Los sistemas ópticos compuestos son sistemas formados por varias lentes, donde la imagen final se forma cuando la imagen de la primera lente hace de objeto para la segunda y así sucesivamente.
Todos ellos sirven para aumentar el tamaño aparente de las cosas. Debemos entender que la percepción que tenemos del tamaño y la distancia de los objetos depende del ángulo bajo el que aparecen a nuestra vista. Un objeto muy pequeño o muy lejano aparece bajo un ángulo muy pequeño. Y un objeto grande o cercano aparece bajo un ángulo mayor.
Al observar un objeto pequeño o lejano, los rayos de luz que vienen de él nos llegan bajo un ángulo muy pequeño.
Si esos rayos los hacemos pasar por un sistema óptico que aumente el ángulo bajo el cual los vemos, el objeto parecerá ser mayor o estar más cerca de lo que realmente está. En esto se basan todos los sistemas ópticos usados para aumentar objetos.
En esta práctica estudiaremos el microscopio, el anteojo de Galileo y el anteojo de Kepler o astronómico. Antes de empezar, nos familiarizaremos con la animación construyendo una lupa y describiendo las condiciones que se tienen que dar para que podamos ver los objetos aumentados.
La lupa está compuesta por una lente convergente de distancia focal pequeña. Forma una imagen virtual, derecha y mayor que el objeto.
El microscopio está formado por dos lentes convergentes, el objetivo y el ocular, que realizan la ampliación en dos pasos. El objetivo es una lente de corta distancia focal que se coloca muy cerca del objeto que se quiere observar. Forma una imagen intermedia real, mayor e invertida. Esta imagen intermedia se vuelve a ampliar en la segunda lente, el ocular, formando la imagen que vemos al mirar por el telescopio. Esta imagen final es virtual, invertida y mucho mayor comparada con el objeto que estamos observando.
El anteojo de Galileo está formado por un objetivo convergente y un ocular divergente. Se usa para observar objetos muy lejanos, así que los rayos llegan aproximadamente paralelos como si el objeto estuviera en el infinito. Al atravesar el anteojo, los rayos vuelven a salir paralelos hacia nuestros ojos, así que la imagen se forma también en el infinito, pero la vemos bajo un ángulo mayor.
En el anteojo de Kepler o astronómico tanto el objetivo como el ocular son convergentes. El funcionamiento es el mismo que el del anteojo de Galileo. Los rayos de un objeto lejano entran paralelos y se concentran, haciendo que la imagen ocupe un ángulo mayor de visión.
Todos ellos sirven para aumentar el tamaño aparente de las cosas. Debemos entender que la percepción que tenemos del tamaño y la distancia de los objetos depende del ángulo bajo el que aparecen a nuestra vista. Un objeto muy pequeño o muy lejano aparece bajo un ángulo muy pequeño. Y un objeto grande o cercano aparece bajo un ángulo mayor.
Al observar un objeto pequeño o lejano, los rayos de luz que vienen de él nos llegan bajo un ángulo muy pequeño.
Si esos rayos los hacemos pasar por un sistema óptico que aumente el ángulo bajo el cual los vemos, el objeto parecerá ser mayor o estar más cerca de lo que realmente está. En esto se basan todos los sistemas ópticos usados para aumentar objetos.
En esta práctica estudiaremos el microscopio, el anteojo de Galileo y el anteojo de Kepler o astronómico. Antes de empezar, nos familiarizaremos con la animación construyendo una lupa y describiendo las condiciones que se tienen que dar para que podamos ver los objetos aumentados.
La lupa está compuesta por una lente convergente de distancia focal pequeña. Forma una imagen virtual, derecha y mayor que el objeto.
El microscopio está formado por dos lentes convergentes, el objetivo y el ocular, que realizan la ampliación en dos pasos. El objetivo es una lente de corta distancia focal que se coloca muy cerca del objeto que se quiere observar. Forma una imagen intermedia real, mayor e invertida. Esta imagen intermedia se vuelve a ampliar en la segunda lente, el ocular, formando la imagen que vemos al mirar por el telescopio. Esta imagen final es virtual, invertida y mucho mayor comparada con el objeto que estamos observando.
El anteojo de Galileo está formado por un objetivo convergente y un ocular divergente. Se usa para observar objetos muy lejanos, así que los rayos llegan aproximadamente paralelos como si el objeto estuviera en el infinito. Al atravesar el anteojo, los rayos vuelven a salir paralelos hacia nuestros ojos, así que la imagen se forma también en el infinito, pero la vemos bajo un ángulo mayor.
En el anteojo de Kepler o astronómico tanto el objetivo como el ocular son convergentes. El funcionamiento es el mismo que el del anteojo de Galileo. Los rayos de un objeto lejano entran paralelos y se concentran, haciendo que la imagen ocupe un ángulo mayor de visión.
Objetivo.
El objetivo de esta práctica es construir los cuatro instrumentos ópticos y entender las condiciones que se tienen que dar (posiciones y distancias de los objetos y los focos) en cada uno de ellos para que funcionen.
Instrucciones.
HASTA QUE TE FAMILIARICES CON LA ANIMACIÓN, SIGUE LAS INSTRUCCIONES PASO A PASO.
DESCÁRGATE EL ARCHIVO EXCEL PARA ANOTAR TUS RESULTADOS.
DESCÁRGATE EL ARCHIVO EXCEL PARA ANOTAR TUS RESULTADOS.
- Lee bien la introducción y apunta las propiedades de las imágenes que forma cada sistema óptico.
- Construye una lupa y sitúa un objeto pequeño delante de ella de manera que la imagen formada sea 4 veces más alta que el objeto. Pincha con el botón izquierdo en el objeto para que te aparezcan las medidas del objeto y la imagen. Imprime la pantalla y copia la imagen en el archivo excel.
- Construye un microscopio. Sitúa un objeto pequeño delante de él de manera que la imagen sea 20 veces más alta que el objeto (usa un objeto muy pequeño). Imprime la pantalla y copia la imagen en el archivo excel.
- Construye un anteojo de Galileo. Sitúa un haz de luz (beam) delante, de manera que los rayos se concentren. Imprime la pantalla y copia la imagen en el archivo excel.
- Construye un anteojo de Kepler o astronómico. Sitúa un haz de luz (beam) delante, de manera que los rayos se concentren. Imprime la pantalla y copia la imagen en el archivo excel.
La imagen. Consideraciones:
Definición: (Del lat. imago, -inis). f. Ópt. Reproducción de la figura de un objeto por la combinación de los rayos de luz que proceden de él (50).
Para producir una imagen se requieren dos elementos: Primero, el objeto, sobre el cual debe incidir algún tipo de radiación electromagnética que permita “iluminarlo” por decirlo de alguna manera y segundo, un medio de formación de la imagen o sistema óptico que permitirá finalmente producir la imagen. El tamaño de la imagen formada puede ser más pequeño, igual o mayor que el tamaño del objeto a partir del cual se produjo.
En lo que respecta a la obtención de las imágenes es necesario analizar los siguientes aspectos:
• Principio de Huygens: Cada punto de un objeto dispersa la luz incidente en forma de onda esférica (7, 8, 9).
• A unos micrómetros de distancia de la superficie del objeto, los rayos que emergen de todos los puntos del objeto se entrecruzan, impidiendo la localización de los detalles del mismo (fig.3-1).
• Para localizar nuevamente los detalles del objeto es necesario un mecanismo que permita que todos los rayos que emergieron de un único punto sean reasignados (enfocados) a otro punto en el espacio para formar la imagen. Este aspecto es el punto central para entender la formación de las imágenes ópticas.
• Principio de Huygens: Cada punto de un objeto dispersa la luz incidente en forma de onda esférica (7, 8, 9).
• A unos micrómetros de distancia de la superficie del objeto, los rayos que emergen de todos los puntos del objeto se entrecruzan, impidiendo la localización de los detalles del mismo (fig.3-1).
• Para localizar nuevamente los detalles del objeto es necesario un mecanismo que permita que todos los rayos que emergieron de un único punto sean reasignados (enfocados) a otro punto en el espacio para formar la imagen. Este aspecto es el punto central para entender la formación de las imágenes ópticas.
Figura 3-1.-Principio de Huygens. Cada uno de los puntos "O" son emisores de ondas de luz que se propagan en forma esférica y se sobreponen.
Sistemas ópticos:
La lente es el instrumento principal para la formación de imágenes y los sistemas ópticos están constituidos a partir de lentes, combinadas o no, que permiten obtener imágenes de los objetos en estudio.
La lente es el instrumento principal para la formación de imágenes y los sistemas ópticos están constituidos a partir de lentes, combinadas o no, que permiten obtener imágenes de los objetos en estudio.
Los instrumentos para el enfoque (lentes) son necesarios porque la luz que incide sobre un objeto es irradiada y dispersada por este último, de allí que la lente es imprescindible para deshacer este efecto de dispersión y en consecuencia lograr el enfoque de los rayos luminosos provenientes de cada punto del objeto.
Un sistema óptico ideal es aquel que permite que cada punto del objeto sea representado en un punto específico en la imagen (9).
Basados en la lente como elemento de formación de imágenes se pueden citar los siguientes sistemas ópticos:
• Ojo humano.
• Cámara fotográfica.
• Lupa magnificadora.
• Proyector de imágenes.
• Microscopio.
• Telescopio.
• Ojo humano.
• Cámara fotográfica.
• Lupa magnificadora.
• Proyector de imágenes.
• Microscopio.
• Telescopio.
A pesar de todo el progreso técnico, el ojo, conjuntamente con el cerebro, es el sistema procesador de imágenes más eficiente disponible hasta la fecha. Todas las aplicaciones proporcionadas por la tecnología no son equiparables con el ojo en lo que concierne a velocidad y resolución. La estructura del ojo se relaciona con la de una cámara fotográfica. Junto con el cristalino, la superficie curva de la córnea proyecta una imagen óptica sobre la retina. La cantidad de brillo de la luz incidente es controlada por el diámetro variable del iris. Una imagen nítida es proporcionada por el cristalino, la longitud focal del mismo es cambiada por los músculos ciliares de una manera tal que el enfoque de cualquier objeto sea posible a una distancia comprendida entre 20 centímetros y el infinito (31).
Si se desea realizar un examen más cercano a una muestra (ver una imagen aumentada de algo pequeño) debemos recurrir a la microscopía. Para ello cortamos una rebanada finísima de un órgano o tejido, lo colocamos en un portaobjeto de cristal y protegemos el tejido con un cubreobjetos. Si observamos el espécimen directamente con la vista, no podemos descubrir mucho. Podemos ver solamente el aspecto macroscópico del corte de tejido. Los detalles de las estructuras que deseamos ver poseen un diámetro muy pequeño, en el orden de los micrómetros y nanómetros (1/100 o 1/1000 de un milímetro respectivamente). Por ello es necesario emplear el microscopio.
Una solución a esta limitación ha sido empleada por siglos, la lupa o lente magnificador, que cuando se coloca entre el ojo y el objeto, éste último aparece más grande. Sin embargo, la lupa tiene sus limitaciones, la ampliación que se logra no es aún suficiente. La lupa también se denomina microscopio simple, puesto que está conformada por una lente única. Si se desea ver más detalles se debe utilizar el microscopio compuesto.
El proyector de imágenes y diapositivas empleado en docencia es un aparato que produce sobre una pantalla una imagen real y aumentada de un objeto (transparencia o diapositiva) fuertemente iluminado.
El microscopio compuesto es un instrumento óptico que permite ver objetos que por su pequeño tamaño son invisibles a simple vista. Permite obtener a partir de esos objetos una imagen considerablemente aumentada. Es una combinación del proyector de imágenes y una lupa. Si una lente (lupa) no es suficiente, varias lentes se pueden disponer de manera alineada. El efecto de magnificación se multiplica así, permitiendo ampliaciones hasta de 2000 veces. El microscopio compuesto magnifica en dos pasos puesto que tiene dos juegos de lentes. El primer juego, denominado objetivo (funciona como el proyector de imágenes) produce una imagen aumentada del objeto y el segundo, denominado ocular magnifica la imagen producida por el objetivo, de la misma manera que lo haría una lupa .
Fundamento de la microscopía:
Sobre la base de las consideraciones anteriores se ha definido la microscopía como la técnica que permite observar objetos con un microscopio (simple o compuesto) y obtener una imagen aumentada del mismo y para ello es necesario tener en cuenta estos tres elementos:
• El objeto a estudiar (preparado histológico por ejemplo).
• Una fuente de iluminación.
• Un sistema óptico.
• El objeto a estudiar (preparado histológico por ejemplo).
• Una fuente de iluminación.
• Un sistema óptico.
Cuando se plantea el estudio de alguna célula, tejido u órgano, previamente se debe definir cuales aspectos (morfológicos, bioquímicos, fisiológicos, genéticos, entre otros) se desean analizar, o si se desea observar células vivas o células fijadas. En base a esto último se definirá y planificará la metodología a seguir. Se seleccionará la técnica de visualización y el tipo de instrumento óptico para obtener las imágenes. Las técnicas de laboratorio para preparar la muestra y obtener el preparado histológico que será observado, dependerán en gran medida del tipo de microscopio requerido para visualizarlo, según los aspectos que han sido definidos previamente.
De la misma manera que se ha razonado en relación al preparado histológico (objeto), se debe analizar el papel que juega la luz o sistema de iluminación empleado. Se desea evidenciar y distinguir a mayor aumento los detalles del objeto que se estudia. Generalmente se habla de la iluminación, término ampliamente utilizado, que en microscopía no siempre denota el empleo de un rayo luminoso conformado por fotones, los cuales si pueden ser captados por la retina del ojo.
Además de la luz solar y la luz producida por bombillas incandescentes, también se pueden emplear otros tipos de radiaciones electromagnéticas, tales como la luz ultravioleta, los rayos láser o un haz de electrones. Estos últimos no son captados por la retina pero si por una placa fotográfica o una pantalla fluorescente, siendo considerados como un tipo de “iluminación”, que a pesar de no estar constituida por fotones, también permite la formación de una imagen que muestra los detalles finos de un espécimen.
Para iluminar el objeto se pueden emplear dos mecanismos, ya sea que el rayo de luz lo atraviese o que simplemente incida en cierto ángulo sobre el objeto. En el primer caso se habla de trans-iluminación y en el segundo caso de epi-iluminación.
3.3.1.-Trans-iluminación:
La trans-iluminación ha sido indudablemente el primer método de iluminación en la larga historia de la microscopía. El rayo electromagnético (luz visible por ejemplo) debe atravesar el objeto, en éste caso un corte histológico (fig. 3-2). Como condiciones fundamentales para ser observados al microscopio compuesto, los preparados biológicos deben ser muy delgados y transparentes. Deben ser rebanados con instrumentos especializados (micrótomos) que permiten obtener cortes cuyo espesor debe estar en el orden de las micras. Rutinariamente el espesor del corte puede oscilar en un rango que va de 1 a 5µm, pero su grosor dependerá del tipo de células y tejidos. Para el estudio de las neuronas se realizan cortes más gruesos (alrededor de 30 µm), mientras que para el estudio de células del riñón, en ciertos casos son ideales los cortes de 4 µm. Para la microscopía electrónica se emplean cortes cuyo espesor está en el orden de los nanómetros (cortes ultra finos) debido al bajo poder de penetración de los electrones.
La transparencia es otra cualidad que debe tener el objeto (preparado histológico). Las células son incoloras por naturaleza, pero algunas poseen color propio (pigmentos). Para mejorar la transparencia se emplean ciertas sustancias químicas (agente aclarador) como el xilol, entre otros. Ser transparente facilita en gran medida el paso del rayo de luz. La estructura de las células y tejidos es muy heterogénea y crea diferentes densidades en los compartimientos intra y extracelulares. Para mejorar la visualización de tales variaciones en la concentración de los constituyentes celulares, se pueden emplear colorantes u otros reactivos químicos que incrementen el contraste entre ellas y permitan su identificación. Esto no siempre es necesario, puesto es factible sin ningún tipo de colorantes observar células con algunos microscopios especiales, cuyo sistema de iluminación crea contrastes muy evidentes, que de ordinario no se observan con el microscopio compuesto clásico.
La trans-iluminación permite obtener un campo de visión con una cantidad de luz importante, resaltando la estructura observada sobre un fondo muy iluminado. El microscopio compuesto clásico emplea este tipo de iluminación y por ello también se denomina de campo claro. La microscopía electrónica de transmisión (14) y la mayoría de microscopios especiales también se fundamentan en este principio.
3.3.2.-Epi-iluminación:
Con esta técnica de iluminación el rayo de luz incide de manera oblicua sobre la muestra (fig. 3-2). La iluminación puede abarcar simultáneamente todo el campo de visión o por el contrario, focalizarse en un punto determinado del objeto. Las muestras pueden observarse sin necesidad de realizar cortes finos y en muchos casos tampoco se emplean colorantes. La transparencia del objeto no es imprescindible. Como efecto de la epi-iluminación es posible obtener imágenes tridimensionales, complementando de esta manera lo observado con la microscopía por trans-iluminación. Varios tipos de microscopios emplean este método y como ejemplo podemos citar microscopios binoculares estereoscópicos para microdisecciones, y los microscopios de epi-fluorescencia, el confocal y el electrónico de barrido.
Con esta técnica de iluminación el rayo de luz incide de manera oblicua sobre la muestra (fig. 3-2). La iluminación puede abarcar simultáneamente todo el campo de visión o por el contrario, focalizarse en un punto determinado del objeto. Las muestras pueden observarse sin necesidad de realizar cortes finos y en muchos casos tampoco se emplean colorantes. La transparencia del objeto no es imprescindible. Como efecto de la epi-iluminación es posible obtener imágenes tridimensionales, complementando de esta manera lo observado con la microscopía por trans-iluminación. Varios tipos de microscopios emplean este método y como ejemplo podemos citar microscopios binoculares estereoscópicos para microdisecciones, y los microscopios de epi-fluorescencia, el confocal y el electrónico de barrido.
Figura 3-2.-Comparación de los mecanismos de iluminación más empleados en microscopía. La flecha amarilla representa el haz de luz incidente sobre la muestra, que en la transiluminación atraviesa la misma; mientras que en la epi-iluminación el rayo incide de manera oblicua y en este caso son los rayos reflejados los que se capturan para formar la imagen.
Aumento y resolución
Los términos aumento y resolución deben ser bien conocidos por todo usuario del microscopio. El mecanismo mediante el cual se produce este fenómeno ha sido estudiado por siglos y se explica mediante leyes de la física. Considerar únicamente el aumento no es suficiente para sacar el mejor partido del microscopio, pues otro factor, la resolución, determina lo que se verá.
3.4.1.-Aumento
El poder de aumento de una lente está determinado por el grado de curvatura de su superficie y la distancia focal. En las lentes convexas mientras mayor sea la curvatura, menor será la distancia focal y mayor será el aumento. Se ha enunciado anteriormente que el microscopio compuesto aumenta en dos etapas y puesto que una sola lente no es suficiente se deben colocar varias lentes una detrás de la otra, potenciando de esta manera el poder de aumento. El primer juego de lentes, cercano al objeto en estudio, se denomina objetivo y el segundo juego, cercano al ojo del observador se denomina ocular (11). Cada sistema de lentes es capaz de producir una imagen aumentada cuyo valor se enuncia con la letra x, así que 10x significa que la imagen está aumentada 10 veces.
Para conocer en el microscopio compuesto el aumento definitivo de una imagen se aplica la siguiente fórmula:
AUMENTO TOTAL: Aumento del objetivo x Aumento del ocular
Aunque esta fórmula básica permite obtener el aumento total de una imagen, con las técnicas de fotografía clásica o fotografía digital y el uso de software de procesamiento de imágenes es posible lograr un aumento suplementario. Para obtener el aumento definitivo habría que considerar los factores de ampliación que se realizan en la pantalla del computador (para luego imprimirla) o al copiar la foto a papel mediante la técnica de fotografía clásica.
El poder de aumento de un sistema óptico tiene sus límites y el aumentar las imágenes acarrea pérdida de información o detalles del objeto estudiado. Esto puede ser resuelto mediante otro principio: La resolución.
Con el microscopio compuesto clásico es posible alcanzar un aumento máximo de 1000x. Esta limitación ha sido resuelta empleando un haz de electrones en lugar de un rayo de luz visible, y se abrió así una nueva era con la microscopía electrónica aplicada al estudio morfológico.
Es la capacidad que tiene un sistema óptico de aislar dos puntos que se encuentran muy próximos entre sí, de manera que se puedan ver individualizados uno del otro (14). La riqueza de detalles que puede ser observada al microscopio depende de la habilidad de este para hacer que los puntos del objeto que están muy cercanos aparezcan en la imagen como puntos separados. Mientras más corta sea la distancia entre esos puntos del objeto, más finos serán los detalles. La distancia entre esos dos puntos se conoce como Límite de Resolución, el cual es también referido como el Poder de Resolución y puede ser utilizada como un indicador del rendimiento del microscopio. Esto se puede comparar vagamente con algunos aspectos de la informática, el tamaño del pixel por ejemplo; mientras más pequeño sea el tamaño, mayor será la cantidad de detalles de la imagen digital.
Límites de Resolución aproximados de algunos sistemas ópticos:
• Ojo humano: 0,2 mm.
• Microscopio Fotónico: 0,2 µm.
• Microscopio electrónico: 0,2 nm.
Límites de Resolución aproximados de algunos sistemas ópticos:
• Ojo humano: 0,2 mm.
• Microscopio Fotónico: 0,2 µm.
• Microscopio electrónico: 0,2 nm.
Al observar pequeños objetos al microscopio, la luz incidente proveniente de ellos es desviada de su trayectoria inicial y mientras más pequeños sean, mayor será la desviación. Las lentes del objetivo deben recolectar como sea posible la mayor cantidad de rayos desviados para formar una imagen nítida; a más rayos capturados, mayor resolución (fig.3-3).
Figura 3-3.-Esquema que muestra un objeto (1) que es atravesado por un haz de rayos luminosos (2) los cuales son captados por el objetivo (3). Al formarse el cono de luz proveniente del objeto se determina un ángulo, también llamado de apertura, donde a representa la mitad del mismo. Tomado de Kapitza H G. Microscopy from the very begining (13).
A partir de las observaciones precedentes, nace la definición de apertura numérica (AN), cifra a considerar para determinar el rendimiento de una lente objetivo (13):
AN = n x sen a
Donde a = la mitad del ángulo de apertura del objetivo.
n = el índice de refracción del medio que se encuentra entre el objeto y el objetivo.
(Para el aire n = 1 y para el vidrio o aceite n = 1.51)
Otra manera de incrementar la resolución es creando, del lado de la fuente luminosa, un cono amplio con un ángulo mayor. Para ello se emplea otro juego de lentes denominado condensador el cual posee la misma apertura numérica que el objetivo (fig. 3-4).
Figura 3-4.-El objeto (1) es iluminado con un rayo de luz (2) que formará un cono luminoso frente al objetivo. Se colocó otra lente (4) que recoge y condensa la luz antes que ilumine al objeto. Tomado de Kapitza H G. Microscopy from the very begining (13)
Para aumentar aún más la resolución, además de agregar un condensador, otra posibilidad es colocar algún líquido entre la lámina cubreobjeto y el objetivo. Se ha obtenido buenos resultados con ciertos aceites (aceite de cedro) cuyo índice de refracción es igual al del vidrio cubreobjeto, eliminando toda reflexión de los rayos luminosos (fig. 3-5).
.
Figura 3-5.-A la izquierda el espacio entre el cubreobjeto (5) y el objetivo (3) es ocupado por el aire; a la derecha el espacio es ocupado por un líquido de inmersión (6). Apréciese que el cono de luz y el ángulo a son mayores con inmersión. Modificado de de Kapitza H G. Microscopy from the very begining (13).
El poder de resolución de un microscopio compuesto de campo claro puede ser calculado de manera razonable mediante la fórmula (13):
Donde delta= resolución expresada en micrómetros.
lambda = longitud de onda de la luz empleada.
Como la ANobj y la ANcond son iguales, se resume 2AN.
De los anteriores planteamientos se deduce que el poder de resolución de un sistema óptico, en términos generales depende principalmente de:
• Apertura numérica del objetivo y condensador: La relación apertura/resolución es directamente proporcional; a mayor apertura, mayor resolución.
• Longitud de onda de la radiación electromagnética utilizada: La relación longitud de onda/resolución es inversamente proporcional; a menor longitud de onda, mayor resolución.
Factores que limitan la resolución en un sistema de formación de imágenes
Los sistemas ópticos y habitualmente los microscopios pueden presentar errores que producen distorsión de las imágenes. Son producidos mediante varios mecanismos, ya sea por el comportamiento de la luz al incidir sobre el objeto en estudio o ya sea por defectos propios de las lentes. Estos defectos son comunmente conocidos como aberraciones. Algunos resultan de la esfericidad de la superficie de la lente y son derivados de la interacción de la luz con dicha superficie (15). Estos defectos producen alteraciones de los detalles de las imágenes y se pueden presentar combinados. En la actualidad, con el uso de técnicas de manufactura moderna que han permitido la elaboración de lentes más efectivas, se ha logrado corregirlos en gran medida.
3.5.1.-Difracción
El término difracción viene del latín diffractus que significa quebrado. La difracción es el fenómeno que se observa cuando la luz, al pasar por el extremo de una superficie se "dobla" desviandose del trayecto y no sigue su propagación en línea recta (58) (fig. 3-6).
Figura 3-6.-Cuando al luz pasa por una rendija, no sigue su trayecto en línea recta, se “dobla”, en otras palabras, se difracta. Tomado de Braun, E. Arquitectura de sólidos y líquidos (58).
En la trans-iluminación del objeto, las ondas luminosas encuentran obstáculos en su trayecto, lo que produce una expansión de la luz por la difracción y se obtiene una imagen borrosa que limita la capacidad de aumento útil de un microscopio. Por ejemplo, los detalles menores de media milésima de milímetro (0,5 µm) no pueden verse en la mayoría de los microscopios ópticos.
Al ser observado un objeto transparente al microscopio, cada detalle iluminado del mismo crea un patrón de difracción denominado disco de Airy. Este patrón esta formado por un punto central brillante y varios anillos brillantes separados por anillos oscuros. Cuando dos detalles estan muy próximos entre sí se puede verlos separados sólo si los puntos centrales no están muy próximos o superpuestos. Mientras más pequeños sean los discos de Airy, mayor será la resolución en una imagen (fig. 3-7). Los objetivos con mayor apertura numérica producen discos de Airy más pequeños (12).
Figura 3-7.-Discos de Airy y resolución. (a,b,c) tamaño de los discos y su perfil de intensidad, que decrece de (a) hasta (c) relacionados con la apertura numérica a medida que aumenta. (d) dos discos de Airy superpuestos y (e) discos de Airy en el límite de resolución. Tomado de Davison M, Abramowitz M. Optical Microscopy (15).
Hay varios tipos de aberraciones:
• De esfericidad, relacionadas con la forma esférica de la lente: Se producen por falta de convergencia de las ondas luminosas que pasan por la periferia de la lente cuando no son enfocadas en el mismo punto que aquellas ondas que pasan por el centro, las cuales son refractadas ligeramente; mientras que las que inciden en la periferia son refractadas en mayor grado y convergen en diferentes puntos focales. Este es uno de los artificios más molestos y la imagen del objeto aparece dispersa y borrosa, en lugar de enfocada y nítida (fig. 3-8). Además de la lente, la lámina cubreobjeto empleada en la preparación histológica puede producir este tipo de aberración. Una lámina de calidad debe tener 0,17 mm de espesor para poder ser utilizada con las lentes objetivo de la mayoría de microscopios, de lo contrario produce una marcada aberración de esfericidad (13, 57).
Figura 3-8.-Aberración de esfericidad. Los rayos que inciden paralelamente al eje principal no convergen todos en un mismo punto. Los rayos de la periferia convergen más cerca de la lente. Modificado de Dini, A. Apuntes de Física (59).
• Cromáticas, relacionadas con las variaciones en los índices de refracción de las diversas frecuencias (colores) que conforman la luz blanca visible: Cuando la luz blanca atravieza una lente, las diferentes frecuencias son refractadas de acuerdo a su frecuencia. Cada color tiene un camino y un foco diferente; la luz violeta es la más refractada y le siguen la azul, la verde y la roja, fenómeno tambien conocido como dispersión (fig. 3-9). La incapacidad de la lente de reunir nuevamente los rayos refractados en un punto focal común resulta en una discreta diferencia en el tamaño del objeto y en franjas de colores rodeando la imagen (43). Los sistemas ópticos que dan corregida esta aberración se denominan acromáticos.
Figura 3-9.-Aberración cromática. La luz blanca se descompone al atravezar la lente y las diversas longitudes de onda convergen en varios puntos focales diferentes. Modificado de Dini, A. Apuntes de Física (59).
• Otras aberraciones geométricas: Incluyen una variedad de efectos, tales como:Astigmatismo: No se puede enfocar simultáneamente líneas verticales y horizontales.
Coma: Se produce una degradación de la imagen de un punto, se ve similar a un cometa.
Distorsión: Se manifiesta en la forma del objeto, afectando particularmente a los bordes. El objeto se ve en forma de barril o de corset.
Curvatura del campo: El campo se ve con bordes curvos, deformando la imagen.
Coma: Se produce una degradación de la imagen de un punto, se ve similar a un cometa.
Distorsión: Se manifiesta en la forma del objeto, afectando particularmente a los bordes. El objeto se ve en forma de barril o de corset.
Curvatura del campo: El campo se ve con bordes curvos, deformando la imagen.
La óptica geométrica da las bases para aplicar métodos que permiten la corrección o compensación de las aberraciones. Uno de ellos es la reducción de la apertura de ángulo del haz de luz, de manera que se evitan los rayos incidentes en la periferia de las lentes.
Un procedimiento más complejo es la combinación de varias lentes que corrijan la aberración. Esto se aplica para la aberración cromática y fue propuesto por Chester More Hall en 1735 y aplicado algo más tarde en microscopios. La corrección de la aberración esférica fue resuelta por Joseph Jackson Lister en 1830.
Para corregir las aberraciones geométricas se fabrican objetivos planos o aplanáticos, detalle señalado con la etiqueta PLAN. Para la corrección de las aberraciones cromáticas se elaboran objetivos denominan acromáticos, los cuales corrigen el rojo y el azul. Los objetivos semiapocromáticos son acromáticos que tienen una mayor apertura numérica. Los objetivos apocromáticos corrigen los colores rojo, azul y además el verde. Estos últimos son los objetivos de mayor calidad (47).
En el ojo humano aparecen todo tipo de aberraciones, notablemente desenfoque (miopía e hipermetropía), astigmatismo, coma y curvatura de campo entre otras, debido a que en generalmente este sistema óptico trabaja con una apertura pupilar grande. Algunas se compensan de forma natural pero las más graves tales como el desenfoque y el astigmatismo se corrigen mediante lentes o cirugía.
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