Biología celular

técnicas aplicadas

FRAGMENTACION: La fragmentación o escisión, es un método de división asexual animal. El “padre” se divide en dos partes y casi siempre los individuos originados son identicos al padre. En otras ocasiones la arquitomía se realiza en sentido transversal, o sea, perpendicularmente al eje del cuerpo, como sucede en la lombriz de tierra y en las planarias que pueden dividir transversalmente su cuerpo en varios trozos, cada uno de los cuales regenera un individuo completo. 

La fragmentación rápida y regular del ADN es característica. Hay fragmentación inicialmente en trozos de 300 pares de bases y luego de 50 pares de bases con división del ADN internucleosomal de doble hebra. Esto origina fragmentos de 186 pares de bases y múltiplos de ellos (multímeros), lo cual se observa en electroforesis en gel de agarosa como el llamado "patrón en escalera". La fragmentación se produce por activación de endonucleasas dependientes de calcio. Muchos de los cambios celulares se atribuyen a la acción de enzima convertidora de interleuquina 1b y granzima B. La transglutaminasa tisular produce agregados proteicos subplasmalemales, que evitan la liberación de enzimas intracelulares particularmente dañinas.

Los genes que participan en el control de la apoptosis son p53, c-myc y bcl-2.

Técnicas de fragmentación y separación de los componentes de las células1.1.3.1. Fragmentación celular
    El fraccionamiento subcelular es un conjunto de métodos y técnicas que tienen como objetivo obtener fracciones puras o enriquecidas en un determinado componente celular, ya sea éste un orgánulo (mitocondrias, núcleos, peroxisomas, etc.) una fracción de membrana (membrana total, plasmática, dominio basolateral, dominio apical, etc.), complejos multiproteicos (citoesqueleto de actina, microtúbulos, poros nucleares, etc.).
Fases:

• Preanalítica: Obtención preparación preliminar de la muestra hasta llegar al laboratorio
• Analítica: o de aplicación de procedimientos. Toma y tratamiento de datos, recogida de resultados en un informe
• Postanalítica: Validación técnica del informe analítico.

Todo proceso de fraccionamiento subcelular tiene dos etapas :

• Rotura de las células o tejidos para obtener un lisado celular (o tisular) en el que la fracción deseada se encuentre en condiciones adecuadas para su purificación.
• Separación de la fracción deseada del resto de componentes de la célula o del tejido mediante algún criterio como puede ser una diferencia de densidad (centrifugación en gradientes o centrifugación diferencial), la presencia de algún antígeno (cromatografía de inmunoafinidad, inmunoprecipitación, etc.).

Técnicas de rotura de células y tejidos
    El primer paso en la purificación de la mayoría de las proteínas y estructuras subcelulares es la rotura de los tejidos o de las células para obtener un lisado celular en el que la proteína, el complejo multiproteico o la estructura subcelular se encuentre en condiciones que permitan su aislamiento. Esto se consigue empleando procedimientos mecánicos suaves conocidos generalmente como homogenización. Estos métodos producen la rotura de las membranas celulares, suavemente, con lo que se libera el contenido celular.
    Los procedimientos de homogenización más comunes son :

        La purificación de cada uno de los principales organelos subcelulares representó un gran logro en la Biología celular al hacer posible el estudio detallado de sus estructuras y funciones metabólicas.
        La purificación se inicia con la rotura de la pared celular, de la membrana plasmática, o de ambas. Las células deben estar suspendidas en una solución con pH y concentración de sales apropiada. Normalmente se emplea sacarosa isotónica (0,25%) o una combinación de sales similar a las de la célula.
        El proceso de fraccionamiento consta principalmente de las siguientes etapas:1. HOMOGENIZACION
       Se trata de romper las células con la ayuda de un émbolo rotatorio que se ajusta perfectamente a las gruesas paredes de un tubo de cristal especial, el homogenizador. Células anexas: primero se deben romper conexiones con otras células. Células no anexas: pueden separarse teniendo en cuenta forma, densidad o características que puedan marcarse. Existen dispositivos de homogenización en los que está calibrada la separación entre el émbolo y la pared de cristal para producir homogenizados con un tamaño de partícula determinado. Consiste en el procesamiento del  tejido y posteriormente de las células  con el fin de obtener una mezcla fluida en la cual estén todos los componentes celulares, para lo cual podemos recurrir a diversos métodos físicos.
Homogenizador de Esferas
Fragmentación celular por acción del choque de las esferas de vidrio con las células.

• Tamaño de esferas:
•  0.1 mm: Bacterias, esporas.
•  0.5 mm: Levaduras, micelio, microalgas, células animales no anexas, células tripsinizadas.
•  1.0, 2.5 mm: Cerebro, músculo, piel, hojas.

La cantidad de esferas debe ser al menos el 50% del volumen total de la biomasa-líquido.
  Homogenizador de émbolo y tubo
Potter, Potter-Elvehjem, Dunce, Ten Broeck.
Separación émbolo-pared del tubo calibrada según tamaño de partícula deseado.
Los tejidos deben ser previamente picados y se suspenden en un volumen exceso de medio (4-10 veces). Fraccionamiento de tejidos animales. Preferido en preparación de organelos subcelulares de tejidos frágiles como cerebro e hígado.  (Acción suave). Permite un mejor control de la temperatura generada por la fricción. No es eficiente en la fragmentación de microorganismos
Blenders   (Licuadora)
    Homogenización por uso de cuchillas. Proceso magnificado por uso de solventes orgánicos y/o detergentes. Cuchillas rotan a 6.000 – 50.000 rpm en un contenedor. Las muestras se pueden reducir hasta partículas de 4 micrones (análisis de citometría de flujo). Procesamiento de tejidos animales y vegetales. No adecuado para fraccionamiento de microorganismos. Homogenizados de plantas pueden sufrir oxidación enzimática.  
Homogenizador Rotor/Stator
Molinos de coloides – H. Willems. Homogenización rápida (10-60 seg.) y completa. Mecanismo de turbulencia ligera. Protección de organelos: menor velocidad y tiempo de exposición. Uso: tejidos animales y vegetales. Genera calor a niveles insignificantes. Formación de espuma y aerosoles
1.1. SHOCK OSMOTICO
        La células se hacen estallar al someterlas  a un medio hipotónico, lo cual hace que la membrana no resista la presión osmótica. Puede ocasionar el daño a las membranas de algunas organelas.No se recomienda porque en algunas Organelas se lesiona la membrana. Es utilizado para el aislamiento: Mitocondria y Cromosomas Mitóticos
1.2. MORTERO Y MANO
       Es un método convencional de rompimiento por fricción. Pueden emplearse materiales abrasivos como cuarzo, vidrio molido, arena, o materiales silíceos.  La masa celular contenida en un volumen de buffer se mezcla con un volumen de medio moledor (0.5 – 1). La fricción sobre las células genera calor que puede afectar la actividad que se desea estudiar. Actualmente se dispone de homogenizadores más sofisticados que emplean el mismo principio, pero que permiten controlar el nivel de fricción y la temperatura del proceso, son conocidos comopotters. Los principales problemas de esta técnica son: la eficiencia baja cuando se usan pequeñas cantidades de medio moledor ó cuando es baja la concentración celular; la fricción genera calor y pueden presentarse alteración en las proteínas
1.3. SONICACION
       Consiste en la aplicación de ultrasonidos a una suspensión celular. La intensa agitación producida destruye las membranas celulares. Dependiendo de la frecuencia, intensidad y energía aplicada se pueden destruir asimismo las estructuras subcelulares e incluso solubilizar complejos proteicos. Se suele aplicar en frio para evitar el sobrecalentamiento de las muestras que podría provocar la desnaturalización de las proteínas. Se transmite una corriente eléctrica a un sistema mecánico que la convertirá en vibraciones de alta intensidad generándose ondas de ultrasonido que generan millones de  burbujas microscópicas, las cuales se expanden y colapsan contra las células causando la ruptura de su membrana. Este fenómeno llamado cavitación puede incrementarse adicionando al medio finísimas esferas de vidrio.
Ultrasonificación
Generación de intensas ondas sónicas en medio líquido. Se transmite una corriente eléctrica a un sistema mecánico que la convierte en vibraciones de alta intensidad generándo ondas ultrasónicas que forman millones de microburbujas que se expanden y colapsan contra las células: CAVITACIÓN.
Choque de ondas rompe membranas y aún enlaces covalentes. Mayor acción por adición de esferas de vidrio. El Sonicador tiene dos forma de operar, por Pulsos: Las Vibraciones de ultrasonido pueden transmitirse en una solución en un rango de 0,1 a 0,9 pulsos por segundo, permitiendo una adecuada sonicación sin generación importante de calor y Continuo: Puede ser usado de forma contínua por hasta 15 minutos. Con este sistema se puede lograr la ruptura de levaduras entre 3 y 10 minutos o de E.Coli con 40 segundos. Presneta los siguientes inconvenientes: alta generación de calor  de las muestras que se mantienen en congelamiento, los tejidos duros (piel o tendón) se deben macerar previamente; se pueden generar radicales libres, el daño por oxidación de radicales libres puede minimizarse adicionando cisteina, ditiotrteitol o algún otro componente -SH en el medio. Por Radicales Libres: Lesión en membrana celular, aberraciones, cromosómicas menores y cambios de tipo Fisiológicas. Uso en Transferencia de DNA plasmídico en Protoplasmos y células intactas; con expresión temporal de un gen testigo. Flexible: Protoplasmos, Células en Suspención y en fragmentos de tejido con la misma sencillez.
1.4. COMPRESION  - DESCOMPRESION. Picador / prensa de sólidos
        Se emplea la  prensa francesa, consiste en el paso de las células a gran presion por un pequeño orificio a una cámara con presión baja, lo cual ocasiona la ruptura de las células por descompresión.
         La filtración al pasar las células a través de orificios a presión de diámetros reducidos que provocan la rotura de las membranas celulares. Preparación de extractos de tejidos animales. El tejido es prensado por una placa metálica de tamiz mientras rotan cuchillas que barren lentamente sobre la superficie de la placa. Fragmentos resultantes de 0.3 – 0.5 mm. Es paso preliminar para someter a otros tipos de homogenizador.
Compresión / Expansión
“Prensa Francesa”.  (Asociarse a Tec. Congelamiento). Material celular difícil de fragmentar. No se usa con frecuencia. Mecanismo: paso de las células de una cámara con gran presión a otra con presión baja a través de un orificio. Repetidas a Alta Velocidad. Ruptura por descompresión. (Virus, Bacterias). Unidades con capacidad de 1-40 ml. Presión 20.000  - 40.000 libras por pulgada².
1.5. CONGELAMIENTO - DESCONGELAMIENTO
        Requiere de periodos prolongados de tiempo (hasta 36 horas) para el congelamiento y descongelamiento. El líquido al  congelarse a -56° C forma cristales muy finos que rompen la célula cuando esta se descongela rápidamente a 37°C. El líquido al congelarse (-56°C) provoca la formación de cristales muy finos que rompen la célula cuando se descongela rápidamente (37°C).
Tejidos animales y vegetales y masas microbianas pueden congelarse con nitrógeno líquido y molerlos en mortero común. Aparato fracturador: pulverizador de tejidos Bessman. Fragmenta 10 mg –10 g de tejido. Procedimiento largo (36 h).
1.6. Uso de detergentes que solubilicen las membranas celulares.
2. SEPARACION DE LOS ORGANELOS
        La separación puede ser llevada a cabo empleando la centrifugación. Manejando las variables  fuerza centrifuga y tiempo podemos separar primero los organelos de mayor tamaño como el núcleo. En centrifugaciones sucesivas de mayor fuerza gravitacional y mayor tiempo obtendremos las diferentes fracciones de nuestro interés. La  etapa final es la obtención del citosol que  es un líquido complejo el cual contiene los elementos del citoesqueleto yentre el 25 - 50% de las enzimas celulares.
        De acuerdo a la ley de Stokes, tambien podemos separar las organelas de acuerdo a sus densidades relativas con respecto a un gradiente de densidades. En la tabla No 1 se presentan  las densidades de algunas organelas típicas.
DENSIDADES DE ALGUNOS ORGANELOS TIPICOS

COMPONENTE                                                     DENSIDAD  (g/cm³)
RETICULO ENDOPLASMICO RUGOSO                           1,20
VESICULAS DE GOLGI                                                     1,14
MEMBRANA PLASMATICA                                              1,12

3. VERIFICACION DE LA PUREZA DE LOS ORGANELOS SEPARADOS
3.1. MORFOLOGIA
    Se verifica la pureza mediante microscopía electrónica
3.2. MARCADORES ENZIMATICOS:
    Cada organela presenta unas enzimas exclusivas, las cuales pueden ser empleadas como marcadores de su pureza. La tabla nos presenta algunos ejemplos de marcadores enzimaticos de algunos organelos.

ACTIVIDAD ENZIMATICA EN ALGUNOS ORGANELOSORGANELA                         ACTIVIDAD ENZIMATICA
MITOCONDRIAS                    CITOCROMO C
PEROXISOMAS                        CATALASA
LISOSOMAS                      FOSFATASA ALCALINA

3.3. METODOS INMUNOQUIMICOS
        Se pueden obtener grados máximos de pureza en los organelos y macromoléculas mediante técnicas de separación como  la cromatografía de afinidad.

Centrifugación diferencial.

        La centrifugación es un método que utiliza la propiedad de sedimentación de partículas con base en la masa de las moléculas para la separación de partículas de una solución. Una vez obtenido el lisado o homogenado celular se ha de proceder a su fraccionamiento. Una de las técnicas más empleadas es la centrifugación. Se basa en hacer girar el tubo a gran velocidad de forma que se produzca la acumulación en el fondo del mismo de las partículas que tienden a hundirse por tener una densidad menor que la del medio en que se encuentran. Así, después de la centrifugación la muestra, homogénea, se habrá separado en dos fracciones : sobrenadante (supernatant), fracción homogénea que no ha sedimentado, y el sedimento (pellet) que ha quedado adherida al fondo del tubo.
        La fuerza centrífuga es aplicada a cada partícula de la muestra la cual será sedimentada en un índice que es proporcional a la fuerza centrífuga aplicada.Centrífuga
    Las centrífugas son instrumentos que permiten someter a las muestras a intensas fuerzas que producen la sedimentación en poco tiempo de las partículas que tienen una densida mayor que la del medio que las rodea. En general se diferencian en función de los márgenes de aceleración a que someten a las muestras en : centrífugas (de pocas g a aprox. 3000 g), super-centrífugas (o centrífugas de alta velocidad, rango de 2000 g a 20000 g) y ultracentrífugas (de 15000 g a 600000 g). En las centrífugas se suele controlar la temperatura de la cámara para evitar sobrecalentamiento de las muestras debido a la fricción. En las ultracentrífugas, la velocidad extrema (más de 100000 rpm), hace que sea necesario hacer un intenso vacio en la cámara de la centrífuga para evitar el calentamiento de rotor y muestra.
    En una centrífuga el elemento determinante es el rotor, dispositivo que gira y en el que se colocan los tubos. Existen varios tipos :

• Rotor basculante. Los tubos se colocan en un dispositivos (cestilla) que, al girar el rotor, se coloca en dispocisión perpendicular al eje de giro. Así pues los tubos siempre giran situados perpendicularmente al eje de giro.
• Rotor de ángulo fijo. Los tubos se insertan en orificios en el interior de rotores macizos. El caso extremo es el de los rotores verticales en los que el tubo se sitúa paralelo al eje de  giro. Este tipo de rotores es típico de ultracentrífugas y se emplea en separaciones de moléculas en gradientes de densidad autogenerados (por ej. de cloruro de cesio).

Los parámetros a tener presentes en cualquier centrifugación, que determinarán las condiciones son :

• Volumen de solución a centrifugar, que determinará el tipo de tubos y rotores a emplear.
• Naturaleza química de la solución, que determinará la naturaleza del tubo a emplear
• Diferencial de densidad entre la partícula a sedimentar y la densidad del medio en el que se encuentra. En general cuanto mayor sea esa diferencia antes (menor tiempo y menor fuerza de aceleración) sedimentará. Cuando el diferencial es muy pequeño se pueden aplicar centrifugaciones de cientos de miles de g durante horas.

    Todo rotor tiene unas propiedades que determinan las condiciones en que se podrá centrifugar la muestra. Son especialmente importantes el ángulo de giro, el radio mínimo, medio y máximo, y la velocidad máxima de giro. La relación entre la velocidad de giro, medida en revoluciones por minuto (rpm) y la fuerza de aceleración (fuerza centrífuga relativa, RCF : relative centrifuge force) a que se somete la muestra (g) se recoge en la expresión siguiente :
RCF = 1.118 * 10^-5 * r * (rpm)² NOTA: Si usted desea conocer el valor en gravedades de las rpm, se aplica la fórmula de fuerza de centrifugación relativa:Centrifugación diferencial
    La centrifugación diferencial se basa en la existencia de diferentes partículas en la suspensión que difieren en su densidad de la del medio. Si se centrifuga en condiciones suaves (poco tiempo, poco fuerza de aceleración) sedimentarán las partículas mayores y/o más densas. Cuando el sobrenadante de la primera centrifugación es centrifugado de nuevo en condiciones de mas tiempo y más fuerza de aceleración sedimentan de nuevo las partículas más densas presentes  y así sucesivamente. Se pueden aplicar condiciones crecientes de severidad en la centrifugación y obtener una colección de sedimentos que corresponden sucesivamente a fracciones de partículas de diferente tamaño y/o densidad.
SEDIMENTACION
        La sedimentación es el transporte de partículas en un campo de fuerza de centrifugación. Permite determinar peso molecular, densidad y forma de macromoléculas y organelos celulares.
Coeficiente de sedimentación
        Los principios básicos de la teoría de sedimentación, se originan de la ley de Stokes, la cual fue creada para medir la sedimentación de una esfera en un campo gravitacional, para así mostrar que la velocidad de la esfera alcanza un valor constante y la fuerza neta en esta es igual a la fuerza de resistencia de este movimiento a través del líquido.
Coeficiente de sedimentación 1 dr S = ----- X ------
                                                                    W² r dt
W : velocidad del rotor
Dr/dt : índice de movimiento de dos partículas (cm/s)
Velocidad de sedimentación
    Alternativamente es posible aprovechar esa diferencia en la velocidad necesaria para sedimentar las partículas para realizar una centrifugación en un medio en el que exista un gradiente de densidad, siendo menor en la parte superior y mayor en la inferior. Después de un tiempo las diferentes poblaciones de partículas se sitúan en diferentes profundidades del tubo. Haciendo un pequeño orificio en el fondo del mismo se pueden recoger diferentes fracciones que contengan a las distintas poblaciones separadas.
    Este es el fundamente de la ultracentrifugación preparativa, que permite determinar la velocidad de sedimentación de una partícula (medida en unidades Svedverg, S).
        Los coeficientes de sedimentación son usualmente expresados en Sveldbergs (S) o 10^-13s. De esta manera, una partícula cuyo coeficiente de sedimentación es medido en 10^-12s.= 10x10^-13s., es decir que tiene un valor de 10S.
Una partícula en un campo gravitacional se comporta según la LEY DE STOKES
                                d2 ( h_P - h_L )
                    V  =   ____________  x g
                                      18 n
Donde:   V = velocidad de sedimentación
              d  = diámetro de la partícula
           h_P = densidad de la partícula
           h_L = densidad del líquido
           n  = viscosidad del medio
              g  = fuerza gravitacional
Se cumple:
- La velocidad de sedimentación es proporcional al tamaño de la partícula
- La velocidad de sedimentación es proporcional a la diferencia entre la densidad del medio circundante y la densidad de la partícula
- La velocidad de sedimentación es 0, cuando la densidad de la partícula e igual a la densidad del medio circundante
- La velocidad de sedimentación disminuye  al aumentar la viscosidad del medio
- La velocidad de sedimentación aumenta al aumentar la fuerza del campo centrífugo
        El coeficiente de sedimentación es una constante caractéristica de cada organelo o macromolécula y sus unidades se dan en Svedvergs, tomando el nombre de su descubridor.
        El tiempo de centrifugación hasta la clarificación de una organela se define por:
                    K
T (horas) =  ---
                    S Donde:  S= coeficiente de sedimentación de la organela
             K= constante del rotor. ( depende del ángulo de inclinación del tubo de centrifugación con respecto al eje de rotación)
 
 
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