CURSO DE BIOLOGÍA

FASE DE TERMINACIÓN.

            La RNA polimerasa reconoce determinadas secuencias de nucleótidos en el DNA, llamadas terminadores, que constituyen una señal para la interrupción de la síntesis de RNA y el desprendimiento del enzima con el consiguiente cierre de la burbuja de transcripción. En muchos casos los terminadores son secuencias palindrómicas (se leen igual en uno y otro sentido) que propician la formación de un bucle interno en el RNA. La formación de este bucle induce el desprendimiento del enzima.

            Los procesos de transcripción hasta aquí descritos son básicamente iguales en las células procariotas y eucariotas. Sin embargo, existen algunas diferencias entre ambos tipos celulares en lo que se refiere al destino inmediato de los RNAs producto de la transcripción.

            En las células procariotas los mRNA sintetizados son directamente utilizados en los ribosomas para la síntesis de proteínas sin necesidad de ninguna transformación previa. Los mRNA procariotas son policistrónicos, es decir, una sola molécula de RNA es el resultado de la transcripción de varios genes contiguos y su traducción por los ribosomas origina varias proteínas diferentes. Asimismo, las secuencias que codifican los tRNA y las que codifican los rRNA son transcritas en una sola molécula, el transcrito primario, que después es cortada por la acción de nucleasas específicas, dando lugar a las correspondientes moléculas de RNA biológicamente activas. Por otra parte, los procesos de transcripción y traducción en las células procariotas no están separados en el tiempo: la traducción comienza por el extremo 5’ antes de que la RNA polimerasa haya finalizado la síntesis del mensajero.

            En las células eucariotas los procesos de transcripción y traducción están necesariamente separados en el tiempo, ya que el primero ocurre en el núcleo y el segundo en el citoplasma celular, debiendo los RNA sintetizados atravesar los poros nucleares para incorporarse a sus respectivas misiones en la síntesis de proteínas. Los productos de la transcripción en las células eucariotas sufren una serie de complejos procesos de maduración que pasaremos a discutir a continuación.

5.3.-    GENES FRAGMENTADOS Y MADURACIÓN DEL RNA.

            Los estudios realizados acerca del mecanismo de expresión de la información genética durante las décadas de los años 60 y 70 del siglo XX indicaban que para cada gen una secuencia continua de nucleótidos del DNA codificaba la correspondiente secuencia de aminoácidos de la proteína correspondiente. En 1977 P.A. Sharp y R. J. Roberts (Figura 19.37) obtuvieron unos resultados experimentales desconcertantes que venían a poner en cuestión tales ideas. En determinadas condiciones experimentales es posible obtener híbridos estables entre mRNAs y las secuencias de DNA que los codifican. Sharp y Roberts obtuvieron este tipo de híbridos con ácidos nucleicos de un adenovirus y los observaron al microscopio electrónico, comprobando que el mRNA y el DNA codificante no hibridaban en toda su longitud, sino que aparecían lazos formados por tramos de DNA de cadena sencilla. Ello demostraba que había segmentos del DNA que no estaban representados en el correspondiente mRNA y que por lo tanto los genes del virus estaban fragmentados en tramos codificantes, a los que se denominó exones y tramos no codificantes, a los que se denominó intrones.

            En los años que siguieron se realizaron experimentos similares con otros organismos y se pudo comprobar que los genes fragmentados están ampliamente difundidos en la naturaleza. Por ejemplo, el gen que codifica la ovoalbúmina de gallina, uno de los primeros en ser analizado respecto a su fragmentación, presenta 7 intrones a lo largo de sus 7700 pares de bases, con longitudes que van desde los 251 a los 1.600 pares de bases (Figura 19.38).

            Los genes fragmentados abundan mucho más entre los organismos eucariontes que entre los procariontes. En los vertebrados la inmensa mayoría del genoma está salpicada de intrones de longitud y distribución muy variables. Sólo unos pocos genes de estos organismos (los que codifican proteínas histónicas) carecen de ellos. En el extremo opuesto se encuentran algunas levaduras como Saccharomyces cerevisiae en las que los intrones apenas existen. En el mundo procariota los genes fragmentados son muy escasos, estando su presencia prácticamente limitada a un grupo reducido denominado arqueobacterias. También se han detectado intrones en algunos grupos de virus.

            La correcta expresión de la información de los genes fragmentados requiere la eliminación de las secuencias no codificantes en algún momento del proceso. Esta eliminación se lleva a cabo sobre las moléculas de RNA recién sintetizadas, los transcritos primarios, en un proceso denominado corte y empalme(splicing en inglés).

            Existen varios tipos de intrones en relación con el mecanismo de corte y empalme que actúa sobre ellos. El grupo más numeroso es el que incluye a los intrones presentes en los transcritos primarios precursores de los mRNA eucariotas. En ellos el mecanismo de corte y empalme requiere la participación de unas ribonucleoproteínas con actividad enzimática de la clase denominadaribonucleoproteína nuclear pequeña (snRNP). Estas proteínas llevan incorporado como grupo prostético una molécula de RNA del tipo denominado RNA nuclear pequeño (snRNA), estando presentes en el núcleo de las células eucariotas. Varias de estas ribonucleoproteínas se agrupan para formar un complejo denominado espliceosoma, que es el encargado del proceso de corte y empalme. Losespliceosomas catalizan una reacción química consistente en el intercambio de un enlace fosfodiéster por otro con la consiguiente eliminación del intrón y el enlace de los dos exones situados a ambos lados de éste (Figura 19.40). Por medio de un apareamiento específico de bases con su componente snRNA los espliceosomas reconocen secuencias específicas del transcrito primario que señalan el comienzo y final de los distintos intrones. El corte y empalme debe realizarse con una gran precisión, ya que cualquier error, aunque sólo afecte a un único nucleótido, se traduciría en un error que afectaría a toda la cadena polipeptídica codificada.

            La maduración de los transcritos primarios precursores de los mRNAs eucariotas incluye, además de la eliminación de los intrones, otros procesos destinados a proporcionar una mayor estabilidad química a la molécula resultante y evitar que sea rápidamente degradada por las nucleasascelulares. Uno de ellos es la adición en el extremo 5’ de una “caperuza” consistente en un nucleótido cuya base nitrogenada es la 7-metil-guanina. Otro es la adición en el extremo de una cola de poli-A (una secuencia repetitiva de entre 20 y 250 nucleótidos cuya base es la adenina). El poli-A se añade a partir de una posición concreta del transcrito primario después de haber eliminado una secuencia no codificante del extremo 3’ por acción de una nucleasa (Figura 19.39). La adición la realiza un enzima denominado poliadenilato polimerasa, que no necesita molde para sintetizar el poliadenilato.

            Existen, además del tipo descrito, otros tres tipos de intrones presentes en moléculas derRNA, tRNA y precursores de mensajeros de mitocondrias y cloroplastos que no necesitan de la concurrencia de ribonucleoproteínas específicas para ser eliminados. Los intentos de identificar los enzimas responsables del proceso de corte y empalme en estos intrones produjeron resultados sorprendentes cuando en 1982 T. Cech (Figura 19.41) encontró que eran las propias moléculas de RNA las que catalizaban la eliminación de sus propios intrones, en un proceso conocido comoauto-splicing. El descubrimiento de moléculas de RNA con actividad catalítica supuso un duro golpe al dogma de la naturaleza proteica de los enzimas y sirvió para alumbrar nuevos puntos de vista acerca del origen de la vida sobre la Tierra que cristalizaron en la hipótesis del “mundo de RNA”.

            Se han descrito unos cuantos casos de procesos de maduración alternativos en los que un único transcrito primario puede dar lugar a dos o más mRNA diferentes y, en consecuencia, a polipéptidos diferentes. En tales casos es el número de exones que se incorporan al mensajero y la ordenación de los mismos lo que determina qué proteína se sintetizará finalmente. Un ejemplo de ello lo constituye un transcrito primario que si se procesa en la glándula tiroides da lugar a la hormona calcitonina y si se procesa en el hipotálamo da lugar al péptido CGRP (Figura 19.42).

5.4.-    EL CÓDIGO GENÉTICO.

            Muy poco después de que Watson y Crick propusieran su modelo para la estructura del DNA, asentado ya el convencimiento de que este ácido nucleico era ciertamente la base química de la información genética, muchos investigadores comenzaron a plantearse el  problema del código genético. La nueva visión de la teoría “un gen – un enzima”, reformulada a la luz de los nuevos descubrimientos, incorporaba la idea de que la secuencia de aminoácidos del DNA contiene información que especifica la secuencia de aminoácidos de las proteínas. Debía existir, por lo tanto, una clave que relacionase ambos tipos de secuencia, un código que, a modo de diccionario, permitiese a las células vivas traducir la información escrita en el “idioma de los nucleótidos” al “idioma de los aminoácidos”.

            Las primeras formulaciones generales acerca del código genético surgieron del simposio anual de Cold Spring Harbor celebrado en el verano de 1953, al que asistieron entre otros Watson y Crick. Resultaba evidente que el código no podía consistir en una correspondencia biunívoca entre bases nitrogenadas y aminoácidos, ya que en el DNA sólo hay cuatro bases mientras que hay veinte aminoácidos en las proteínas. Las “palabras” del código debían, pues, estar formadas por grupos de “letras” representando cada una a una base nitrogenada. Un sencillo cálculo combinatorio eliminaba la posibilidad de que se tratase de grupos de dos bases, pues de este modo sólo se podrían formar 4² = 16 grupos que seguían siendo insuficientes para codificar los veinte aminoácidos. El mismo cálculo realizado para grupos de tres bases indicaba que se podrían formar 4³ = 64 grupos diferentes. Así pues, a la vista de que tres era el número mínimo de letras por palabra que permitía codificar la totalidad de los aminoácidos, se llegó a la conclusión de que el código genético constaba de tripletes de bases que especificaban los distintos aminoácidos. La posibilidad de que se tratase de grupos de cuatro o más bases se descartó pues introducía una complejidad innecesaria y ajena a la lógica molecular de las células vivas. Estas conclusiones, obtenidas sobre la base de razonamientos teóricos, fueron confirmadas experimentalmente algunos años después por Francis Crick y Sydney Brenner.

            Un primer intento de elaboración de un esquema del código genético, asumiendo que constaba de tripletes de bases nitrogenadas, fue acometido por el físico cosmólogo G. Gamow, quien propuso en 1954 que los diferentes tripletes de bases generaban en la superficie de la molécula de DNA unas cavidades en las que encajarían las cadenas laterales de los distintos aminoácidos, proporcionándoles así un molde sobre el que alinearse antes del ensamblaje. Tal esquema no parecía muy plausible y además pronto se acumularon pruebas de que el DNA no dirigía directamente el ensamblaje de los aminoácidos, sino a través de un intermediario de RNA. Gamow volvió a abordar el problema y elaboró un nuevo esquema en el que, prescindiendo del mecanismo responsable de la traducción, proponía un código que contenía tripletes sinónimos (varios tripletes codifican el mismo aminoácido) que además se encontraban solapados (cada triplete interviene en la codificación de tres aminoácidos sucesivos) (Figura 19.43). El código de Gamow presentaba la ventaja de la economía: eran necesarios menos nucleótidos para codificar el mismo número de aminoácidos que en uno con tripletes no solapados. Sin embargo, presentaba un serio inconveniente: la falta de flexibilidad. Un código con tripletes solapados conllevaría severas restricciones sobre las secuencias de aminoácidos posibles. Por ejemplo (Figura 19.43), al aminoácido codificado por el triplete AUU sólo podría seguirle uno codificado por un triplete UUX (siendo X cualquier base nitrogenada). Estudios sobre la secuencia de aminoácidos de algunas proteínas realizados por S. Brenner en 1957 pusieron de manifiesto que en la naturaleza no existían tales restricciones, por lo que el esquema de Gamow hubo de ser definitivamente descartado.

            Un esquema alternativo para el código genético fue propuesto por F. Crick y sus colaboradores. Se trataba de un código sin solapamientos (cada triplete estaba implicado en la codificación de un solo aminoácido) y que proporcionaba una solución brillante al problema, no abordado por Gamow, de la necesidad e “símbolos espaciadores” entre los tripletes. Tal problema se ilustra en el siguiente ejemplo: Sea la secuencia ….UCGUGGGCAAUU…; podemos suponer que se traducirá de manera que los tripletes … UCG, UGG, GCA, AUU… codificarán unos determinados aminoácidos. Sin embargo, si la pauta de lectura de los tripletes se desplazase una sola base nitrogenada tendríamos … U, CGU, GGG, CAA, UU…., que evidentemente codificarían unos aminoácidos diferentes. ¿Cómo reconocen las células vivas cuál es la pauta de lectura “correcta”? ¿Existen símbolos espaciadores que delimitan los tripletes correctos evitando cualquier lectura alternativa? En el esquema de Crick este problema se solucionaba con un “diccionario de palabras con sentido”. Sólo un número limitado de tripletes del código codificarían aminoácidos; el resto serían tripletes “sin sentido” o no codificantes que tendrían el papel de evitar las lecturas incorrectas. En nuestro ejemplo, si UCG y UGG son codificantes, necesariamente CGU y GUG deberán ser “sin sentido”. Los cálculos de Crick demostraron que era perfectamente posible un código de estas características, en el que 20 de los tripletes codificarían a los 20 aminoácidos de las proteínas (no habría pues tripletes sinónimos) mientras que los 44 restantes serían “sin sentido”. El esquema de Crick explicaba además el sentido biológico del exceso de tripletes con respecto al de aminoácidos.

            El código propuesto por Crick, sin duda de una gran elegancia, no es el que en realidad funciona en las células vivas. El curso de la evolución biológica parece haber optado por un esquema menos sofisticado y quizás más imperfecto. Las investigaciones que en los años 60 del siglo XX condujeron al descifrado del código revelaron también que el “diccionario de palabras sin sentido” no era necesario; los tripletes se leen simplemente de corrido, sin símbolos espaciadores, a partir de un triplete concreto que funciona como “símbolo de iniciación”. Hay además muchos tripletes sinónimos (que codifican el mismo aminoácido).

            En efecto, el definitivo conocimiento de las características del código genético hubo de esperar a que se pudiese descifrar uno a uno el significado de cada uno de los 64 tripletes que lo integran. Esta investigación, que constituye una de las etapas más apasionantes de la biología molecular, se realizó en los primeros años 60 por tres grupos de investigación dirigidos por S. Ochoa, M. W. Nirenberg y H. G. Khorana (Figura 19.44).

            En 1955 S. Ochoa y M. Grunberg-Manago habían descubierto un enzima, la polinucleótido fosforilasa, capaz de sintetizar RNA in vitro a partir de mezclas de ribonucleótidos difosfato sin necesidad de ningún tipo de molde según la reacción:

RNA _(n) + NDP  à RNA _(n+1) + P_i

            El enzima polimerizaba ribonucleótidos en secuencias al azar que dependían de la composición nucleotídica de la mezcla de reacción inicial. Es probable que la función biológica de este enzima esté relacionada más con la degradación del RNA a través de la reacción inversa que con su síntesis; sin embargo, la importancia de este descubrimiento residía en que la polinucleótido fosforilasa proporcionaba la posibilidad de obtener in vitro RNA mensajeros cuyas secuencias podían ser al menos parcialmente controladas.

            Marshall Nirenberg consiguió en 1961 desarrollar sistemas libres de células que realizaban la síntesis de proteínas in vitro. En estos sistemas introdujo mRNA sintetizado por la polinucleótido fosforilasa y, una vez traducidos estos mensajeros artificiales, procedió a secuenciar los polipéptidos obtenidos. El primer ensayo consistió en añadir al sistema de traducción un mensajero constituido exclusivamente por nucleótidos de uracilo (poli-U). El resultado fue un polipéptido monótono del aminoácido fenilalanina. Evidentemente este aminoácido estaba codificado por el triplete UUU, que se convirtió así en la primera “palabra” del código en ser descifrada. Ensayos análogos permitieron descifrar el significado de los tripletes AAA (lisina), GGG (glicina) y CCC (prolina).

            La siguiente etapa en el descifrado del código pasó por la obtención de mensajeros artificiales a partir de mezclas de dos ribonucleótidos. Por ejemplo, un mensajero sintetizado al azar a partir de nucleótidos de uracilo y citosina contendrá los tripletes UUU, UUC, UCC, UCU, CUU, CCU y CCC. El análisis de la secuencia de los polipéptidos obtenidos proporcionaba los primeros indicios de cuáles eran los aminoácidos codificados. A continuación, haciendo variar las proporciones entre los dos nucleótidos de la mezcla inicial y combinando la información procedente de ensayos con parejas de nucleótidos diferentes, se iba afinando el análisis hasta determinar qué triplete codificaba cada aminoácido. El procedimiento era extremadamente laborioso,  y, además, la existencia de tripletes sinónimos daba lugar a algunas ambigüedades que el método empleado no permitía resolver. Sin embargo, la colaboración entre los equipos de Nirenberg y Ochoa permitió, en poco más de un año, conocer el significado de un buen número de tripletes.

            El descifrado de las últimas “palabras” del código resultó  especialmente complejo. Khorana consiguió fabricar mensajeros con dos nucleótidos que se alternaban y más tarde  con tripletes de secuencia conocida que se repetían, lo que proporcionó bastantes claves adicionales. Los esfuerzos culminaron con el descubrimiento por Nirenberg de que trinucleótidos sintéticos de secuencia conocida podían entrar en el ribosoma, haciendo el papel del mensajero, y fijar selectivamente al tRNA correspondiente unido a su aminoácido específico. Ello permitió descifrar los tripletes restantes y completar el “diccionario” del código (Figura 19.45). Por convenio, el código genético se expresa en forma de tripletes del mRNA leídos en dirección 5’à3’.

            Las investigaciones que se han descrito fueron realizadas en la bacteria E. coli. Toda la experimentación posterior sustenta la idea de que el código genético es universal: los tripletes del código tienen el mismo significado en todas las células vivas tanto procariotas como eucariotas. Incluso se ha podido comprobar que sistemas de traducción in vitro obtenidos de una determinada especie son capaces de traducir mensajeros procedentes de especies diferentes. De todos modos, se han descrito algunas excepciones a la regla de universalidad del código, excepciones que afectan al significado de unos pocos tripletes en los genes de mitocondrias y cloroplastos.

            Del conocimiento detallado del código se pudieron extraer como corolario algunas de sus características, lo que permitió corregir los modelos teóricos previamente elaborados por Crick:

            El código genético:

• No presenta solapamientos: cada triplete de bases está implicado en la codificación de un solo aminoácido.

• Presenta tripletes sinónimos. Se suele aludir a esta propiedad diciendo que es un código degenerado.
• Es un código “sin comas”: no presenta símbolos espaciadores. La lectura se realiza de corrido partiendo de un triplete de iniciación, que en la mayor parte de los casos es AUG. Este triplete codifica además el aminoácido metionina o alguno de sus derivados.
• Es universal, aunque presenta un reducido número de excepciones, que afectan a la codificación de determinados tripletes en las mitocondrias.

5.5.-    TRADUCCIÓN.

             Como se ha comentado con anterioridad, el “dogma central” de la biología molecular afirma que la expresión génica es un proceso en dos etapas: transcripción y traducción. Analizado el primero de estos procesos y los pormenores del código que permite llevar a cabo el segundo, deberemos ahora analizar éste último detalladamente.

            La primera cuestión que cabe plantearse acerca de la síntesis de las proteínas es el orden de ensamblaje de los aminoácidos. El procedimiento más sencillo para ensamblar un cierto número de aminoácidos consistiría en iniciar la cadena por uno de sus extremos e ir añadiendo aminoácidos secuencialmente hasta el extremo opuesto. Se ha podido comprobar, mediante experimentos con aminoácidos marcados radiactivamente, que la síntesis comienza por el extremo amino-terminal y finaliza por el extremo carboxi-terminal.

            En segundo lugar cabe preguntarse acerca del tipo de interacción que se ha de establecer entre los ribosomas y elmRNA a la hora de llevar a cabo la síntesis. Dado que el ensamblaje de los aminoácidos es secuencial, no hay necesidad de que toda la cadena polinucleotídica del mensajero esté en contacto con el ribosoma en un momento dado, sino sólo la parte que codifica el aminoácido que se va a incorporar; es decir, el mensajero puede correr a través del ribosoma  y ser leída su información de manera similar a una cinta magnetofónica que discurre por un cabezal de lectura. Por otra parte, no parece haber inconveniente para que el mensajero discurra simultáneamente a través de varios ribosomas que, concomitantemente, irían sintetizando varias cadenas polipeptídicas. Los primeros experimentos realizados acerca de la síntesis de proteínas confirmaron la corrección de estas ideas. Incluso se pudieron obtener, por medio de la microscopía electrónica, imágenes de grupos de ribosomas, los polirribosomas, unidos por una única molécula de mRNA que estaba siendo traducida por ellos.

            Aclaradas estas cuestiones iniciales, quedaba por resolver el auténtico núcleo del problema, a saber, ¿qué mecanismo molecular es el responsable de que el ensamblaje de los aminoácidos se lleve a cabo en el orden dictado por los tripletes del mRNA?

            Ya en 1958, antes por tanto de que se reconociese el papel del mRNA en el proceso, Francis Crick formuló algunas ideas acerca del mecanismo de la traducción que resultaron capitales para el desarrollo de la investigación posterior. En primer lugar, Crick rechazó, por considerarla poco plausible en términos físico-químicos, la idea de que la molécula patrón de RNA presentase unas cavidades en las que pudieran encajar las cadenas laterales de los distintos aminoácidos. Por el contrario, argumentó que la capacidad del RNA para servir como patrón debía residir en su capacidad para formar puentes de hidrógeno y que, por ello, debía existir una molécula adaptadora capaz de formar puentes de hidrógeno específicos con el RNA patrón, siendo esta molécula la encargada de llevar a los distintos aminoácidos a su posición correcta dentro de la cadena. Aún desconociendo la naturaleza de tal molécula adaptadora Crick pronosticó que debería contener nucleótidos e incluso aventuró que podría ser necesaria una serie de enzimas específicos que unirían cada aminoácido con su adaptador correspondiente. Una vez asumido que el código genético constaba de tripletes (o codones) de nucleótidos del mRNA, la hipótesis de Crick se complementó con la idea de que las moléculas adaptadoras debían presentar tripletes complementarios (anticodones) a través de los cuales interactuarían con el mRNA.

            Las predicciones formuladas por Crick en su “hipótesis del adaptador” se cumplieron punto por punto. La búsqueda del adaptador en extractos de E. coli condujo al hallazgo del tRNA, cuyas características se han glosado con anterioridad en este capítulo. Pronto se constató que existían tantas especies moleculares de tRNA como tripletes con sentido integran el código genético y que una serie de enzimas, denominadas aminoacil-tRNA sintetasas, catalizan la unión específica de cada aminoácido con su molécula de tRNA. El papel de estos enzimas en el proceso de expresión génica es de especial importancia ya que constituyen el agente que “conoce” el código genético (el intérprete que domina el idioma de los nucleótidos y el de los aminoácidos). Hay que resaltar, sin embargo, que las propiedades de las aminoacil-tRNA sintetasas, como las de las demás enzimas, residen en su propia secuencia de aminoácidos, que en última instancia está también cifrada en el DNA, siendo este ácido nucleico el depositario último de la “esencia” del código.

            En la actualidad se tiene un amplio conocimiento acerca del proceso de ensamblaje de los aminoácidos que integran una cadena polipeptídica, aunque en sus aspectos esenciales había sido ya elucidado alrededor de 1964. La secuencia de acontecimientos implicados es de una complejidad considerable y en ella participan agentes de naturaleza muy diversa, a saber, RNA mensajero, ribosomas, tRNAs, aminoácidos, moléculas energéticas, enzimas y una serie de factores de naturaleza proteica que intervienen en diferentes momentos. Distinguiremos en este proceso las siguientes fases: activación de los aminoácidos, iniciación de la cadena polipeptídica, elongación y terminación.

ACTIVACIÓN DE LOS AMINOÁCIDOS.

 

            La activación de los aminoácidos consiste en su acoplamiento con su tRNA específico mediante una reacción catalizada por la correspondiente aminoacil-tRNA sintetasa. La unión se produce entre el grupo carboxilo del aminoácido y el grupo hidroxilo 3’ del nucleótido de adenina que se encuentra en el extremo 3’ del tRNA (Figura 19.46). La reacción requiere energía que es aportada por una molécula de ATP con liberación de un grupo pirofosfato.

INICIACIÓN DE LA CADENA POLIPEPTÍDICA.

            La traducción de la secuencia de nucleótidos del mRNA a la correspondiente secuencia de aminoácidos comienza en el triplete de bases AUG, llamado codón de iniciación, que al mismo tiempo codifica el aminoácido metionina. En las células procariotas existen dos tRNA diferentes que se unen a este aminoácido, uno de ellos es el que interviene en la iniciación y en lugar de metionina transporta su derivado formil-metionina, el otro transporta metionina e interviene cuando este aminoácido se ha de incorporar en cualquier posición de la cadena polipetídica distinta de la inicial. Por el contrario, en las células eucariotas se incorpora metionina en ambos casos. Así pues, la síntesis de cualquier cadena polipeptídica empieza siempre por  la metionina o por su derivado formilado, aunque en muchos casos estos aminoácidos son eliminados de la cadena en el llamado procesamiento post-traducción.

            Puesto que es posible que en un mRNA haya más de un triplete AUG cabe preguntarse acerca del mecanismo que garantiza que la lectura comience en el triplete correcto. Se ha comprobado que en las células procariotas el mRNA presenta, entre el extremo 5’ y el primer triplete AUG, unas secuencias de bases que se aparean con otras complementarias de extremo 3’ de una molécula de rRNA que forma parte de la subunidad pequeña del ribosoma (Figura 19.47). Tales secuencias, denominadas “secuencias Shine-Dalgarno” aparecen conservadas en diferentes especies bacterianas y en bacteriófagos y su papel parece ser el de fijar al ribosoma en una posición próxima al triplete de iniciación antes de comenzar la lectura. En células eucariotas no se han detectado secuencias análogas y en ellas la traducción comienza simplemente en el triplete AUG más próximo al extremo 5’ del mensajero.

            En la fase de iniciación se suceden los siguientes acontecimientos (Figura 19.48):

• El mRNA se une a la subunidad pequeña del ribosoma con la intervención del factor IF3.
• El tRNA iniciador previamente unido a su aminoácido específico (metionina o su derivado formilado) junto con el factor IF2 y una molécula de GTP se colocan de manera que el anticodón  UAC del tRNA se aparea con el codón de iniciación del mensajero (AUG). El conjunto formado se denomina complejo de iniciación.

• La subunidad mayor del ribosoma se une al complejo de iniciación. Se produce la hidrólisis del GTP a GDP + P_i y se liberan los factores de iniciación IF2 e IF3.

           En el seno de la subunidad mayor del ribosoma se distinguen dos espacios destinados a acoger moléculas de tRNA: la sede P (peptidil) y la sede A (aminoacil). El tRNA de iniciación unido a formil-metionina queda situado en la sede P. Es posible que la formilación del grupo amino de la metionina tenga la misión de facilitar la entrada del tRNA de iniciación en la sede P “simulando” un enlace peptídico inexistente, pues en las sucesivas etapas de la traducción esta sede estará siempre ocupada por un tRNA unido a un péptido y no a un aminoácido.

ELONGACIÓN DE LA CADENA POLIPEPTÍDICA.

            En esta fase se precisa la concurrencia de varios factores proteicos de elongación (EF) y energía aportada por la hidrólisis del GTP. Se suceden los siguientes acontecimientos (Figura 19.48):

• Un aminoácido activado entra en la sede A del ribosoma de manera que el anticodón del tRNA se aparea con el correspondiente codón del mensajero. Intervienen en el proceso el GTP y dos factores de elongación.
• La formil-metionina unida al tRNA de iniciación  se libera de éste y forma enlace peptídico a través de su grupo carboxilo libre con el grupo amino del aminoácido activado entrante que se encuentra en la sede A. La transferencia es catalizada por el enzima peptidil-transferasa. De este modo queda el tRNA de iniciación libre en la sede P y el tRNA del segundo aminoácido unido a un dipéptido en la sede A.
• Se produce la traslocación del ribosoma, que se desplaza un triplete de bases del mensajero en dirección 5’à3’. Así, eltRNA unido a dipéptido queda situado en la sede P, quedando libre la sede A para la entrada de un nuevo aminoácido activado mientras que el tRNA de iniciación se libera del ribosoma. En el proceso interviene otro factor de elongación y se consume GTP.
• Los pasos descritos se repiten tantas veces como aminoácidos haya que incorporar a la cadena polipeptídica, con la única diferencia de que en cada nuevo ciclo lo que transfiere la peptidil-transferasa en el segundo paso es ya un verdadero péptido (no formil-metionina como en la primera ocasión). El péptido transferido tendrá un aminoácido más de longitud en cada ciclo.

TERMINACIÓN DE LA CADENA POLIPEPTÍDICA.

            La terminación de la cadena polipeptídica (Figura 19.48) se produce cuando el ribosoma llega a alguno de los trescodones sin sentido (UAA, UAG y UGA), que, por no corresponderse con ningún aminoácido, se interpretan como señal de “fin de síntesis”. Intervienen además varios factores proteicos de terminación (RF), los cuales, al no existir ningún tRNA que reconozca el codón de terminación, ocupan su lugar en la sede A, provocando la liberación por hidrólisis de la cadena polipeptídica finalizada, la disociación de las dos subunidades del ribosoma y la liberación del tRNA que quedaba en la sede P.

            A la cadena polipeptídica así sintetizada sólo le resta adquirir su conformación tridimensional nativa para ser una proteína plenamente funcional e incorporarse a su destino en la maquinaria celular.

5.6.-    REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN GÉNICA.

            La alta eficacia que exhiben las células vivas en la manipulación de la materia y la energía se debe, entre otras cosas, a que funcionan atendiendo a un principio de economía molecular según el cual cualquier proceso que no sea necesario en un momento dado debe ser interrumpido. En un capítulo anterior ya hemos comprobado cómo las células llevan a la práctica este principio por medio de la regulación de su metabolismo a través de la actuación de distintos tipos de enzimas reguladores. Existe, sin embargo, un nivel superior de control de la actividad celular que es el de la síntesis de los propios enzimas implicados en el metabolismo y, en general, de todas las proteínas celulares. Resultaría un despilfarro, contrario al citado principio de economía, que una célula viva estuviese sintetizando continuamente todas las proteínas codificadas en su genoma con independencia de que estas fuesen necesarias o no en cada momento. La célula debe disponer de algún mecanismo que le permita reaccionar a las condiciones cambiantes del medio en que vive modificando la expresión de su información genética de la manera más adecuada.

            Los primeros indicios de que las células controlan la síntesis de sus propios enzimas se tuvieron a comienzos del siglo XX cuando se comprobó que en las levaduras la presencia o ausencia de determinados azúcares en el medio de cultivo inducía la aparición o desaparición respectiva de los enzimas responsables de su metabolismo en el citoplasma celular. Pronto pudo comprobarse que los enzimas celulares podían dividirse en dos grandes clases: los enzimas constitutivos, presentes siempre en la célula pues son responsables de reacciones básicas que deben estar siempre en funcionamiento, y los enzimas adaptativos, que aparecen o desaparecen como respuesta a las condiciones cambiantes del medio.

            Las investigaciones acerca de los mecanismos de regulación de la expresión génica corrieron paralelas a las quecondujeron a la comprensión del propio mecanismo de la expresión y se deben en gran medida al trabajo de François Jacob y Jacques Monod (Figuras 19.39 y 19.38). Ambos científicos presentaron en 1961 un modelo, conocido como el modelo del operón, que permitía comprender dichos mecanismos reguladores. El modelo fue elaborado sobre la base del análisis de un sistema enzimático inducible, presente en la bacteria E. coli, del que forman parte los enzimas responsables de metabolizar el azúcar lactosa.

            Un operón está constituido por los siguientes elementos:

• Genes estructurales.- Son los genes sometidos a regulación. Codifican los polipéptidos funcionales que forman parte del sistema inducible. En general, los operones bacterianos incluyen varios genes estructurales (son policistrónicos)
• Promotor.- Es una secuencia de DNA que es reconocida por la RNA polimerasa para iniciar la transcripción. Se encuentra adyacente a los genes estructurales, que comparten un único promotor.
• Operador.- Es una secuencia de DNA situada entre el promotor y los genes estructurales. Se trata de un elemento regulador que determinará si se permite o no la transcripción de los genes estructurales.
• Gen regulador.- Es un gen que codifica una proteína, denominada represor, con capacidad de permitir o bloquear la expresión de los genes estructurales. El gen regulador se encuentra cerca de los genes estructurales pero no necesariamente contiguo a ellos.
• Represor.- Proteína codificada por el gen regulador. Interactúa de manera específica con el operador. Cuando se fija a éste bloquea la expresión de los genes estructurales impidiendo el avance de la RNA polimerasa. Cuando se disocia permite la transcripción del RNA mensajero correspondiente a los genes estructurales para su posterior traducción a polipéptidos.
• Inductor/co-represor.- Metabolito que interactúa con el represor provocando, mediante cambios  conformacionales, su disociación o su fijación aloperador según los casos. Es la sustancia sobre la que actúa el sistema enzimático inducible o bien el producto final de la actividad de éste.

            A continuación se describirán, a modo de ejemplo, los elementos que integran el operón lac, que fue el estudiado por Jacob y Monod, y los que integran el operón trp.

            El operón lac  (Figura 19.49) incluye tres genes estructurales: el gen Z, que codifica en enzima β-galactosidasa, que cataliza la hidrólisis de la lactosa a glucosa y galactosa; el gen Y, que codifica la galactósido permeasa, una proteína de membrana que facilita el acceso de la lactosa al interior celular; y el gen A, codifica la galactósido transacetilasa, enzima cuyo papel en el metabolismo de  la lactosa no está del todo aclarado. El gen regulador i codifica una proteína represora que, en ausencia de lactosa, se fija de manera específica sobre el operador bloqueando la expresión de los genes estructurales. Cuando la lactosa está presente funciona como inductor, interactuando con el represor y provocando su disociación del operador y desbloqueando así la expresión.

            Un modelo alternativo al del operón lac es el deloperón trp (Figura 19.50), integrado por un grupo de genes estructurales (genes E, D, C, B y A) que codifican los enzimas responsables de la síntesis intracelular del aminoácido triptófano. En este caso el represor libre resulta inactivo y no puede unirse al operador, quedando desbloqueada la expresión de los genes estructurales. Cuando el triptófano está presente en el medio intracelular actúa como co-represor, provocado en el represor un cambio conformacional que le permite unirse al operador y bloquear así la expresión de dichos genes.

            En general, los sistemas inducibles, como eloperón lac, son propios de las rutas catabólicas mientras que los represibles, como el operón trp, son propios de las rutas anabólicas.

            Los sistemas de control hasta aquí descritos comparten la característica de que su acción se basa en una proteína represora que bloquea la expresión génica. Se han descrito también en células procariotas sistemas de control basados en la acción de proteínas activadorasque se denominan sistemas de control positivo. Las proteínas activadoras, también llamadas CAP (proteína activadora por catabolito) se unen al DNA en un lugar adyacente al promotor, el sitio CAP, de manera que favorecen la fijación de la RNA polimerasa facilitando así el inicio de la transcripción (Figura 19.51). Para que se pueda producir la unión al DNA de la proteína CAP ésta debe interactuar, a través de un centro alostérico, con el nucleótido cAMP (AMP cíclico), presente en el citoplasma celular. Los niveles intracelulares de cAMP están a su vez modulados, de manera todavía no bien conocida, por la presencia de determinados catabolitos.

         Un caso bien conocido de control positivo por CAP afecta a varios operones relacionados con el catabolismo de azúcares distintos de la glucosa, entre ellos el operón lac. Cuando E. coli crece en un medio rico en glucosa utiliza este azúcar como fuente de energía con preferencia frente a otros azúcares aunque también estén presentes en el medio de cultivo. Para ello la célula bloquea la expresión de los genes estructurales de los operones relacionados con estos azúcares. La presencia de glucosa hace descender los niveles de cAMP haciendo que CAP no se pueda fijar al DNA, con lo que la eficacia de la transcripción disminuye en todos los operones controlados, aun en el caso de que se encuentren desbloqueados por los respectivos represores. El mecanismo descrito se conoce con el nombre de represión por catabolito. La manera en que la presencia de glucosa afecta a los niveles intracelulares de cAMP no se conoce todavía con exactitud.

            De lo dicho hasta ahora se deduce que la regulación de la expresión génica puede responder a alguno de los siguientes modelos teóricos:

• Tipo 1.- Sistema inducible con control negativo (ej. Operón lac)
• Tipo 2.- Sistema inducible con control positivo. (ej. Operones regulados por CAP)
• Tipo 3.- Sistema represible con control negativo. (ej. Operón trp)
• Tipo 4.- Sistema represible con control positivo. (No hay casos conocidos)

            La regulación de la expresión génica en células procariotas es un fenómeno complejo en el que multitud de operones se ven sometidos a sistemas de control mixto en los que intervienen más de uno de los tipos reseñados. Por ejemplo eloperón lac responde a los tipos 1 y 2.

                     Por otra parte, la regulación de la expresión génica e las células eucariotas y, más concretamente, en los eucariontes pluricelulares, es todavía, si cabe, más necesaria que en las células procariotas. En un organismo pluricelular todas las células poseen la misma información genética, pero esta información no se expresa por igual en todas ellas. La esencia de la pluricelularidad es la especialización: los distintos tipos celulares se van diferenciando a lo largo del desarrollo y adquiriendo cada uno capacidades y funciones diferentes. Esta especialización está basada en una expresión diferencial de la información genética, que se consigue mediante un sofisticado sistema de regulación.

            Los mecanismos de regulación de la expresión génica en las células eucariotas se conocen con menor detalle que los de las células procariotas. Los mRNA eucariotas son monocistrónicos, lo que lleva a la conclusión de que los genes estructurales en estas células no están integrados en operones como en el caso de las procariotas. Por el contrario, cada gen eucariota dispone de su propio sistema regulador que no comparte con otros genes. Tales sistemas se componen de unas secuencias específicas denominadas enhancers, situadas en las proximidades del gen estructural, que pueden interactuar con varias proteínas de las llamadas factores reguladores de la transcripción. El número y tipo de los factores interactuantes, así como las secuencias enhancer implicadas determinan en cada caso la intensidad con la que se llevará a cabo la transcripción.

            Sin duda es mucho lo que queda por investigar en el campo de la regulación de la expresión génica en organismos eucariontes y muchas las aplicaciones que puedan tener los conocimientos que sobre ello se vayan obteniendo.

6.-      LA MUTACIÓN A NIVEL MOLECULAR.

            Una de las implicaciones del reconocimiento del DNA como el material genético fue la comprensión del fenómeno de la mutación a nivel molecular. Asumido que la información genética se encontraba cifrada en forma de secuencia de nucleótidos se dedujo fácilmente que la mutación, al menos la mutación génica o puntual, consiste en una alteración de dicha secuencia de nucleótidos. Las mutaciones más simples son las que afectan a un único par de bases del DNA, que constituye la unidad mínima de mutación. En relación con el tipo de sustitución que afecta a un determinado par de bases se pueden distinguir dos tipos:

• Transiciones.- Cambio de una base púrica por otra del mismo tipo o de una base pirimídica por otra del mismo tipo (AT—›GC, GC—›AT, CG—›TA y TA—›CG).
• Transversiones.- Cambio de una base púrica por una pirimídica o viceversa (AT—›CG, AT—›TA, GC—›TA, GC—›CG, TA—›GC, TA—›AT, CG—›AT y CG—›GC).

            Ambos tipos de sustitución se consolidan en el siguiente ciclo replicativo cuando la base sustituida forma parte del molde y enfrenta una base diferente de la original.

            En cuanto a su efecto sobre el fenotipo se distinguen varios tipos de mutaciones, a saber:

• Mutaciones con cambio de sentido.- Implican la sustitución de un aminoácido por otro. Su efecto sobre el fenotipo es moderado cuando ambos aminoácidos tienen propiedades químicas similares (mutación conservativa o neutra), y más drástico cuando sus propiedades difieren en mayor grado (mutación no conservativa).
• Mutaciones sin sentido.- El cambio de base nitrogenada supone el cambio de un triplete que codifica un aminoácido por un triplete de fin de síntesis, lo que implica que a partir de este triplete no se insertan más aminoácidos en la cadena. El resultado, por lo general, es una proteína no funcional, por lo que este tipo de mutaciones suelen tener efectos severos sobre el fenotipo.
• Mutaciones silenciosas.- No todas las mutaciones tienen un efecto sobre el fenotipo. Por el hecho de existir en el código genético tripletes sinónimos, algunas mutaciones no suponen un cambio en la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada.

           Por otra parte, algunas mutaciones puntuales pueden consistir no en sustituciones, sino en inserciones o pérdidas (deleciones) de pares de bases individuales. Estas mutaciones suelen tener efectos drásticos pues suponen un corrimiento de la pauta de lectura que, a la hora de sintetizar la proteína codificada, afecta a todos los aminoácidos que se encuentran después de la inserción o deleción.

            En la Figura 19.53 se recogen algunas de las mutaciones génicas relacionadas con algunas enfermedades frecuentes en nuestra especie.

            Podemos considerar, desde el punto de vista de sus causas, dos tipos de mutación: la mutación espontánea, que las células sufren en condiciones naturales, sin mediar la intervención de agentes externos; y la mutación inducida por agentes físicos o químicos externos a la célula.

6.1.-    MUTACIONES ESPONTÁNEAS.

            Las mutaciones espontáneas se producen fundamentalmente a causa de errores en la replicación del DNA, aunque también pueden obedecer a lesiones de carácter fortuito en moléculas de DNA que no se están replicando.

            Los errores en la replicación pueden ocurrir mediante alguno de los dos siguientes mecanismos:

• Tautomería.- Las bases nitrogenadas presentan un tipo particular de isomería denominado tautomería. La forma tautomérica más estable (forma ceto) coexiste en equilibrio con pequeñas cantidades de la forma menos estable (forma enol). Las formas inestables de las bases tienen alterada su capacidad para formar puentes de hidrógeno y dan lugar a apareamientos erróneos (A*-C, T*-G,  G*-T y C*-A, donde el asterisco indica las formas inestables). Cuando el desplazamiento hacia la forma inestable se produce en el instante en que la base está siendo usada como molde en la replicación se produce un apareamiento erróneo que, si no es reparado, se consolida en el siguiente ciclo replicativo dando lugar a una transversión (Figura 19.54).

• Apareamiento deslizado.- En secuencias muy repetitivas es relativamente probable que se produzcan un fenómeno denominado apareamiento erróneo deslizado, consistente en que alguna base se queda sin aparear formando un pequeño lazo. Si esto ocurre en la cadena en crecimiento se produce una adición de base mientras que si ocurre en la cadena molde se produce una deleción.

            Por otra parte, las lesiones de carácter fortuito que puede sufrir el DNA suelen consistir en alteraciones químicas de las bases nitrogenadas que dan lugar a apareamientos erróneos los cuales se consolidan como mutaciones. Entre estas alteraciones cabe destacar la despurinización (pérdida de bases púricas que rompen su enlace N-glucosídico con la pentosa), la desaminación (pérdida de grupos amino afectando a la capacidad de formar puentes de hidrógeno) y daños oxidativos que resultan de la interacción de las bases con algunas sustancias como el peróxido de hidrógeno.

6.2.-    MUTACIONES INDUCIDAS.

            Existen diferentes tipos de agentes físicos y químicos con capacidad de producir mutaciones.

            Entre los agentes físicos cabe destacar las radiaciones ionizantes como los rayos X o los rayos γ, algunas radiaciones no ionizantes como lo rayos ultravioleta y las emisiones radiactivas de partículas (α, β, neutrones). En general estos agentes actúan arrancando electrones a alguno de los átomos que forman parte del DNA, que al quedar ionizado se torna mucho más reactivo ante una amplia gama de sustancias presentes en la célula. Las reacciones químicas consiguientes pueden en alteraciones o pérdidas de bases nitrogenadas o incluso en la rotura de la molécula de DNA con pérdida de una parte del cromosoma.

            Los  agentes químicos con capacidad mutagénica pueden ser de varios tipos:

• Análogos de base.- Sustancias con parecido estructural a las bases nitrogenadas que pueden sustituirlas en la replicación y dar lugar a apareamientos erróneos.
• Modificadores de las bases.- Sustancias que afectan a las bases nitrogenadas alterándolas químicamente y modificando su capacidad para formar puentes de hidrógeno.
• Agentes intercalantes.- Sustancias con estructura química planar o casi planar que se intercalan entre los pares de base durante la replicación dando lugar a adiciones o deleciones de base.

6.3.-    REPARACIÓN DE LAS MUTACIONES.

            Una parte significativa de las mutaciones que se producen en el DNA son reparadas mediante diferentes mecanismos de los que disponen las células. Durante el proceso replicativo la función correctora de las DNA polimerasas (exonucleasa 3’à5’) puede detectar y eliminar nucleótidos que hayan sido insertados de manera incorrecta. Algunas de las mutaciones no detectadas durante la replicación pueden ser detectadas más tarde y reparadas por un equipo de enzimas que incluyeendonucleasas, exonucleasas, DNA polimerasas y ligasas.