Fármacos de la sangre
La Quimotripsina es una enzima digestiva que puede realizar proteólisis. La quimotripsina (EC 3.4.21.1) consiste en una cadena polipeptídica de 245 residuos, con cinco enlaces disulfuro (-S-S-). Es una enzima digestiva encargada de degradar las proteínas de los alimentos en el intestino. Es un tipo de proteasa que está en una familia conocida como serina proteasas, también conocido como serina endopeptidasas. Tienen ese nombre porque el aminoácido serina se encuentra en su centro activo.
Activación de la quimotripsina
Las serina-proteasas se sintetizan en una forma inactiva, más grande, que permite que sean transportadas a su lugar de acción sin causar ningún daño a los tejidos por los que debe pasar. La quimotripsina se sintetiza por biosíntesis proteicacomo un precursor denominado quimotripsinógenoenzimáticamente inactivo. Se rompe por acción de latripsina en dos partes que permanecen unidas por un enlace S-S, y estas moléculas de quimotripsinógeno pueden activar a otras eliminando dos pequeños péptidos en una trans-proteolisis. La molécularesultante es una quimotripsina activa, una molécula tripeptídica interconectada por enlaces disulfuro.
Actividad y cinética de la quimotripsina
La quimotripsina in vivo es una enzima proteolítica que actúan en los sistemas digestivos de losmamíferos y otros organismos. Facilita la rotura de enlaces peptídicos por reacciones hidrolíticas, un proceso que a pesar de ser termodinámicamentefavorable ocurre de forma extraordinariamente lenta en ausencia de catalizadores. El principal sustrato de la quimotripsina incluye el triptófano, tirosina, fenilalanina ymetionina, que son hidrolizados en el carboxilo terminal. La quimotripsina rompe detrás de aminoácidos aromáticos. Al igual que muchas proteasas, la quimotripsina también hidroliza enlaces éster in vitro, característica que permite la utilización de sustratos análogos como el éster N-acetil-L-fenilalanina-p-nitrofenil para análisis enzimáticos.
La quimotripsina rompe los enlaces peptídicos actuando sobre el grupo carbonilo no reactivo con un potente nucleófilo, el residuo 195 de serina que se ubica en el centro activo de la enzima, que se une covalentemente al sustrato formando un intermediario enzima-sustrato.
Estos descubrimientos se basan en ensayos de inhibición y de cinéticas de los sustratos mencionados, aprovechando que en intermediario enzima-sustrato p-nitrofenolato tiene color amarillo, lo que permite medir su concentración mediante técnicas de absorbancia a 400 nm.
Se ha descubierto que la reacción de la quimotripsina con su sustrato ocurre en dos etapas, una primera fase de "ignición" al principio de la reacción y un estado estacionario posterior, siguiendo la cinética de Michaelis-Menten. La forma de actuar de la quimotripsina se explica como una hidrólisis que ocurre en dos pasos: primero se acila el sustrato para formar un intermediario enzima acilada que posteriormente pierde el grupo acil para devolver la enzima a su estado original.
 La quimotripsina bovina es una enzima con actividad proteolíticas 245 aminoácidos, que cataliza la ruptura hidrolítica de enlaces peptídicos adyacentes a residuos aminoacidicos aromáticos. Esta formada por tres cadenas polipeptídicas conectadas mediante dos puentes disulfuro intercatenarios. Este enzima se biosintetiza en forma de precursor inactivo, quimotripsinógeno , que es activado por la ruptura tríptica específica de su enlace peptídico Arg15-Ile16 , formándose la p-quimotripsina, que experimenta a continuación una autólisis (autodigestión) para eliminar específicamente dos dipéptidos, Ser14-Arg15 y Thr147-Asn148 , dando lugar a un enzima activo conocido como a-quimotripsina o quimotripsina. |
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Los aminoácidos esenciales en el proceso de catálisis son la His 57 y Ser 195, estos aminoácidos se encuentran localizados en el sitio de fijación del sustrato, junto con el Asp 102. Estos tres aminoácidos se encuentran unidos por enlaces por puentes de hidrógeno, y se conocen con el nombre de tríada catalítica .
El enzima es específico de la ruptura hidrolítica de enlaces peptídicos adyacentes a residuos aminoacídicos aromáticos (Phe, Trp o Tyr)o de grandes residuos hidrofóbicos como la metionina, que aportan el grupo carbonilo del péptido a cortar, este aminoácido encaja en una bolsa hidrofóbica en forma de rendija localizada cerca de los grupos catalíticos (aminoácidos que intervienen). La bolsa hidrofóbica está constituida por diferentes aminoácidos (Ser189, Ser190,Met192, Trp215, Gly216, Ser217,Gly226) . Una vez unido el sustrato al enzima la Ser195 ataca nucleofíllicamente el grupo carbonilo del péptido a cortar, formando un intermediario tetraédrico (catálisis covalente). El anillo imidazólico de la His57 capta el protón liberado, formando un ion imidazolio. Este proceso esta facilitado por el efecto polarizante del ion carboxilato del Asp102, que se encuentra unido por puente de hidrógeno con la His57. El poder catalítico de la quimotripsina proviene de la fijación preferente de este estado de transición. El intermediario tetraédrico se descompone dando el intermedio acil-enzima, bajo la fuerza motriz de la cesión de un protón desde el N(3) de la His57. El grupo amino saliente, la nueva porción N-terminal de la cadena polipeptídica cortada se libera del enzima y es reemplazada por agua del disolvente. El intermedio acil-enzima es extremadamente inestable a la rotura hidrolítica debido a las propiedades catalíticas del enzima. |
La quimotripsina y el quimotripsinógeno tienen los mismos restos catalíticos, la diferencia para ser una enzima activa o inactiva se debe a la ordenación tridimensional de los aminoácidos claves del centro activo. Así el residuo Ile16 N-terminal de la quimotripsina se traslada desde la superficie del quimotripsinógeno a una posición interna en laquimotripsina, en donde forma un enlace salino su grupo amino cationíco con el Asp194 favoreciendo de esta manera el proceso de catálisis.
Por otro lado, el grupo amida de la Gly193 apunta en direccione diferentes en el quimotripsinógeno y laquimotripsina, de manera que en la quimotripsina puede formar un enlace por puente de hidrógeno que favorece el proceso de catálisis y el quimotripsinógeno no . Centro activo de la quimotripsina y la tripsina
La estructura y el mecanismo de acción de la quimotripsina y la tripsina se conocen detalladamente, ambas enzimas se sintetizan en el páncreas en forma de precursores inactivos (zimógenos), denominados quimotripsinógeno y tripsinógeno, respectivamente. La activación del quimotripsinógeno tiene lugar en el intestino delgado, donde se forma la quimotripsina que funciona al igual que la tripsina, hidrolizando enlaces peptídicos de las proteínas ingeridas como parte del proceso digestivo. Dos rupturas proteolíticas irreversibles activan el zimógeno, una elimina la serina 14 y la arginina 15 del quimotripsinógeno y otra, la treonina 147 (Fig. 15.4). Esta activación en el intestino tiene la ventaja de prevenir que la enzima pueda degradar el tejido pancreático que la produce.
La quimotripsina no hidroliza todos los enlaces peptídicos, más bien es selectiva para aquellos donde participa el grupo carboxilo de fenilalanina, tirosina o triptófano (Fig. 15.5). La tripsina, por el contrario, es específica para los enlaces, donde el grupo carboxilo lo aportan la lisina o la arginina.
El mecanismo de acción de la quimotripsina fue determinado a partir de su estructura tridimensional, estudiada por cristalografía de rayos X; la enzima contiene tres cadenas polipeptídicas A, B y C con 13, 131 y 97 aminoácidos cada una, unidas por enlaces disulfuros.
En la molécula se destacan dos aspectos estructurales importantes, el centro activo y una hendidura o "bolsón", creada por las cadenas laterales de varios aminoácidos hidrofóbicos; esta hendidura hidrofóbica sirve de sitio de unión para residuos de aminoácidos específicos del sustrato. La conformación de este bolsón permite a los residuos alineados en él, participar en interacciones hidrofóbicas con las cadenas laterales de fenilalanina, tirosina y triptófano. En estas interacciones no pueden participar cadenas laterales con cargas eléctricas, ni grupos apolares peque?os.
Los residuos apolares de las proteínas globulares están escondidos hacia el interior; cuando esas proteínas están en su estado nativo, los enlaces peptídicos que unen aminoácidos apolares no son accesibles a la hidrólisis por la quimotripsina. En condiciones normales el ácido clorhídrico del estómago desnaturaliza las proteínas ingeridas, y las proteasas de este órgano degradan parcialmente las proteínas antes de quedar expuestas al pH neutro del intestino para su posterior digestión por la quimotripsina.
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Fig. 15.4. Activación del quimotripsinógeno. El páncreas segrega el quimotripsinógeno hacia el duodeno, donde ocurre su transformación en quimotripsina. Esta activación se produce por la separación de los aminoácidos que ocupan las posiciones 14, 15 y 147, de esta manera la molécula queda formada por tres cadenas polipeptídicas, unidas por puentes disulfuros.
Fig. 15.5. Especificidad de la quimotripsina. La quimotripsina tiene una acción selectiva sobre los enlaces peptídicos donde participa el grupo carboxilo de la fenilalanina a), tirosina b) y triptófano c). La estructura cíclica, presente en la cadena R de estos aminoácidos, se acomoda en un profundo "bolsón" que rodea el centro catalítico de la enzima.
La actividad catalítica de la quimotripsina depende de tres residuos de aminoácidos: histidina 57, aspártico 102 y serina 195; estos aminoácidos están distantes unos de otros en la estructura primaria de la proteína, pero en la molécula activa el plegamiento es tal que las tres cadenas laterales están muy cerca y en posición correcta para catalizar la hidrólisis del enlace peptídico en la proteína que se une a la enzima. Cuando el quimotripsinógeno se activa, la conformación del polipéptido se altera y distribuye estos tres residuos en la organización correcta.
La reacción de hidrólisis comprende varias etapas, entre estas la formación de un complejo covalente entre la enzima y el sustrato. Primero, se produce la ruptura del enlace peptídico y el grupo carboxilo se transfiere al grupo -OH de la serina 195
La tripsina es una enzima peptidasa, que rompe los enlaces peptídicos de lasproteínas mediante hidrólisis para formar péptidos de menor tamaño y aminoácidos. La tripsina es producida en el páncreas y secretada en el duodeno(parte del intestino), donde es esencial para la digestión. El pH óptimo es 8 y latemperatura óptima es 37 °C. Es una enzima específica ya que liga al péptido en las posiciones del carboxilo de residuos Arginina (Arg) o Lisina (Lys) en la cadena, ambos aminoácidos con grupos R cargados positivamente, fragmentando al péptido inicial.
La tripsina es producida por el páncreas en forma de tripsinógeno (enzima inactiva), y luego es activado en el duodeno por la enteroquinasa intestinal a tripsina (enzima activa) mediante corte proteolítico.
La tripsina fue descubierta en 1876 por el fisiólogo alemán Wilhelm Kühne mientras estudiaba el mecanismo de la digestión.
La tripsina es secretada en el páncreas, actúa en el duodeno hidrolizando péptidos en sus componentes estructurales básicos conocidos como aminoácidos (éstos péptidos a su vez son el resultado de la actividad de la enzima pepsina, que degrada proteínas en el estómago). Esto es necesario para el proceso de absorción de las proteínas presentes en la comida, ya que a pesar de que los péptidos son mucho más pequeños con respecto a las proteínas, son aún demasiado grandes para ser absorbidos por la membrana del intestino . La tripsina realiza la hidrólisis de los enlaces peptídicos. El mecanismo enzimático es igual al de las otras Serín proteasas: una tríada catalítica convierte a la serina del sitio activo en nucleofílica. Esto se logra modificando el ambiente electrostático de la serina. La reacción enzimática catalizada por las tripsinas es termodinámicamente favorable pero tiene una alta energía de activación (es cinéticamente desfavorable). Las tripsinas tienen un pH óptimo de operación de 8 y una temperatura óptima de operación de 37 °C.
El residuo de aspartato (Asp 189) localizado en la región catalítica (S1) de las tripsinas tiene la función de atraer y estabilizar lisinas y argininas (ambas cargadas positivamente) y por ello es responsable de la especificidad de la enzima. Esto significa que las tripsinas predominantemente cortan proteínas en el extremo carboxílico (ó extremo C-terminal) de sus residuos de lisinas y argininas, excepto cuando el residuo siguiente es una prolina. Las tripsinas son endopeptidasas, esto es, el corte se lleva a cabo en medio de la cadena peptídica y no en los residuos terminales de la misma.
Las tripsinas activadas a su vez activan más tripsinógeno (autocatálisis) y al resto en enzimas, de manera que sólo una pequeña cantidad de enteropeptidasa (enteroquinasa) es necesaria para comenzar la reacción. Este mecanismo de activáción es muy común entre las Serín proteasas, y sirve para prevenir la autodigestión en el páncreas.
La actividad de las tripsinas no es afectada por el inhibidor fenilalanilclorometilcetona (TPCK), quien desactiva la quimiotripsina. Esto es importante porque, en algunas aplicaciones, como en la espectrometría de masas, la especificidad del corte es importante.
La tripsina es una proteasa de serina que se encuentra en el sistema digestivo de muchos vertebrados, donde se hidroliza las proteínas. La tripsina se produce en el páncreas como el tripsinógeno proenzima inactiva. La tripsina escinde las cadenas de péptidos principalmente en el lado carboxilo de los aminoácidos lisina o arginina, excepto cuando o bien es seguido por prolina. Se utiliza para numerosos procesos biotecnológicos. El proceso se conoce comúnmente como la tripsina o la proteólisis tripsinización, y proteínas que han sido digeridos/tratado con tripsina se dice que han sido se trataron con tripsina.
Función
En el duodeno, tripsina cataliza la hidrólisis de enlaces peptídicos, romper las proteínas en péptidos más pequeños. Los productos peptídicos son entonces más hidroliza en aminoácidos a través de otras proteasas, haciéndolos disponibles para la absorción en el torrente sanguíneo. Digestión tríptica es un paso necesario en la absorción de proteínas como las proteínas son generalmente demasiado grandes para ser absorbidos a través del revestimiento del intestino delgado.
La tripsina se produce en el páncreas, en la forma de la tripsinógeno zimógeno inactivo. Cuando el páncreas es estimulada por colecistoquinina, que se secreta entonces en la primera parte del intestino delgado a través del conducto pancreático. Una vez en el intestino delgado, la enzima enteropeptidasa en tripsina activa por escisión proteolítica. Catálisis automático no sucede con tripsina desde tripsinógeno es un mal sustrato para la tripsina. Este mecanismo de activación es común para la mayoría de las proteasas de serina, y sirve para prevenir autodegradación del páncreas.
Mecanismo
El mecanismo enzimático es similar a la de otras serina proteasas. Estas enzimas contienen una tríada catalítica que consiste en histidina-57, aspartato-102, y la serina-195. Estos tres residuos forman un relé de carga que sirve para hacer que el sitio activo serina nucleofílica. Esto se logra mediante la modificación del entorno electrostático de la serina. La reacción enzimática que tripsinas catalizar es termodinámicamente favorable, pero requiere energía de activación significativa. Además, tripsina contiene un "agujero de oxianión" formado por la columna vertebral amida átomos de hidrógeno de Gly-193 y Ser-195, que sirve para estabilizar la carga negativa en desarrollo en el átomo de oxígeno del carbonilo de las amidas troceados.
El residuo aspartato situado en el bolsillo catalítico de tripsinas es responsable de la atracción y la estabilización de carga positiva de lisina y/o arginina, y es, por lo tanto, responsable de la especificidad de la enzima. Esto significa que la tripsina escinde predominantemente proteínas en el lado carboxilo de los aminoácidos lisina y arginina, excepto cuando o bien está unido a un C-terminal de prolina., Aunque los datos de espectrometría de masas de gran escala sugieren la escisión se produce incluso con prolina. Tripsinas se consideran endopeptidasas, es decir, la división se produce dentro de la cadena polipeptídica en lugar de en los aminoácidos terminales situados en los extremos de los polipéptidos.
Propiedades
Tripsinas tiene un pH óptimo de funcionamiento de alrededor de 7.5 a 8.5 y la temperatura óptima de funcionamiento de alrededor de 37 º C.
La actividad de tripsinas no se ve afectada por el inhibidor de tosilo fenilalanil clorometil cetona, TPCK, que desactiva la quimotripsina. Esto es importante porque, en algunas aplicaciones, como la espectrometría de masas, la especificidad de la escisión es importante.
Tripsinas se deben almacenar a temperaturas muy bajas para evitar la autolisis, que también puede ser impedida por el almacenamiento de tripsinas a pH 3 o mediante el uso de tripsina modificada por metilación reductiva. Cuando el pH se ajusta de nuevo a pH 8, regrese la actividad.
Las isoenzimas
Los siguientes genes humanos codifican proteínas con la actividad enzimática de tripsina:
Otras isoformas de tripsina también se pueden encontrar en otros organismos.
Significado clínico
La activación de tripsina de la escisión proteolítica de tripsinógeno en el páncreas puede dar lugar a una serie de acontecimientos que causan pancreática auto-digestión, lo que resulta en la pancreatitis. Una de las consecuencias de la enfermedad recesiva autosómica la fibrosis quística es una deficiencia en el transporte de la tripsina y otras enzimas digestivas del páncreas. Esto conduce al trastorno denominado íleo meconio. Este trastorno consiste en la obstrucción intestinal por meconio demasiado gruesas, que normalmente descompone por tripsinas y otras proteasas, luego se pasa en las heces.
Aplicaciones
La tripsina es disponible en gran cantidad en el páncreas, y se puede purificar con bastante facilidad. Por lo tanto, se ha usado ampliamente en diversos procesos biotecnológicos.
En un laboratorio de cultivo de tejidos, tripsinas se utilizan para volver a suspender las células adherentes a la pared de placa de cultivo celular durante el proceso de recolección de las células. Algunos tipos de células tienen una tendencia a "pegarse" - o adherirse - a los lados y el fondo de un plato cuando se cultivan in vitro. La tripsina se utiliza para escindir proteínas de unión de las células cultivadas para el plato, de modo que las células se pueden suspender en solución fresca y transfirieron a placas frescas.
La tripsina también se puede utilizar para disociar las células disecadas.
Tripsinas se pueden utilizar para romper la caseína en la leche materna. Si se añade tripsina a una solución de leche en polvo, la ruptura de la caseína hará que la leche se convierta en transparente. La velocidad de reacción se puede medir mediante el uso de la cantidad de tiempo que le toma a la leche a su vez translúcido.
La tripsina se utiliza comúnmente en la investigación biológica durante la proteómica experimentos para digerir las proteínas en péptidos para el análisis de espectrometría de masas, por ejemplo, digestión en gel. La tripsina es particularmente adecuado para esto, ya que tiene una especificidad muy bien definido, ya que hidroliza sólo los enlaces peptídicos en los que el grupo carbonilo es aportado ya sea por un residuo de Arg o Lys.
La tripsina también se puede utilizar para disolver los coágulos de sangre en su forma microbiana y el tratamiento de la inflamación en su forma pancreática.
En los alimentos
Preparaciones de proteasa comerciales por lo general consisten en una mezcla de diversas enzimas proteasa que a menudo incluye la tripsina. Estas preparaciones se utilizan ampliamente en la industria alimentaria:
Inhibidor de tripsina
Con el fin de evitar la acción de la tripsina activa en el páncreas que puede ser muy perjudicial, tales como inhibidores de BPTI y SPINK1 en el páncreas y a1-antitripsina en el suero están presentes como parte de la defensa contra su activación inapropiada. Cualquier tripsina prematuramente formado a partir del tripsinógeno inactivo estaría obligado por el inhibidor. La interacción proteína-proteína entre tripsina y sus inhibidores es uno de los más estrechos encontrado, y la tripsina está vinculado por algunos de sus inhibidores pancreáticos esencialmente irreversible. A diferencia de casi todos los conjuntos de proteínas conocidas, algunos complejos de tripsina obligados por sus inhibidores no se disocian fácilmente después del tratamiento con urea 8M.
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