA B forman una unidad funcional denominada primosoma cuya integridad es necesaria para que la iniciación tenga lugar.

FASE DE ELONGACIÓN.

            La fase de elongación comienza con la progresión en ambas direcciones de las horquillas de replicación mediante la acción de las helicasas, que van desenrollando la doble hélice. La acción combinada de girasa y topoisomerasa en ambas horquillas va relajando las tensiones asociadas al superenrollamiento. Mientras tanto, las proteínas SSBvan estabilizando los tramos de cadena sencilla que quedan temporalmente expuestos. Todas estas actuaciones se prolongan durante toda la fase de elongación.

            Es ahora cuando se pone de manifiesto un problema técnico que afecta a todo el proceso de replicación y que las células vivas, en el transcurso de su evolución, se han visto obligadas a solucionar. Dado que las dos cadenas polinucleotídicas de una doble hélice son antiparalelas, cuando una horquilla de replicación avanza, lo hace en la dirección 5’à3’ para una de las cadenas y en dirección 3’à5’ para la otra. Por otra parte, se ha comentado ya que todas las DNA polimerasas conocidas añaden nucleótidos a una cadena que crece en dirección 5’à3’ mientras que recorren el molde en la dirección opuesta. Por todo ello, la síntesis de DNA sólo puede acompañar al avance de una horquilla de replicación en una de las cadenas (la que la DNA polimerasa recorre como molde en dirección 3’à5’). ¿Qué ocurre entonces con la otra cadena? El investigador japonés R. Okazaki (Figura 19.23) demostró en 1968, utilizando el marcaje radiactivo con timina tritiada, que la síntesis en esta otra cadena es discontinua: las DNA polimerasas incorporan nuevos nucleótidos en dirección contraria a la de avance de la horquilla generando unos fragmentos de DNA de 1.000 a 2.000 nucleótidos de longitud, denominados fragmentos de Okazaki(Figura 19.24). La cadena en la que la  síntesis es continua se denomina hebra conductora (leader strand) y aquella en la que la síntesis es discontinua se denomina hebra rezagada (lagging strand). Como resulta evidente, el inicio de cada fragmento debe aguardar a que la horquilla avance la longitud correspondiente para luego ir creciendo en dirección contraria a dicho avance. Okazaki y sus colaboradores demostraron en 1972 que cada fragmento recién formado lleva unido su correspondiente cebador que deberá ser después eliminado.

	DNA pol I	DNA pol II	DNA pol III
Actividad polimerasa	SI	SI	SI
Actividad Exonucleasa 3’→5’	SI	SI	NO
Actividad Exonucleasa 5’→3’	SI	NO	NO
Función biológica	Replicación DNA Eliminación cebadores	Reparación DNA	Replicación DNA
Tabla 19.1

            En E. coli se han descubierto tres DNA polimerasas diferentes que poseen distintas combinaciones de actividad polimerasa y exonucleasa (Tabla 19.1). La actividad exonucleasa 3’à5’ tiene una función correctora: cuando se introduce un nucleótido incorrecto esta actividad lo elimina y el enzima se desplaza un lugar hacia atrás para introducir el correcto. Se ha podido comprobar que entre estos enzimas es la DNA polimerasa III la responsable principal del proceso replicativo, aunque la DNA polimerasa Itambién desempeña una importante función en el mismo. La DNA polimerasa II tiene una actividad relacionada con la reparación del DNA más que con la replicación.

           

     Una vez colocados los dos primeros cebadores por la primasa, la DNA polimerasa III comienza a añadirles nucleótidos en dirección 5’à3’ iniciando así las hebras conductoras de ambas horquillas de replicación. Nos referiremos en lo sucesivo a lo que ocurre en una de estas horquillas, considerando que los procesos que ocurren en la otra son análogos. Cuando la hebra conductora ha avanzado entre 1.000 y 2.000 nucleótidos la primasa coloca el cebador del primer fragmento de Okazaki, que a continuación es prolongado por la DNA polimerasa III hasta que se encuentra con el cebador de la hebra conductora de la otra horquilla de replicación y ahí se desprende. Este proceso se repite cuantas veces sea necesario, a medida que el equipo de helicasas, girasa y topoisomerasa va abriendo la doble hélice, hasta completar la replicación del cromosoma. Un fragmento de Okazaki es colocado en la hebra rezagada en cada ciclo mientras que la hebra conductora se sintetiza sin interrupción; cada fragmento finaliza cuando la DNA polimerasa III se encuentra con el cebador del fragmento precedente, momento en que se disocia del DNA. En realidad la DNA polimerasa III es una proteína oligomérica formada por múltiples subunidades que se coloca en la horquilla de replicación de manera que se encarga simultáneamente de la síntesis en las dos hebras merced a un complejo mecanismo que implica la formación temporal de un lazo en la hebra rezagada a medida que se va formando cada fragmento de Okazaki (Figura 19.25); este lazo desaparece cuando las subunidades del enzima responsables de la síntesis del fragmento se disocian del DNA y se vuelve a formar cuando dichas subunidades se vuelven a incorporar para sintetizar el fragmento siguiente.

           

    Del modo que se ha descrito hasta ahora, cuando las horquillas de replicación en su avance recorran todo el cromosoma bacteriano se habrá completado la replicación en las hebras conductoras mientras que las hebras rezagadas habrán quedado sembradas de fragmentos de Okazaki cada uno de ellos con su correspondiente cebador de RNA. Las tareas pendientes del equipo enzimático de la replicación consistirán ahora en eliminar los cebadores y sellar la unión de los sucesivos fragmentos de Okazaki. La eliminación de los cebadores es llevada a cabo por la DNA polimerasa I, enzima que, merced a la actividad exonucleasa 5’à3’ que lleva incorporada, puede alargar un fragmento dado y al tiempo ir degradando el cebador del fragmento precedente escindiendo uno a uno los ribonucleótidos que lo forman. Este proceso, conocido como corrimiento de mella (nick translation), sustituye el cebador por un tramo de DNA recién sintetizado de manera que la hebra rezagada consiste ahora en una sucesión de fragmentos de Okazaki formados exclusivamente por desoxirribonucleótidos (Figura 19.26). Así se eliminan todos los cebadores incluidos los de ambas hebras conductoras, que se ven afectados por la prolongación del primer fragmento de Okazaki sintetizado en las respectivas hebras rezagadas. Para completar la replicación sólo falta unir estos fragmentos y de ello se encarga un enzima específico, la DNA ligasa, que sella las uniones pendientes entre el último nucleótido de cada fragmento y el primero del siguiente, consumiendo para ello energía de la hidrólisis del ATP. Es conveniente resaltar que, si bien se han descrito como fenómenos separados en el tiempo para facilitar su comprensión, la eliminación de los cebadores y el sellado de los fragmentos de Okazaki discurren en realidad en paralelo con el avance de las horquillas de replicación.