Genética

Cartografía genética

amplificación aleatoria de ADN polimórfico, más conocida por el acrónimo inglés RAPDs (Random Amplification ofPolymorphic DNA), es un tipo de marcador molecular basado en la reacción en cadena de la polimerasa. Los fragmentos deADN obtenidos por medio de esta técnica se amplifican en regiones aleatorias del genoma ya que los iniciadores o cebadores de la reacción son secuencias arbitrarias de ADN sintético. Es una de las técnicas más versátiles desde que se desarrolló en el año 1990.¹ Es muy cómoda, rápida, requiere poco ADN que además no necesita estar muy puro, no presupone conocimientos previos sobre la secuencia, y se pueden distinguir rápida y simultáneamente muchos organismos. Sus inconvenientes son que los fragmentos amplificados no suelen corresponder a ADN ligado a algún carácter, sino redundante, y que no da información sobre el número de copias que el ADN genómico contiene de la secuencia amplificada. Esta tecnología ha sido utilizada para análisis de diversidad genética,² mejoramiento genético,³ y diferenciación de líneas clonales.⁴

Método

Esta técnica se basa en la utilización de un único oligonucleótido de 10bp que hibrida al azar con el ADN en estudio. Para que se genere un fragmento RAPD es necesario que las dos hebras del ADN en estudio presenten sitios de hibridación con el oligonucleótido en orientaciones opuestas suficientemente cercanas (menos de 3000bp) como para permitir la amplificación. La secuencia del oligonucleótido es aleatoria al igual que los sitios de hibridación, por lo que la secuencia amplificada es desconocida. El polimorfismo que se observa entre distintos individuos consiste en la presencia o ausencia de fragmentos de ADN amplificado.

marcador genético o marcador molecular es un segmento de ADN con una ubicación física identificable (locus) en un cromosoma y cuya herencia genética se puede rastrear. Un marcador puede ser un gen, o puede ser alguna sección del ADN sin función conocida. Dado que los segmentos del ADN que se encuentran contiguos en un cromosoma tienden a heredarse juntos, los marcadores se utilizan a menudo como formas indirectas de rastrear el patrón hereditario de un gen que todavía no ha sido identificado, pero cuya ubicación aproximada se conoce. Los marcadores se usan para el mapeo genético como el primer paso para encontrar la posición e identidad de un gen.

Son ampliamente utilizados en genética humana, vegetal, animal y microbiana. Permiten evidenciar variaciones (polimorfismos) en la secuencia del ADN entre dos individuos, modifiquen éstas o no su fenotipo. Funcionan como señaladores de diferentes regiones del genoma.

Tipos de marcadores genéticos

Basados en proteínas

• isoenzimas
• proteínas de reserva

Basados en el ADN

• RFLP (o Polimorfismo en la longitud de fragmentos de restricción)
• AFLP (o Amplified fragment length polymorphism)
• RAPD (o Random amplification of polymorphic DNA)
• VNTR (o Número variable de repeticiones en tándem)
• Microsatélites, SSR o STR
• SNP (o Single nucleotide polymorphism)
• SFP (o Single feature polymorphism)
• TRAPs (o Polimorfismos para la amplificación de regiones blanco)

Los marcadores geneticos son un fragmento de ADN que tiene una ubicación especifica en un cromosoma el cual es un cuerpo en donde se organiza la cromatina dentro del nucleo celular , a estos framentos se les puede buscar la herencia , y no necesariamente este fragmento tiene que tener una funcion especifica.Estos "rastreadores" están en lugares específicos del genoma, estos se heredan y las caracteristicas de interes seguirán unidas a estos marcadores,estos indican la presencia de una característica deseada.

Algo importante a destacar es que los fragmentos contiguos en los cromosomas tienden a heredarse juntos , por lo tanto un gen puede servirnos para encontrar otro gen , por ejemplo si tenemos un gen con caracteristicas A que esta asociado a un gen con caracteristicas B este puede ser un marcador genetico.Por lo tanto un marcador genetico nos puede ayudar a identificar un organismo,una especie o una cepa.Algunos de ellos son heredados por herencia Mendeliana , y pueden o no depender del ambiente.

Se han divido los marcadores geneticos en grupos :

1. marcadores morfologicos:fueron los primeros tipos de marcadores que el hombre utilizó , son caracteres que se expresan en un ambiente especficio , por ejemplo en una flor , su marcador morfologico podria ser su peso, las semillas etc. sin embargo el problema de estos marcadores morfologicos es que dependen de un fenotipo ,el cual puede ser modificado arduamente por el ambiente.
2. los marcadores moleculares: es un gen que se expresa ,el cual le permite a la ciencia obserarlo se pueden estudiarse desde que los individuos estan en sus primeras etapas de desarrollo.

Algunos ejemplos de marcadores geneticos :

microsatélites (SSR o STR por sus acrónimos en inglés para simple sequence repeat y short tandem repeat) son secuencias de ADN en las que un fragmento (cuyo tamaño va desde dos hasta seis pares de bases) se repite de manera consecutiva. La variación en el número de repeticiones, y no la secuencia repetida, crea diferentes alelos.

Generalmente se encuentran en zonas no codificantes del ADN. Son neutros, co-dominantes y poseen una alta tasa de mutación, lo que los hace muy polimórficos. Son utilizados como marcadores moleculares en una gran variedad de aplicaciones en el campo de la genética, como pueden ser parentescos y estudios de poblaciones. Esto se debe a su capacidad para generar una huella genética personal o perfil genético.

Cabe destacar que, para cada uno de los STRs que podemos encontrar en el genoma, se establecen en la población frecuencias en el número de repeticiones, es decir, que para cada STR existe un determinado rango en el número de repeticiones "normal" dentro de la población (por ejemplo, entre 10 y 13 repeticiones para un STR concreto), mientras que hay otros números de repeticiones que se establecen con menos frecuencia en ese marcador.

Constitución

Un microsatélite esta típicamente conformado por un motivo repetitivo, en el cual se encuentra contenido la secuencia repetida, y dos regiones flanqueantes, las cuales se encuentran a ambos lados del motivo repetitivo. Sin embargo, hay casos en los que puede haber dos motivos repetitivos o más dentro de un microsatélite. Para que un microsatélite sea considerado útil como marcador molecular, toda la variación de la secuencia o polimorfismo debe hallarse dentro del motivo repetitivo, mientras que las regiones flanqueantes deben estar altamente conservadas, al punto de no presentar ninguna variación de secuencia.

Para poder diferenciar dos microsatélites que se diferencien sólo en su número de repeticiones, necesitamos hacer una PCR. Para ello, se diseñan primers o iniciadores (también llamados cebadores), que son pequeños fragmentos de ADN complementarios a las regiones flanquentes, y que permiten amplificar (o producir un alto número de copias) nuestro microsatélite.

Los fragmentos así producidos son separados de acuerdo a su longitud en pares de bases a través de una electroforesis en gel de agarosa. Partiendo de la hipótesis de que en un microsatélite sólo varía el número de repeticiones dentro del motivo repetitivo, podemos saber cuántas repeticiones tiene nuestro microsatélite por el tamaño que alcanza la banda. Una vez echa la electroforesis, podemos comparar unos microsatélites con otros, siempre y cuando sean alelos de un mismo motivo repetitivo.

Estos alelos se heredarían de manera codominante, es decir, que en cada locus un individuo podría presentar uno o más alelos, dependiendo del número de juegos decromosomas que posea. Por ejemplo, los humanos somos diploides, es decir, poseemos dos juegos completos de cromosomas y por lo tanto para un locus de un microsatélite, podemos presentar un alelo (si ambos progenitores nos transmitieron alelos de la misma secuencia y tamaño) o dos alelos (si cada progenitor nos heredó un alelo de tamaño diferente).

Se ha probado que los microsatélites son versátiles marcadores moleculares, particularmente para los análisis poblacionales, pero no por ello se encuentran ausentes de limitaciones. Los microsatélites desarrollados para unas especies particulares pueden con frecuencia ser aplicadas a especies emparentadas, pero el porcentaje de loci que se amplifican satisfactoriamente puede disminuir cuando aumenta la distancia genética.

Otras de sus limitaciones, mucho más prosaicas, se deben a contaminación de las muestras, que puede dar lugar a falsos perfiles, sustancias que sean inhibitorias de la reacción de PCR y que no nos permitan conocer el perfil genético del material encontrado, la degradación del ADN, que se produce espontáneamente por las condiciones del medio y las enzimas de otros organismos y que puede dar lugar a perfiles parciales, distintos artefactos que alteren la lectura de los resultados, así como alelos nuevos no caracterizados con anterioridad y que precisan ser incorporados a las bases de datos para permitir su detección en el futuro.

Clasificación

Los microsatélites se clasifica de acuerdo al número de nucleótidos que posea el motivo de repetición como: mono, di, tri, tetra, penta o hexanucleótido.

La clasificación también incluye el patrón de orden de los motivos:

• Puro o perfecto: Un solo motivo repetido n veces en serie. ej: (AC)₉
• Puro interrumpido: Un solo motivo repetido n veces, donde se intercalan nucleótidos entre las distintas repeticiones. ej: (CA)₂AA(CA)₁₂
• Compuestos: Dos o más motivos repetidos en serie. ej: (GT)₂(TG)₁₀
• Compuestos interrumpidos: Al menos uno de sus motivos presenta nucleótidos intercalados. ej: (CT)₄(GT)₂CTAT(GT)₁₅
• Complejos: Combinaciones entre cualquiera de las clases anteriores, sin ningún patrón de orden definido. ej: (ACC)₈+TG+(GA)₁₂+(TTA)₅+GC+(TTA)₄

Aplicaciones

Dado que los microsatélites están más o menos distribuidos a lo largo de todo el genoma de los eucariotas,^{n. 1} aunque con baja frecuencia en las regiones codificantes y, quizás también en los telómeros,^{n. 1} y a sus particulares ventajas en cuanto a nivel de polimorfismo, bajo costo y codominancia, el uso de los microsatélites ha tenido un gran impacto en el estudio de la genética de animales, plantas y seres humanos desde su descubrimiento en 1989.^5 6

En estudios de ligamiento, al estudiar familias que presentan una enfermedad concentrada, se han podido describir enfermedades monogénicas u oligogénicas. De esta manera se han localizado genes como BRCA1 y BRCA2 (BReast Cancer), o el MSH2 (Melanocyte Stimulating Hormone).

Un número de muestras de ADN de especímenes deLittorina plena amplificado mediante reacción en cadena de polimerasa con cebadores dirigidos a una repetición variable de secuencia simple (SSR, también conocido como microsatélite) locus. Las muestras se han funcionado en un gel de poliacrilamida al 5% y se visualizaron mediante tinción de plata.

Pruebas de paternidad

El principio de las pruebas de paternidad utilizando marcadores moleculares consiste en la comparación del genotipo y/o fenotipo de la descendencia con el de sus progenitores. Como principio «mendeliano», uno de los alelos que presenta un individuo proviene del padre y el otro de la madre. En dicho análisis, al igual que la identificación individual, la identificación de l(os) testigo (s), tanto a nivel fenotípico como genotípico debe ser perfectamente conocida y concordante con la información obtenida en los análisis realizados al individuo.

El elevado polimorfismo que presentan los SSRs y la posibilidad de poder detectar ambos alelos los hace muy útiles para identificaciones individuales en humanos, ya que resulta muy poco probable que dos individuos elegidos al azar, si son analizados para una serie de marcadores, compartan todos sus alelos. Existen bastantes STRs que cumplan con las características necesarias para ser empleados con el fin de identificar a una persona, pero para la conformación de una huella genética única se emplean sólo 16, ampliables a 21. Con esta cantidad de marcadores es prácticamente imposible que dos personas tengan el mismo perfil genético. Para seleccionar los marcadores a utilizar, estos deberían reunir las características descritas anteriormente y presentar además: alta variabilidad, herencia estable (baja tasa de mutación), elevada reproductividad y precisión, la no presencia de alelos «nulos», ser un procedimiento fácil, rápido, económico, potencialmente automatizable, que la información del genotipo pueda ser transferida rápidamente, que la fuente de ADN no esté limitada únicamente a muestras sanguíneas frescas ni a grandes cantidades de ADN y por último, presente una segregación independiente con otros marcadores al ser combinados en la prueba.

Tradicionalmente, las pruebas de paternidad se han venido realizando principalmente a través de la tipificación sanguínea, incluyendo tanto pruebas serológicas como grupos sanguíneos (hemotipados); así como, análisis electroforéticos del polimorfismo de proteínas y enzimas sanguíneas (alozimas). Actualmente, esas pruebas han sido sustituidas por el uso de microsatélites.

La combinación de estos sistemas proporciona un 97% de probabilidad de detectar o asignar un padre o una madre correctos y cerca del 100% de probabilidad para un cruzamiento entre individuos. El desarrollo de las metodologías de análisis de DNA, y especialmente la utilización de la técnica PCR para la tipificación de microsatélites, está modificando radicalmente el campo de la identificación individual no solo en humanos sino también en animales domésticos. Es por esta razón y dado el gran número de SSRs informados para distintas especies, que la Sociedad Internacional de Genética Animal (ISAG) y la Food and Agriculture Organization (FAO) han seleccionado y estandarizado diferentes microsatélites en las distintas especies de animales domésticas (bovinos, equinos, porcinos, caninos, ovinos, caprinos) con el fin de ser empleados para estudios de identificación y para trabajos sobre diversidad genética de razas domésticas.^{7 8 9 10 11 12}

Un perfil parcial STR genético humano obtenido usando el kit identificador Applied Biosystems. Dos últimas líneas (colorantes amarillo y rojo) cuando se ve en ID GeneMapper. El eje X representa la longitud de los fragmentos de STR, el eje Y es la intensidad de la señal.

Cartografía genética

Otra aplicación, de los microsatélites es la construcción de mapas de ligamiento más completos y detallados; así como la identificación de genes de interés (QTL´s).

Todos los marcadores pueden ser utilizados para realizar mapas de ligamiento; sin embargo, se requiere, que los alelos se segreguen independientemente y que además puedan ser monitoreados a través del pedigrí. La descendencia puede ser informativa si los progenitores son doble heterocigotos en los loci analizados. Los loci situados en cromosomas distintos podrían recombinarse libremente durante la gametogénesis parental hasta un 50% (segregación independiente); mientras que, si se encuentran en el mismo cromosoma recombinarían con una frecuencia que oscila entre 0 a 50% dependiendo de la distancia en centimorgans (cM) presente entre ellos. Así, un mapa genético bien surtido de marcadores se convierte en una herramienta muy útil para identificar genes responsables de caracteres de interés. Se trata de buscar asociación entre varios alelos, en cualquiera de los marcadores, segregando en poblaciones que presentan el carácter de interés, para identificar regiones del genoma donde es más probable que se encuentre el gen responsable de ese carácter.^13 14

Criminalística

Además de las anteriores aplicaciones que presentan, los STRs también pueden emplearse en investigación forense, ya que con muy poca cantidad de ADN se puede obtener un perfil genético adecuado. Esto permite la identificación de muestras que se encuentren en lugares del crimen, además de la generación de una base de datos con los perfiles genéticos de los delincuentes que han sido fichados por la policía.

A la hora de comparar dos perfiles genéticos, es importante tener en cuenta cuál sería la probabilidad de que el perfil genético encontrado en la escena del crimen provenga de una persona aleatoria de la población. Esto es especialmente importante en el caso de que cuentes con perfiles genéticos parciales, es decir, que no contengan el mínimo de 16 STRs legislados para los seres humanos. Si tenemos un sospechoso que queremos comparar con el ADN de la escena del crimen, debemos estar seguros que las muestras coinciden. La probabilidad de que los 16 STRs de una muestra coincidan con las de otra es de 1x10^-18, lo cual nos da una idea de lo fiable que es este método de identificación.

La legislación acer

ca del almacenaje y del trato de esta información varía de unos países a otros, encontrándonos casos en los que esa información permanece en los archivos de la policía de forma indeterminada u otros en los que se elimina al cabo de cierto tiempo o cuando la persona se ha probado inocente. También son variables los motivos por los que entra esta información en estas bases de datos, pudiendo añadirse en el momento en el que se considera sospechosa a una persona o esperar a la resolución del juicio para determinar su entrada o no.