Tal como sugiere el acrónimo VNTR, la variabilidad o diferencias entre los alelos VNTR está en el "número de repeticiones en tándem".Una repetición en tándem es una secuencia corta de ADN que se repite consecutivamente, cabeza con cola, en un locus cromosómico específico. Se encuentran repartidas por todo el genoma humano. Algunas secuencias se encuentran en un solo sitio --un locus único-- del genoma. Para muchas de las repeticiones en tándem, el número de unidades repetidas varía entre individuos; tales loci se llaman VNTRs. Un ejemplo de VNTR en humanos es una secuencia de ADN de 17 pb que se repite entre 70 y 450 veces en el genoma. El número total de pares de bases en ese locus puede así variar entre 1190 y 7650.
El diagnóstico indirecto
El diagnóstico indirecto es independiente del conocimiento previo de la naturaleza molecular de la mutación a diagnosticar y para llevarlo a cabo solo es preciso conocer la localización cromosómica del locus implicado. Dicha estrategia consiste en estudiar, en la familia del propositus, la segregación conjunta de la enfermedad y secuencias polimórficas físicamente próximas (ligadas) al locus de la misma.
El ADN es una molécula lineal en la que las secuencias de nucleótidos se hallan contiguas y distribuidas a lo largo de la doble hélice en un mundo de una dimensión. Existe pues una relación física de proximidad entre secuencias de ADN. Dicha relación de continuidad puede alterarse durante el proceso de la división meiótica que se presenta durante la formación de las células germinales. En la profase de la primera división meiótica, los cromosomas homólogos (uno proveniente de la línea paterna y el otro de la línea materna) intercambian material por el proceso de entrecruzamiento. El resultado final es tal que los cromosomas de la célula germinal madura (espermatozoide u óvulo) presentan nuevas combinaciones de las secuencias existentes en la célula original (nuevos recombinantes). Dada la relación física existente entre secuencias adyacentes en un mismo cromosoma, la frecuencia en que dos de estas secuencias se transmitan (segregan) independientemente de una generación a la siguiente es directamente proporcional a la distancia que las separa. Es decir, cuanto menor es la distancia que separa a dos secuencias de ADN, menos probable es el entrecruzamiento entre ellas y por lo tanto segregarn independientemente con una menor frecuencia. Cuando se da esta situación decimos que ambas secuencias están ligadas.
El ligamiento entre secuencias de ADN se establece mediante el estudio de la segregación de los alelos de dichas secuencias en genealogías. Este tipo de estudios permiten la obtención del mapa genético de una determinada región cromosómica. Dicho mapa contendrá puntos de referencia al estilo de un mapa de carreteras. Así, mientras que el mapa de carreteras nos informa de la posición de pueblos y ciudades, el mapa genético contendrá información sobre la posición de los genes. Además de pueblos y ciudades el mapa de carreteras contiene otros puntos de referencia orientativos como pueden ser un cruce de carreteras, un puerto de montaña o una vista panorámica. Dichos puntos de referencia son fundamentales para orientarse a lo largo de la carretera. Su equivalente en el mapa genético serán por ejemplo los puntos de rotura de una determinada translocación o las secuencias polimórficas repartidas a lo largo de la molécula de ADN..
Secuencias polimórficas
Como su nombre indica, las secuencias polimórficas (también conocidas como secuencias anónimas, loci anónimos, loci polimórficos, marcadores anónimos o marcadores polimórficos) son secuencias de ADN que, normalmente, no codifican para un producto génico, se distribuyen de forma más o menos aleatoria a lo largo del genoma y presentan como característica singular el hecho de ser polimórficas. Este último hecho es de suma importancia pues confiere a este tipo de secuencias la característica primordial del análisis genético, la variabilidad.
Las variantes de un locus es lo que conocemos como alelos. Ya hemos utilizado este concepto anteriormente al hablar de los alelos de loci implicados en enfermedades (el alelo _508 de la fibrosis quística o el alelo _S de la anemia falciforme). Sin embargo, este tipo de alelos son, afortunadamente, muy poco frecuentes y no nos serían útiles en los estudios de ligamiento. Por el contrario las secuencias anónimas o loci polimórficos presentan por definición varios alelos con una frecuencia significativamente alta en la población (superior al 1% para el menos frecuente).
Supongamos que queremos saber si el locus a, que está implicado en una enfermedad hereditaria, esta ligado al locus b, que es una secuencia anónima de ADN. Lo primero que necesitaremos será identificar las variantes de la secuencia anónima en cada uno de los miembros de la familia y estudiar su segregación juntamente con la de la enfermedad. La aplicación de diversos métodos estadísticos nos permitirá establecer la existencia o no de ligamiento entre los dos loci investigados y estimar la distancia que los separa.
En los estudios de ligamiento la distancia que separa a dos loci se mide en función de la frecuencia en que ambos recombinan. La unidad de distancia es el centimorgan (cM) . Si dos loci recombinan en el 1% de las meiosis, decimos que les separa una distancia de 1 cM. La frecuencia de recombinación entre dos loci puede variar desde 0 (decimos entonces que dichos loci están íntimamente ligados) hasta el 50% y decimos entonces que son independientes. Aunque no nos podemos extender aquí sobre este aspecto, no existe siempre una relación lineal entre distancia genética (frecuencia de recombinación medida en cM) y distancia física (número de nucleótidos que las separan, medida en pares de bases). Para frecuencias de recombinación inferiores al 20% se puede establecer una relación de 106 pares de bases por cada 1% de recombinación.
Tipos de variación polimórfica en secuencias anónimas
Hemos indicado que la característica primordial de las secuencias anónimas es su variabilidad, veamos ahora en que consiste dicha variabilidad. Básicamente existen dos tipos de polimorfismos, los que derivan de la substitución de un nucleótido por otro y los que derivan de la inserción o deleción de secuencias de ADN. En estos últimos distinguimos dos subtipos: las inserciones o deleciones de fragmentos de ADN y las repeticiones de secuencias de entre dos y cientos de nucleótidos.
Polimorfismos del tamaño de los fragmentos de restricción (RFLP del inglés "restriction fragment length polymorphism").- Cuando el cambio de un nucleótido altera la diana para un determinado ER o la inserción o deleción de un fragmento de ADN se localiza entre dos dianas de un ER, podemos detectar el polimorfismo en función de la variación que éste genera en el patrón de restricción (Figura 17 ). Los RFLP son polimorfismos que presentan normalmente un número bajo de alelos y por lo tanto su utilización en el diagnóstico indirecto es limitada.
Figura 17 .- Polimorfismos del tamaño de fragmentos de restricción (RFLP). La pérdida o ganancia de una diana de restricción por efecto de la substitución de un nucleótido (A), o la inserción o deleción de un fragmento de ADN (B), pueden ser detectados por las variaciones en los tamaños de los fragmentos de restricción. En la figura se presenta el resultado esperado de este tipo de polimorfismos en individuos homozigotos para la presencia de la diana o la deleción (+ +), los homozigotos para la ausencia de diana o la inserción (- -) y los heterozigotos (+ -). El método de detección puede ser tanto hibridación y southern (esquematizado en la figura) como mediante PCR.
Polimorfismos de repetición.- Existen dos tipos de polimorfismos de repetición de uso en diagnóstico genético, los VNTR-minisatélites y los VNTR-microsatélites. En ambos casos presentan un número variable de repeticiones en tandem (VNTR del inglés "variable number of tandem repeats").
Los minisatélites son loci que corresponden a secuencias de ADN de unas pocas decenas de nucleótidos repetidas en tandem. El número de dichas repeticiones varia de cromosoma a cromosoma, de forma que en un cromosoma el número de repeticiones en tandem puede ser de 10, en otro de 15 en otro de 22, etc, etc. La singularidad más especial de este tipo de polimorfismos está en que cada loci puede presentar muchos alelos distintos (tantos como repeticiones), sin embargo presentan el inconveniente que no están distribuidos por todo el genoma y por lo tanto solo pueden ser utilizados en el diagnostico de un número muy reducido de enfermedades. Los VNTR-minisatélites han encontrado su máxima aplicación en la determinación de la paternidad y en los protocolos de identificación genética en el ámbito judicial. Cuando se habla de huellas dactilares del ADN se está hablando de este tipo de polimorfismo.
Figura 18.- Detección mediante PCR de distintos alelos de un polimorfismo microsatélite. En el ejemplo se presentan dos individuos heterozigotos para los alelos de 6 y 7 repeticiones y de 4 y 8 repeticiones del dinucleótido (CA)n. La detección se realiza mediante PCR utilizando como cebadores oligonucleótidos que flanquean a la región que contiene la repetición (flechas). De cada individuo se amplifican fragmentos de ADN que difieren entre si por el número de repeticiones. El resultado de la amplificación se fracciona en un gel de acrilamida-urea para determinar el genotipo de cada individuo.
Los VNTR-microsatélites son por excelencia los polimorfismos anónimos utilizados en el diagnóstico genético. Corresponden a la repetición en tandem de secuencias de entre 2 y 5 nucleótidos. Los microsatélites presentan dos características que los hacen ideales para su uso. En primer lugar, están distribuidos de forma casi homogénea por todo el genoma y en segundo lugar, presentan un número elevado de alelos con frecuencias similares entre sí, de forma que la probabilidad de que un individuo sea heterozigoto es muy elevada (presentan una alta heterozigosidad). Su detección se realiza normalmente mediante la técnica de PCR (Figura 17).
Aplicación en el diagnóstico indirecto de enfermedades hereditarias
El ejemplo más sencillo de aplicación de los polimorfismos anónimos en el diagnóstico indirecto lo tenemos en el caso de enfermedades ligadas al cromosoma X. Veamos el ejemplo de la Figura 19. En la familia en cuestión ha nacido un varón afectado de una enfermedad hereditaria ligada al cromosoma X. De acuerdo con el patrón de herencia, su padre presentará el alelo normal de la enfermedad, mientras que su madre será portadora, es decir heterozigota. El varón afectado habrá heredado de su madre el cromosoma con el alelo de la enfermedad y dada su condición de hemizigoto, manifestará el fenotipo correspondiente a la misma. Sin embargo no podemos predecir, más allá del modelo mendeliano, el genotipo de la hermana ni el del feto que se está desarrollando.
Supongamos que existe un locus polimórfico, tipo microsatélite, próximo al locus de la enfermedad, íntimamente ligado (frecuencia de recombinación igual a 0). Si identificamos los alelos de dicho polimorfismo en cada uno de los miembros de la familia podremos inferir el alelo del locus de la enfermedad que porta cada individuo.
En la parte inferior de la figura se presenta, de forma simplificada, el resultado obtenido al caracterizar mediante PCR el locus polimórfico. En el margen izquierdo se presenta un patrón correspondiente al número de repeticiones del dinucleótido CA (de 1 a 6) y perpendicularmente a cada individuo el alelo correspondiente a cada uno de ellos. Podemos ver que el varón afectado ha heredado de su madre el alelo de 2 repeticiones, por lo que podemos inferir que dicho alelo está junto al alelo de la enfermedad. Según ello, la hermana habrá heredado de su padre el alelo 4 del polimorfismo junto con el alelo normal de la enfermedad y de su madre el alelo 6 que también en este caso irá junto al alelo normal. Por lo tanto la hermana será homozigota para el alelo normal de la enfermedad. Siguiendo un razonamiento similar podemos inferir que el feto será una niña (presenta dos alelos del polimorfismo) y heterozigota para la enfermedad, pues ha heredado de su madre el alelo 2 del polimorfismo que como hemos indicado anteriormente está acompañado por el alelo que causa la enfermedad. La Figura 20 es una interpretación de lo anteriormente indicado.
Figura 19.- Genealogía de una familia en la que se hereda una enfermedad ligada al cromosoma X. Véase el texto.
En el ejemplo anterior hemos utilizado como marcador del locus de la enfermedad a un locus altamente polimórfico, los cromosomas paternos presentan alelos distintos y por lo tanto los podemos identificar sin ambigüedad alguna, y íntimamente ligado, es decir no existe recombinación entre ambos loci y por lo tanto el alelo del polimorfismo que en la madre va junto al alelo de la enfermedad continuará junto a éste en los cromosomas de la descendencia. Estas dos características son fundamentales en el momento de escoger un determinado polimorfismo en el desarrollo de una estrategia de diagnóstico indirecto.
Figura 20.- Representación gráfica del razonamiento aplicado para determinar los genotipos de los miembros de la familia de la Figura 19. Los varones presentan dos cromosomas distintos (un cromosoma X y un cromosoma Y). La estrella vacía indica el alelo normal y la estrella llena el alelo de la enfermedad. Cada alelo del locus del polimorfismo está indicado de acuerdo con el número de repeticiones del dinucleótido CA.
Si el marcador utilizado no presenta muchos alelos entonces pueden darse situaciones de ambigüedad cuando uno o ambos padres sean homozigotos para un determinado alelo del marcador. En este caso diremos que la familia es "no informativa" para dicho marcador y por lo tanto deberemos utilizar otro polimorfismo en el diagnóstico de dicha familia. Por otra parte, si el marcador no esta íntimamente ligado, es decir existe recombinación entre el locus de la enfermedad y el locus del marcador, el diagnóstico deberá tener en cuenta dicha posibilidad.
Veamos el siguiente ejemplo. En la Figura 21 se presenta la genealogía correspondiente a una familia en la que se hereda una enfermedad con una herencia autosómica dominante. Con una probabilidad del 50% la madre afectada transmitirá a sus descendientes el carácter. La utilización de un locus polimórfico ligado al carácter en cuestión nos permitirá establecer un diagnóstico más ajustado para el feto en desarrollo. En la Figura 21, A se muestra el resultado obtenido al analizar un polimorfismo microsatélite (repetición del dinucleótido CA). Vemos que la madre presenta los alelos 6 y 2 y el padre los alelos 4 y 7. Por su parte el hijo normal es portador de los alelos 2 y 7, el primero procedente de la madre y el segundo del padre. Si el carácter es penetrante, podemos considerar que el alelo 2 en la madre está junto al alelo normal del locus de la enfermedad. Por lo tanto, si el feto presenta el alelo 2 del polimorfismo podremos inferir que también ha heredado el alelo normal del otro locus.
Sin embargo, tal y como se presenta en la Figura 21, B, si la distancia que separa a ambos loci es tal que permite la recombinación entre ellos, es posible que el feto haya heredado de su madre el alelo 2 del polimorfismo junto con el alelo de la enfermedad, debido a la recombinación de ambos loci en la meiosis de la madre. La frecuencia con la que se presentará este segundo caso será la frecuencia de recombinación entre los loci implicados. Así, si la distancia que les separa es de 5 cM, es decir su frecuencia de recombinación es del 5%, el diagnóstico que daremos en el caso presentado en la Figura 21 será de un 95% de probabilidad de que el feto sea normal (apartado A) y de un 5% de que el feto haya heredado el alelo de la enfermedad junto con el alelo 2 del polimorfismo (apartado B).
Figura 21.- Diagnóstico indirecto de una enfermedad autosómica dominante. En A el locus del polimorfismo y el de la enfermedad no presentan recombinación. En B, el feto en desarrollo presenta un cromosoma materno en el cual se ha dado un evento de recombinación (flecha) durante la meiosis de la madre. La simbología es la misma que la utilizada en la Figura 20.
Para obtener una mayor fiabilidad en el diagnóstico se utilizan varios loci polimórficos localizados a ambos lados del locus de la enfermedad. Con ello se consiguen evitar las ambigüedades generadas por el entrecruzamiento.
La dimensión social del diagnóstico genético
Si bien este aspecto será tratado con una mayor extensión y detalle en otros capítulos del libro, no quisiera finalizar este capítulo sin abordar algunos de los aspectos ético-sociales que acompañan al diagnostico genético. En la introducción se enumeraron algunas de las características diferenciadoras de este tipo de diagnóstico respecto al diagnóstico convencional. Las diferencias no son de índole metodológica o tecnológica, dado que en los distintos ámbitos de la biomedicina la complejidad tecnológica es similar, sino que estas radican en el ámbito de sus implicaciones ético-sociales. Desearía destacar algunos de los aspectos más significativos de esta dimensión ético-social.
El primero se refiere a la relación que se establece entre el paciente y su familia. Todo diagnóstico genera en el paciente una tensión que se resuelve en un sentido positivo o negativo según sea el resultado. El diagnóstico genético no solo genera tensión en el propositus sino que toda su familia se ve implicada en él. Esta implicación no es solo de índole solidaria, la tensión en la familia obedece a una reacción primaria al verse directamente implicados en la patología como potencialmente afectados. Es por ello que el genetista debe considerar a la familia como la unidad de diagnóstico y aliviar mediante la adecuada información, la angustia y la tensión que el diagnóstico pueda generar.
El segundo aspecto hace referencia a la componente predictiva del diagnóstico genético. Sin duda alguna la fatalidad que acompaña al diagnostico positivo de una enfermedad hereditaria no tiene parangón en otras disciplinas médicas. Ello es así, porque en la actualidad la mayoría de las enfermedades hereditarias carecen de una terapia curativa. Cuando en una familia se diagnóstica un hijo con fibrosis quística no solo se esta dando una predicción sobre la progresión clínica del paciente en un futuro próximo, sino que además se esta asignando a la familia una predicción sobre futuros embarazos. Así mismo, cuando uno de los miembros de una familia es diagnosticado como afecto de una enfermedad hereditaria de manifestación tardía, los miembros jóvenes de la familia reciben una carga de angustia y tensión. Un ejemplo de esta situación lo tenemos en el diagnóstico de la enfermedad de Huntington. ¿Querrán los miembros de la familia saber cual es el diagnóstico del propositus? ¿Desearán los familiares asintomáticos ser sometidos a un diagnóstico? Estas y otras cuestiones se podrán plantear y la respuesta no es obvia.
La determinación de los factores de riesgo y el estudio de la predisposición o susceptibilidad genética es uno de los campos de futura aplicación del diagnostico genético. Sin duda alguna esto comportará grandes beneficios medico-sociales, al facilitar la medicina preventiva en enfermedades como la diabetes, la hipertensión, las enfermedades cardiovasculares u otras de carácter multifactorial, que tienen una gran prevalencia en nuestra población. Sin embargo, todo lo positivo que comporta este tipo de estudios puede verse truncado por una mala utilización de la información obtenida.
No se debe asignar rango de infalibilidad a una información de tipo probabilístico. La probabilidad de padecer la enfermedad de Alzheimer se incrementa en un factor de 8 en los individuos homozigotos para el alelo APO-_4, pero ello no implica que un individuo homozigoto para dichos alelos vaya a manifestar inexorablemente la enfermedad. Los factores ambientales, la historia natural de cada individuo, y el fondo genético tienen un papel muy importante en la manifestación fenotípica de un carácter. Resulta curioso constatar que en la actualidad los más acérrimos defensores del papel del ambiente en la ecuación: fenotipo = genotipo + ambiente, sean los genetistas.
polimorfismos en la longitud de fragmentos amplificados, más conocidos por su acrónimo inglés AFLP ("Amplified fragment length polymorphism"), son un tipo de marcador molecular que está basado en la restricción del ADN genómico mediante enzimas de restricción y en la subsecuente amplificación de algunos de esos fragmentos mediante la reacción en cadena de la polimerasa. Son una herramienta poderosa de análisis del genoma dado que poseen un alto poder de detección de lavariabilidad genética. El ensayo de AFLP combina la especificidad, resolución y poder de muestreo de la digestión con enzimas de restricción con la velocidad y practicidad de la detección de polimorfismos mediante PCR, sin necesidad de disponer de información previa del genoma a estudiar. La técnica de AFLP es propiedad de la empresa de biotecnología holandesa KeyGene.
Descripción
El ensayo de AFLP consiste esencialmente en cuatro etapas. En la primera de ellas el ADN genómico se corta o digiere con dos enzimas de restricción. Generalmente una de ellas es de corte raro (ej. EcoRI), que reconoce de 6 a 8 pares de bases y otra es de corte frecuente (ej. MseI) que reconoce 4 pares de bases. En una segunda etapa, los fragmentos de ADN doble cadena de 20 a 30 pares de bases llamados adaptadores se ligan en forma específica a los extremos de los fragmentos obtenidos en el paso anterior, generando así el molde para la amplificación posterior del ADN. En una tercera etapa se amplifican selectivamente fragmentos por PCR. En esta etapa, se utilizan iniciadores de aproximadamente 20 nucleótidos que contienen una secuencia específica complementaria a la secuencia de los adaptadores y además, de uno a tres nucleótidos selectivos adicionales de secuencia arbitraria en su extremo 3´. Dado que sólo una subpoblación de los fragmentos originales es amplificada, se obtiene un patrón de bandas que permite un registro adecuado. La amplificación descripta en la tercera etapa se realiza en dos pasos: una primera amplificación selectiva empleando un nucleótido arbitrario (amplificación +1 o preamplificación) y luego, este producto de amplificación obtenido es empleado como molde en una nueva amplificación empleando iniciadores que poseen dos nucleótidos selectivos adicionales al anterior (amplificación +3 o amplificación final). La cuarta y última etapa del ensayo AFLP involucra el análisis de los fragmentos amplificados, la cual se realiza mediante electroforesis en geles de poliacrilamida desnaturalizantes. Si uno de los iniciadores empleados está marcado radiactivamente, se visualizará mediante autorradiografía, si uno de los iniciadores está marcado con un compuesto fluorescente, puede ser resuelto empleando un secuenciador automático. Alternativamente, se puede visualizar mediante tinción con nitrato de plata.
Base genética
La base genética del polimorfismo que se observa en los ensayos AFLP, o sea, la ausencia o presencia de fragmentos amplificados de un dado tamaño, está determinada por mutaciones puntuales, inversiones, inserciones y deleciones que llevan a la pérdida o ganancia de un sitio de restricción o la alteración de la secuencia reconocida o amplificada por los iniciadores. Al igual que en los RAPDs, no es posible distinguir individuos heterocigotas por lo que se trata de un marcador dominante. Una banda AFLP se suele interpretar como un locus, definido por las dos enzimas de restricción, una combinación de cebadores o inciadores que incluyen las bases selectivas (Ej. EcoRI-ATC/MseI-AAG) y un peso molecular.
Implementación, ventajas y desventajas
La implementación del ensayo AFLP en un laboratorio requiere de una infraestructura considerable ya que es relativamente laborioso para su obtención y su costo es medio a alto. Estos marcadores presentan un alto poder de detección de la variabilidad genética, ya que se explora simultáneamente el polimorfismo de ausencia/presencia de sitios de restricción (como lo hacen los RFLP) y la ocurrencia o no de amplificación a partir de secuencias arbitrarias (como lo hacen los RAPDs).
Polimorfismos de Longitud de Fragmentos Amplificados-AFLP
Los AFLP utilizan los polimorfismos de longitud de fragmentos los cuales están amplificados por medio de la reacción en cadena de la Polimerasa (AFLP-PCR), técnica que se profundizará más adelante. Estos marcadores no dependen de los estados alélicos, ni de la expresión génica; lo cual permite el análisis de heterocigosidades, son marcadores codominantes, lo que significa que las tres posibilidades de corte se pueden apreciar en el corrido electroforético (Mueller et al, 1999). Los marcadores AFLP así como los RFLP tienen su origen en los cambios de bases en las secuencias o en los rearreglos del ADN que aparecen naturalmente. Las inserciones, deleciones o sustituciones de bases pueden ocasionar un cambio en el tamaño de los fragmentos que se ve reflejado en la distancia de desplazamientos de las bandas electroforéticas (Vos et al, 1995).
La técnica de AFLP está basada en la amplificación de subgrupos de fragmentos de restricción genómicos usando PCR. Para el análisis de los AFLP es necesario el corte con enzimas de restricción generalmente se utilizan dos enzimas, una de corte común y otra de corte menos frecuente, las mas utilizadas son EcoRI, como enzima de corte común y MseI como enzima de corte menos frecuente tanto en genomas simples como en complejos. Después de realizada la digestión, secuencias de ADN denominados Adaptadores son ligados a la terminación de los fragmentos de ADN para generar el ADN molde para la amplificación. Los adaptadores se caracterizan por poseer una secuencia núcleo (core) y una secuencia enzima-específica, las secuencias de los adaptadores y los sitios de restricción adyacentes sirven como sitios de unión para la siguiente amplificación de los fragmentos de restricción.
Para la amplificación de los fragmentos también son necesarios los cebadores (primers), los cuales se caracterizan por poseer una secuencia también denominada núcleo la cual se unirá a la secuencia del ADN molde obtenido después de ligar el adaptador con los fragmentos de restricción.
Los cebadores también presentan una secuencia enzima-especifica que será complementaria con el adaptador y una secuencia de extensión que consiste en nucleótidos de selección que se unen a la terminación 3-‘ de la secuencia a amplificar, los cuales se aparean con la cadena de ADN solamente en donde la secuencia sea complementaria, en los genomas complejos las amplificaciones se realizan con dos tipos diferentes de cebadores, en la primera amplificación (preamplificación) se unen cebadores que tienen en sus extremos solo un nucleótido de selección lo que produce un número de fragmentos menor que el obtenido en la digestión ( una reducción de 16 veces el número de fragmentos), sin embargo la gran cantidad de ADN que presentan este tipo de genomas requiere para poder analizar, una nueva amplificación, en este caso se utiliza cebadores que en sus extremos tengan tres nucleótidos de selección, lo que permitirá una reducción mucho mayor de los fragmentos ( 256 veces) y así facilitar el análisis en los geles de electroforesis |
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