Biología celular

técnicas aplicadas

 Campo oscuro

PALABRAS CLAVE: campo claro

DEFINICIÓN:

La microscopia de campo oscuro es una técnica de contraste donde solo la luz difractada desde el espécimen se usa para formar la imagen. El espécimen aparece brillante contra un fondo oscuro.

TECNOLOGÍA:

La microscopia de campo oscuro crea contraste en especimenes transparentes sin tinción como células vivas. Este depende de controlar la iluminación del espécimen para que la luz central que normalmente pasa a través y alrededor del espécimen se bloquee. En lugar de iluminar la muestra con un cono de luz completo (como en microscopia de campo claro) el condensador forma un cono hueco con luz que pasa alrededor del cono en lugar de pasar a través de este.

Esta forma de iluminación permite que solamente los rayos de luz oblicuos peguen en el espécimen la platina del microscopio y se forme la imagen con rayos de luz dispersados por la muestras y capturados por el objetivo. Cuando no hay muestra en la platina del microscopio la observación es completamente oscura.

Se debe tener cuidado al preparar especimenes ya que las características de los planos de foco superior e inferior también dispersan luz y comprometen la calidad de la imagen (por ejemplo, polvo, huellas dactilares). En general, los especimenes delgados son mejore ya que la posibilidad de difracción por artefactos se reduce.

APLICACIONES:

En microscopía de campo oscuro, el contraste se crea por un espécimen brillante sobre fondo oscuro. Esta es ideal para revelar contornos, bordes, fronteras y gradientes de índice de refracción pero no brinda mucha información sobre la estructura interna. Los objetos ideales incluyen células vivas sin tinción (donde el campo oscuro brinda información no visible con otras técnicas), aunque también se pueden observar exitosamente células fijas teñidas. Las imágenes de campo oscuro son particularmente útiles en hematología para examinar sangre fresca. Los especimenes no biológicos incluyen minerales, cristales químicos, partículas coloidales, inclusiones y porosidad en vidrio, cerámicas, y secciones delgadas de polímeros.

CONFIGURACIÓN DEL MICROSCOPIO:

Casi cualquier microscopio de campo claro se puede convertir fácilmente para usarse con iluminación de campo oscuro usando condensadores especiales de campo oscuro (seco o de inmersión en aceite).

Microscopio de campo oscuro

De manera similar a un cielo nocturno en el cual brillan las estrellas o al iluminar con una linterna un cuarto oscuro y las partículas de polvo flotantes en el aire se tornan visibles porque reflejan o difractan la luz, los especímenes observados al microscopio de campo oscuro se ven blancos y brillantes sobre un fondo oscuro (negro).

La iluminación de campo oscuro se puede realizar tanto mediante luz transmitida (trans-iluminación) como con luz incidente (epi-iluminación). En el primer caso, para lograr el efecto se requiere bloquear la parte central del rayo de luz que normalmente pasa a través y alrededor del espécimen, de tal manera que sólo sea iluminado por rayos oblicuos. La manera más fácil y económica de lograrlo consiste en colocar un filtro circular opaco (por ejemplo círculos de cartulina negra o una moneda adherida a un círculo de vidrio o plástico transparente) bajo el condensador de un microscopio compuesto ordinario. Esta maniobra funciona bien con objetivos de 10x-40x; el diámetro del circulo opaco debe ser de aproximadamente 16-18mm para un objetivo de 10x cuya apertura numérica sea de 0.25. Para un objetivo de 20x o 40x con una apertura numérica de 0.65, el diámetro del círculo opaco debe oscilar entre 20-24mm. Para la iluminación con luz incidente o iluminación oblicua se emplea un filtro en forma de luna en cuarto decreciente (en forma de C), obteniéndose una interesante imagen con relieve (15, 96) (fig. 6-2).

El método más apropiado consiste en el empleo de un condensador característico que además mejora la resolución (12, 15) (fig. 6-3). Con este dispositivo se forma un cono hueco de luz (cuyo centro es oscuro) que incide lateralmente sobre la muestra y sólo los rayos que son difractados o reflejados por las estructuras penetran en la lente objetivo y la célula aparece como un objeto luminoso sobre un fondo oscuro (21) (figs. 6-4 y 6-5). 

Figura 6-2.-Modelos de filtros de fácil realización para lograr la técnica de campo oscuro (izquierda y centro) e iluminación oblicua (derecha, en cuarto decreciente). Para campo oscuro el diámetro de la máscara negra central dependerá del objetivo que se emplee. Con objetivos de mayor aumento y apertura numérica, se requiere un disco negro de mayor diámetro. Modificado de Wim van Egmond (2002). 'Easy to make' contrast enhancement filters for the microscope dark-field, oblique and Rheinberg illumination (96).

Figura 6-3.-Configuración esquemática del principio de iluminación de campo oscuro (luz transmitida). El filtro opaco es de forma circular y forma un cono de luz vacío que incide sobre el espécimen en forma oblicua y los rayos refractados, difractados y reflejados por el espécimen penetran en el sistema óptico del microscopio para formar la imagen. Modificado de Davison M, Abramowitz M. Optical Microscopy. Olympus Microscopy Resource Center (15).

Figura 6-4.-Células epiteliales observadas en microscopio de campo oscuro.Modificada de Wegerhoff, R., Weildich O, Kassens M. (2005). Basis of light microscopy image (12).

Figura 6-5.-Micrografías de la superficie de una hoja que muestran diferencias de contraste entre los diversos tipos de iluminación. En la parte inferior se aprecia el tipo de filtro empleado, en campo claro (derecha) el haz de luz pasa sin interrupción. En campo oscuro, aún muchos detalles más pequeños son visibles. En iluminación oblicua se obtiene contraste con relieve. En campo claro el contraste es limitado. Modificado de Wim van Egmond (2002). 'Easy to make' contrast enhancement filters for the microscope dark-field, oblique and Rheinberg illumination (96).

6.1.1.-Iluminación Rheinberg

Inventada alrededor de 1895 por un microscopista inglés llamado Julius Rheinberg. Se basa en la iluminación de campo oscuro (15) y se emplea con objetivos de bajo y mediano aumento. Es una forma de coloración óptica que emplea filtros de colores para iluminar tanto el espécimen como el fondo oscuro, obteniéndose imágenes con efectos muy atractivos y espectaculares, pero con la definición y datos de la iluminación de campo oscuro. Se utiliza un filtro central rodeado de otros filtros en uno o varios colores que contrastan con él. El diámetro de la máscara central dependerá del objetivo y debe ser del mismo tamaño que para campo oscuro. La iluminación Rheinberg combina la iluminación convencional de campo claro en un color con la iluminación de campo oscuro en otro color (figs. 6-6, 6-7 y 6-8).

Figura 6-6.-Algunos ejemplos de modelos de filtros empleados para la iluminación Rheinberg que pueden ser fabricados con plástico de colores o pintados con marcadores permanentes para transparencias. Un filtro de color verde en la periferia incrementa los detalles porque el ojo humano visualiza muy bien ese color. Es importante que el filtro central sea más oscuro que el filtro periférico. Se pueden emplear los colores que se deseen. Tomado de Wim van Egmond (2002). 'Easy to make' contrast enhancement filters for the microscope dark-field, oblique and Rheinberg illumination (96).

Figura 6-7.-Micrografías de la superficie de una hoja que muestran el aspecto obtenido con la iluminación Rheinberg. En la parte inferior se aprecia el tipo de filtro empleado. Modificado de Wim van Egmond (2002). 'Easy to make' contrast enhancement filters for the microscope dark-field, oblique and Rheinberg illumination (96).

Figura 6-8.-Microfotografía de un nematodo iluminado con la técnica de Rheinberg. El parásito aparece de color azul claro sobre un fondo violáceo. Tomado de Santamaría Nino (2007) Microfotografías (97).

6.1.2.-Aplicaciones del microscopio de campo oscuro

Aplicaciones del microscopio de campo oscuro (15, 96, 97):
• Estudio de especímenes de tamaño pequeño no coloreados, tales como microorganismos acuáticos, ovocitos, células en cultivo (cuyos índices de refracción oscilan en un rango de 1.2 a 1.4 y no hay una diferencia notable con el índice de refracción de 1.3 de la solución acuosa en la cual se encuentran).

• Observación de células móviles, como el Treponema pallidum, una espiroqueta causante de la sífilis, la cual con la microscopía óptica ordinaria es muy difícil de visualizar.

• Estudio de procesos fisiológicos como mitosis y migración celular.

Microscopio de campo oscuro.

    El microscopio de campo oscuro se encuentra catalogado entre los microscopios ópticos.
Desde muchos años atrás el microscopio óptico posibilito el descubrimiento de las células y la elaboración de la teoría de que todos los seres vivos están constituidos por células (1).
    El microscopio òptico se compone de dos partes principalmente:

1. Parte Mecánica: Sirve de soporte.
2. Parte Óptica: constituida por tres sistemas de lentes.
* Condensador.
* Objetivo
* Ocular

    El condensador del microscopio óptico convencional tiene como finalidad proyectar un cono de luz sobre los elementos que están siendo analizados en el microscopio. Después de atravesar el elemento, ese haz luminoso en forma de cono penetra en el objetivo, proyectando una imagen aumentada en el plano focal del ocular ,que nuevamente la amplia  y es recibida por la retina como una imagen situada a 25 cm de la lente ocular (1).

    El microscopio de campo oscuro esta constituido por un microscopio óptico al cual se le acondiciona un condensador especial, este tiene como fin producir una disfracen de los rayos luminosos enviándolos lateralmente sobre el objeto en forma de un cono luminosos, y de esta forma tampoco penetran directamente al objetivo (2).
Existen dos clases de condensador de campo oscuro:
* Cardiode
* Paraboloide.
    Ambos son utilizados con el mismo fin, pero el cardiode tiene mayor aplicabilidad en la investigación con Treponemas (2).
    Para que el efecto de campo oscuro se logre , la apertura numérica del condensador debe ser mayor que la de el objetivo, lo cual ocurre con los objetivos de pequeño y gran aumento no así con los de inmersión los cuales deberán adicionarse de un diagrama de suspensión para la reducir la apertura numérica (2).
1.2.1. RESOLUCIÓN DE MICROSCOPIA EN CAMPO OSCURO
    Se llama poder de resolución de un sistema óptico a la capacidad de separar detalles y es expresado por el limite de resolución que es la menor distancia que existe entre dos puntos para que estos aparezcan individualizados.
Lo que determina la riqueza del detalle de la imagen provista por un sistema óptico es su limite de resolución y no su poder de aumentar el tamaño de los objetos (1).
    El limite de resolución depende de la apertura numérica (AN) del objetivo y de la longitud de onda de la luz utilizada (1).
En la microscopia de campo oscuro la AN no debe ser superior a 1.0 ya que el condensador debe tener siempre una apertura numérica superior a este valor.  El limite de resolución del objetivo esta dado por la siguiente formula: (1)
                              LR  =  k   x    Long. onda
                                                  AN
* k =  Constante ( 0.61)
* Log. onda =  0.55    Se toma la longitud de onda de la franja verde - amarilla
   por ser el ojo humano mas sensible a estos colores que a otros.
* AN = Apertura numérica no superior a 1.0
1.2.2. MÉTODOS PARA OBSERVACIÓN EN FONDO OSCURO
    Existen diferentes métodos para observar un objeto sobre un fondo oscuro , es decir, utilizando únicamente la luz difractada por él.
1.2.2.1. OBSERVACIÓN INCIDENTE O POR REFLEXIÓN
    La observación por reflexión con iluminación oblicua o anular es la mas frecuentemente utilizada con los microscopios estereoscopios o lupas binoculares. Generalmente no nos damos cuenta de que observamos en fondo oscuro cuando el material ocupa todo el campo visual (3).
1.2.2.2. OBSERVACIÓN POR TRANSMISIÓN  ( Fondo Negro Central)
    La observación por transmisión con una pantalla central necesita la utilización de un objetivo con pantalla interna de Spierer; con una pantalla anular , la de Wilska: anoptral, versión original y no la fabricada industrialmente que es un contraste de fase negativa a fuerte absorción (3).
1.2.2.3. OBSERVACIÓN POR TRANSMISIÓN  ( Fondo negro Anular)
    La observación con  iluminación anular de abertura superior a la del objetivo, es la única que, en la practica corriente , se denomina campo oscuro. Debe indicarse que difícilmente puede utilizarse objetivos de gran aumento , de apertura numérica superior a 1.0. dado que el condensador debe presentar una abertura superior a esta. Debe entonces practicarse la inmersión,  evitando las burbujas de aire (3).
1.2.2.4. OBSERVACIÓN BIRREFRINGENTE ( Polarización)
    La observación de un objeto birrefringente entre nicoles cruzados da una imagen sobre fondo negro de naturaleza muy particular (3).
1.2.2.5. OBSERVACIÓN HAZ PERPENDICULAR (Fondo Negro ultramicrosopico)
     La observación con un haz perpendicular a la dirección de la observación según Ziedentopf y Szimondy da informaciones sobre la orientación de las partículas observadas (3).
Accesorios de campo oscuro
 Usados principalmente para especimenes no coloreados que son semitransparentes o transparentes.
 

1.2.3. NATURALEZA Y ESTRUCTURA DE LA IMAGEN EN FONDO OSCURO
     Las imágenes en autentico fondo negro son remarcables por un efecto de borde ,con numerosas franjas de difracciòn muy brillantes si le objeto es refringente. Los planos ,en el centro de una estructura parecen ópticamente vacíos . es por ello que deben adoptarsen grandes precauciones en el momento de interpretar las imágenes . Dado que la imagen solo se forma con las luz difractada, siempre más débil que la luz directa deben formarsen fuentes lumìnicas muy intensas, lo que no siempre es fácil sobre todo cuando los objetos son vivos y, por consiguiente, sensibles a fuertes iluminaciones (3).
1.2.4. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA Y PROCEDIMIENTO DE LECTURA.
    El material a estudio se emulsiona sobre un porta-objetos sobre el cual se coloca una gota de solución salina, se cubre con una laminilla y se monta sobre la platina , se baja el condensador de campo oscuro y se corre con el carro de la platina la preparación de forma tal que al subir completamente el condensador la cara superior de su lente quede cubierta por su preparación solamente en su mitad posterior.(2)
    Sobre la parte descubierta del lente se coloca aceite de inmersión en cantidad adecuada; este por capilaridad se extiende entre la cara inferior del portaobjetos y la superior del lente del condensador. Se centra la preparación y se observa con objetivo de pequeño aumento colocando el foco luminoso en la mitad del campo mediante los tornillos de centraje del condensador, luego se observa el campo microscópico con el objetivo de gran aumento, esto permite conocer el estado del microscopio al observar los treponemas bucales (2).
1.2.5. VENTAJAS

* Permite ver partículas dipersas en un medio homogéneo.
* Hace posible la observación del movimiento Browniano de las partículas.
* Se puede utilizar para la observación de preparaciones sin colorear.
* Visualiza los bordes destacados delas muestras.
* Técnica valiosa para observar microorganismos de tipo Treponema pallidum, espiroquetas con diámetros superior a 0.2 um.

1.2.6. DESVENTAJAS

* Inadecuada preparación de la muestra.
* Difícil acceso al microscopio que posea el condensador especial por su alto costo.
* No deja visualizar estructuras celulares especificas, solo bordes de células o    partículas.