Genética

Cartografía genética

mapa citogenético o cariograma a la representación ordenada de los cromosomas de un individuo en función de su número, forma y tamaño cuando se tiñe y se examina bajo un microscopio. Dependiendo de la tinción empleada, se obtendrá un patrón de bandas claras y oscuras diferente y específico para cada par cromosómico. Esta característica permite estudiar los cromosomas de una persona en busca de alteraciones cromosómicas.

Los bandeos más comúnmente utilizados son:

1. Bandeo Q: se obtienen bandas fluorescentes brillantes al teñir con quinacrina.
2. Bandeo G: las bandas obtenidas son las contrarias al bandeo Q, es decir, donde en el Q había una banda oscura, en eL G es brillante. Se obtiene al tratar el cromosoma con tripsina y teñir posteriormente con giemsa.
3. Bandeo R: se utiliza para definir los extremos de los cromosomas, los cuales se tiñen con naranja de acridina.
4. Bandeo C: resalta las regiones centroméricas del cromosoma. Se suele utilizar la tinción con giemsa.
5. Bandeo T: se emplea para la tinción de los telómeros.

 mapas génicos consiste en determinar las posiciones relativas de los genes en un cromosoma y la distanciaentre ellos. Los mapas de genes pueden ser "mapas genéticos o de ligamiento", los cuales determinan una distancia estadística entre dos genes, o pueden ser un "mapa físico", el cual determina la distancia entre dos genes por los nucleótidos o pares de bases del ADN. Ambos son útiles y generalmente se hace primero un mapa de ligamiento y luego un mapa físico en el proceso declonado posicional o el aislamiento génico de las enfermedades humanas hereditarias.

 salto cromosómico es una metodología de clonación posicional, es decir, útil para clonar genes cuya posición en elgenoma es conocida al menos a baja resolución en cualquier tipo de mapa físico. Es de interés puesto que permite obviar secuencias deADN poco informativas o repetitivas, al tiempo que analiza marcadores muy lejanos. Esta técnica fue empleada para clonar el gen de lafibrosis quística.

El fundamento de la técnica consiste en emplear grandes fragmentos de ADN cortados mediante enzimas de restricción, fragmentos que se supone que contienen el gen de interés. Después, se ligan estos fragmentos, obteniendo estructuras circulares de ADN. Partiendo de un marcador localizado en dicho fragmento, localizado en un extremo, se corta un segmento del ADN que contenga dicho marcador y ADN contiguo en la estructura circular, pero que, anteriormente, se encontraba en el otro extremo de la secuencia lineal. Estos fragmentos son clonados en un vector fágico. Empleando una sonda complementaria al marcador inicial, se detecta qué clon contiene el fragmento de interés y se obtiene un trozo de éste, que no incorpore el marcador inicial. Este nuevo fragmento servirá de marcador para ulteriores saltos cromosómicos.

La cartografía genética es una disciplina de la genética que, mediante varias técnicas, busca asignar a los distintos genes de ungenoma su lugar físico en aquél. Existen dos variantes fundamentales de mapas: los genéticos, definidos mediante unidades defrecuencia de recombinación, y los físicos, en los que las distancias entre loci se expresan en unidades de distancia en nucleótidos.

Descubrimiento del ligamiento

Tras los estudios de genética clásica sobre la transmisión de caracteres independientes por parte de Mendel que condujeron en el siglo XIX a la formulación de sus leyes,² otros investigadores, William Bateson y R. C. Punnet, encontraron en 1911 una desviación a este tipo de herencia al estudiar la segregación de cruzamientosentre dos líneas de flores que diferían en dos caracteres dados.³ Aunque la base física de esta peculiaridad se desconocía en la época, dicha anomalía se debe a que aquellos caracteres se encontraban acoplados físicamente en el cromosoma: esto es, se encontraban ligados, a diferencia de los estudiados por Mendel, que se encontraban en cromosomas distintos. De esta manera, la tasa de recombinantes producidos tras el cruce de los parentales era menor a la esperada, debido a que, por cercanía física en la hebra de ADN, la probabilidad de que se produjese un evento de recombinación, un quiasma, era pequeña, e inversamente proporcional a la distancia entre los dos loci codificantes de esos caracteres. En cambio, en el modelo inicial de Mendel, la probabilidad de recombinación, de 0,5, expresaba la transferencia aleatoria de uno u otro alelo de cada carácter debido a la transferencia al azar hacia el gameto de uno u otro cromosoma durante la meiosis.¹

Análisis basados en la recombinación

Se define recombinación meiótica como cualquier proceso meiótico que da lugar a un genotipo haploide distinto de los dos genotipos haploides cuya fusión dieron lugar a la célula meiótica diploide. Esto es, la recombinación meiótica da lugar a recombinantes. Dicha recombinación puede proceder tanto de una segregación independiente como de una la existencia de entrecruzamientos.¹

En el caso de la segregación independiente, se observa que, al cruzar dos líneas puras, la progenie resultante es heterocigótica en su totalidad. De efectuar uncruzamiento de prueba, es decir, un cruce de la primera generación filial, la F₁ heterocigótica en este caso, con uno de los parentales, que es una línea pura, se obtiene una distribución genotípica en la cual el porcentaje de recombinantes es de la mitad de la progenie: existe un 25% de cada tipo recombinante.

En cuanto a los recombinantes obtenidos mediante entrecruzamiento, éstos se producen mediante hechos de recombinación entre cromátidas no hermanas en un lugar entre dos loci dados. Tras el entrecruzamiento, la mitad de los productos de esa meiosis son recombinantes para esos dos loci.

Técnicas

FISH

FISH metafásico: el cromosoma 2 se marca en amarillo. A la izquierda, DNA de orangután y, a la derecha, de humano. El patrón confirma que el cromosoma 2 humano deriva de la fusión de 2 cromosomas ancestrales.

La hibridación fluorescente in situ es una técnica que se basa en la unión selectiva de un polinucleótido de cadena sencilla y de secuencia dada (denominado sonda) a una o más zonas del genoma que posean secuencias complementarias, en una preparación de células o tejidos. Dicha unión se observa mediante un microscopio de fluorescencia o un microscopio confocal, puesto que la sonda está marcada mediante un fluorocromo.⁴ Dicha técnica se emplea sobre muestras histológicas en los que los ácidos nucleicos han sido fijados: por ejemplo, puede emplearse sobre células en estado metafásico (debido a un tratamiento previo concolchicina o colcemida) lo cual puede permitir asignar un marcador a un cromosoma concreto. No obstante, también es posible emplear la técnica sobre núcleos interfásicos.⁵

RFLP

Un RFLP (siglas en inglés de restriction fragment length polimorphism, es decir, «polimorfismo en la longitud del fragmento de restricción») representa un polimorfismo asociado generalmente a una mutación puntual en un punto determinado de un genoma. Se detecta mediante la digestión mediante enzimas de restricción de ADN genómico o bien de un amplicón producido mediantePCR previamente (en este último caso, se habla de CAPS o Cleaved Amplified Polymorphic Sequence, o polimorfismo de fragmento amplificado y digerido).⁶

Cartografía mediante RFLP. Se muestra un individuo homocigoto (A) y uno heterocigoto (B), así como sus respectivos Southern blots.

Una forma de detectar dicho polimorfismo es mediante Southern blot. Para ello se digiere el ADN genómico de dos individuos con una enzima y luego se hibrida la mezcla de fragmentos resultante con una sonda marcada que hibrida en la zona de la diana que muestra polimorfismo. De este modo, puede detectarse luego el tamaño de los fragmentos generados. En el gráfico se observa: un individuo A que es homocigótico para la ausencia de diana, luego muestra en el southern una única banda de 5 KB (el tamaño acotado por dos dianas de restricción para la enzima empleada); y un heterocigoto, que muestra la misma banda de 5 KB (procedente de su cromosoma homólogo "sin diana") más dos bandas (de 3 y 2 KB, pues la sonda complementa con una secuencia en ambos fragmentos, pues éstos colindaban en origen con la diana de restricción).⁷

Cartografía mediante deleciones

Esquema que muestra dos moléculas de ADN distintas correspondientes a dos mutantes distintos. El gen posee 5 partes y ambos mutantes sólo comparten el bloque B, que equivale al segmento 3.

Las deleciones son mutaciones que ocasionan la pérdida de fragmentos de ADN. Empleando cruzamientos de mutantes, las deleciones pueden permitir la topología de una determinada secuencia. En la imagen de ejemplo se observa el genotipo de dos mutantes para un gen con cinco segmentos: el mutante de arriba sólo contiene los segmentos 1, 2 y 3; y el de abajo, el 3, 4 y 5. Un mutante nuevo que produzca recombinantes con fenotipo silvestre al cruzarse con el de abajo estará mutado en un sitio en el área A. Uno que los produzca al cruzarse con el de arriba pero no con el de abajo estará mutado en la región C.¹

Este método permitió a Seymour Benzer definir la topología del gen, es decir, la forma en que están interconectadas sus partes.