Biología celular

técnicas aplicadas

La centrifugación se puede llevar a cabo a escala preparativa o escala analítica. La primera se utiliza para aislar partículas para su aprovechamiento posterior y la segunda permite determinar propiedades físicas como la velocidad de sedimentación o el peso molecular.

La centrifugación preparativa se utiliza para separar partículas según la velocidad de sedimentación (centrifugación diferencial), la masa (centrifugación zonal) o la densidad (centrifugación isopícnica). En el primer caso se obtiene un líquido sobrenadante y un materioal sedimentado. En los otros dos casos las patículas se distribuyen en fracciones de diferentes densidades de un fluido líquido (centrifugación mediante un gradiente de densidades).

Las partículas se pueden separar en función de la velocidad de sedimentación (centrifugación diferencial), la masa (centrifugación zonal) o la densidad (centrifugación isopícnica). La centrifugación zonal y la centrifugación isopícnica constituyen ejemplos de centrifugación mediante un gradiente de densidades. 

Hay diferentes tipos de centrífugas según el rango de velocidades de giro:

A. Centrífugas de baja velocidad, de sobremesa o clínicas. De pequeño tamaño y sin refrigeración. Alcanzan una velocidad máxima de 5000 rpm. Son Útiles para la separación de partículas grandes como células o precipitados de sales insolubles.

Las centrífugas micrófugas son una variante de las anteriores que permiten llegar a velocidades de más de 10.000 rpm, Los volúmenes de trabajo son muy pequeños. Son útiles en el campo de la biología molecular.


B.  Centrífugas de alta velocidad. Alcanzan velocidades de entre 18.000 y 25.000 rpm. Son refrigeradas y algunas tienen sistema de vacío para evitar el calentamiento del rotor a causa del rozamiento con el aire. Son útiles en la separación de fracciones celulares, pero insuficientes para la separación de ribosomas, virus o macromoléculas en general.

C.  Ultracentrífugas. Superan las 50.000 rpm, por lo que tienen sistemas auxiliares de refrigeración i de alto vacío. Hay ultracentrífugas analíticas que permiten la obtención de datos precisos de propiedades de sedimentación (coeficientes de sedimentación, pesos moleculares), y preparativas, útiles para aislar partículas de bajo coeficiente de sedimentación (microsomas, virus, macromoléculas).

11.2.1 Centrifugación diferencial

Es el proceso que tiene como resultado la obtención de un sobrenadante y un material sedimentado. 

11.2.2 Centrifugación mediante un gradiente de densidades:

Este tipo de centrifugación es un proceso mediante el cual las partículas se distribuyen en fracciones de diferentes densidades de un fluido líquido. El método es un poco más elaborado que la centrifugación diferencial, no obstante presenta ventajas que compensan el trabajo añadido. La técnica permite la separación de varios o todos los componentes de la muestra y la realización de medidas analíticas. El método de gradiente de densidades implica la utilización de un soporte fluido cuya densidad aumenta desde la zona superior a la inferior. El gradiente se consigue con un soluto preferiblemente de baja masa molecular, de tal manera que la muestra a analizar pueda ser suspendida en la solución resultante. Como solutos se utilizan la sacarosa, polisacáridos sintéticos, derivados yodados del ácido benzoico, o sales de metales alcalinos pesados como el rubidio o el cesio, entre otros. La muestra se deposita en la parte superior del gradiente como una fina banda y, tras centrifugar, la separación de los componentes de la muestra se presenta como diferentes bandas o zonas que pueden ser separadas (o fraccionadas). 

Hay dos variantes de este método, la centrifugación zonal y la centrifugación isopícnica: 

11.2.2.1 Centrifugación zonal

En la centrifugación zonal la muestra a analizar se deposita en la parte superior de un gradiente de densidades previamente formado. A causa de la fuerza centrífuga las partículas se mueven a velocidades que dependen de la masa y sedimentan en diferentes zonas del gradiente. La densidad máxima del gradiente no ha de exceder a la de las partículas a separar.

11.2.2.2 Centrifugación isopícnica

La centrifugación isopícnica separa les partículas en un gradiente de densidades en función de la densidad de las mismas. Las partículas se mueven en el gradiente hasta que llegan a un punto donde la densidad de éstas i la del gradiente son idénticas (de aquí el nombre de ‘isopícnico’). En este caso, es condición fundamental que la densidad máxima del gradiente final ha de exceder siempre a la densidad de las partículas. Por este motivo la sedimentación final no se produce si se controlan las condiciones de centrifugación, ya que las partículas flotan sobre un "colchón" de material que posee una densidad superior a la de éstas. Esta técnica se utiliza, por ejemplo, para separar partículas similares en tamaño pero de diferente densidad. En este sentido, la centrifugación isopícnica es un método adecuado para separar ácidos nucleicos o diferentes orgánulos celulares. 

Existen dos métodos de separación en centrifugación:

A.- Centrifugación diferencial.
B.- Centrifugación en gradiente de densidad.

Coeficiente de sedimentación (s)

La velocidad de sedimentación de una partícula depende del campo centrífugo aplicado. Es un parámetro útil para caracterizar una partícula y puede ser determinada en una ultracentrífuga.

Se define coeficiente de sedimentación (s) como la velocidad de sedimentación por unidad de fuerza centrífuga. Esta depende de la masa y densidad de la partícula, de la densidad del medio y del coeficiente de fricción, que depende a su vez de la forma de la partícula. El coeficiente de sedimentación(s) es directamente proporcional a la masa de la partícula (m) e inversamente proporcional al coeficiente de fricción (f) de la misma.

S α m/f

La unidad se denomina Svedberg, (S)

1 S= 10-13 seg., en H2O a 20 ºC

La centrifugación diferencial

En este método, el tubo de centrífuga se llena con una mezcla uniforme problema. Tras la centrifugación se obtienen dos fracciones: un pellet que contiene el material sedimentado y un sobrenadante con el material no sedimentado. Es una técnica muy útil, sobre todo para aislamiento de células y orgánulos subcelulares. Es un tipo de separación logrado en base al tamaño de las partículas.

Esta técnica consiste en someter a una muestra heterogénea de partículas a fuerzas de centrifugación crecientes por períodos de tiempo crecientes. Los precipitados obtenidos luego de cada centrifugación estarán enriquecidos en una determinada partícula.

Para lograr la separación, los coeficientes de sedimentación de las partículas deben diferir en al menos un factor de tres (moléculas con s mayores precipitan primero).

La centrifugación en gradiente de densidad

El método de gradiente de densidad implica la utilización de un soporte fluido, cuya densidad aumenta desde la zona superior a la inferior. El gradiente se consigue con un soluto preferiblemente de baja masa molecular en un solvente en el que la muestra a analizar pueda ser suspendida. La muestra se sitúa en la parte superior del gradiente como una fina banda. La separación de los componentes de la muestra se presenta como diferentes bandas o zonas. Existen dos variaciones dentro de la centrifugación en gradiente de densidad:

• Centrifugación de equilibrio en gradiente o isopícnica
• Centrifugación zonal

Estas técnicas permiten la separación de partículas y moléculas que difieren en masa o densidad.

La centrifugación de equilibrio en gradiente o isopícnica

La centrifugación de equilibrio en gradiente separa las partículas con base en sus densidades diferentes. En esta técnica la muestra es disuelta en una solución isocrática y bajo la fuerza centrífuga el soluto forma el gradiente al distribuirse en el tubo durante la centrifugación, a esto se le denomina autoformado. La condición fundamental es que la densidad máxima del gradiente final debe siempre exceder a la densidad de las partículas. La centrifugación de equilibrio en gradiente permite que las especies sedimentantes se muevan por el gradiente hasta que alcanzan un punto donde su densidad y la del gradiente son idénticas, por lo cual también se le llama centrifugación isopícnica. En este punto no se producirá una sedimentación posterior debido a que flotan sobre un "colchón" de material que posee una densidad superior que la suya propia, de tal manera que, aunque se prolongue el tiempo de centrifugación, las partículas no van a ir al fondo del tubo. La densidad de la partícula en ese punto se conoce como “buoyant density”. Esta técnica se emplea para separar partículas similares en tamaño pero distintas en densidad. Esto es cierto para moléculas, tales como ácidos nucleícos, así como diferentes orgánulos celulares.

Se requieren las siguientes características en los solutos usados para formar el gradiente: bajo PM (de manera que el tiempo requerido para lograr el equilibrio sea corto), bajo grado de ionización, baja viscosidad y alta densidad, transparencia a la luz UV y ser buen solvente para las moléculas que se intentan resolver. Frecuentemente se usa CsCl, el Cs+, por ser un ión compacto, sedimenta lentamente en los altos campos gravitacionales aplicados durante la centrifugación y se establece un gradiente con la mayor concentración en el fondo del tubo (el ión Cl- lo sigue de manera de mantener la neutralidad de las cargas). Por otro lado, el Cs+ se une a los fosfatos del DNA y RNA y a los grupos OH- de las ribosas de manera que la densidad de las moléculas de RNA se incrementa más que la del DNA. La densidad aproximada en CsCl de proteínas es 1.3 g/ml; del DNA 1.6-1.7 g/ml y del RNA es 1.75-1.85 g/ml. Los gradientes de CsCl permiten separar moléculas cuyas densidades difieren en por lo menos 0.02 g/ml.

En los medios de separación suelen incluirse también Hg++ o Ag+, con el propósito de aumentar las diferencias entre las densidades de las moléculas (a pH neutro el Hg++ se une a T y A, y el ión Ag+ se une a G y C). El agregado de compuestos intercalantes como el bromuro de etidio permiten separar moléculas de DNA de distinta conformación aunque tengan la misma composición de bases.

Centrifugación en gradiente de densidad.

    Es un sistema que se suele realizar empleando la ultracentrífuga. Consiste en la separación de las partículas en función de su densidad de flotación. La muestra se dispone por encima o se mezcla con un gradiente de densidad más pronunciado que el del caso anterior, y que contiene una concentración muy elevada de sacarosa o de cloruro de cesio. Al centrifugar cada componente subcelular se desplazará hacia arriba o hacia abajo hasta que alcance una posiciónen la que su densidad sea igual a la de su entorno (situación de flotabilidad neutra) y ya no se desplazará más. Como consecuencia se producirán una serie de bandas discretas, las más próximas  al fondo del tubo contendrán las partículas con mayor densidad de flotación. Este método también se conoce como equilibrio en gradiente de densidad.    Se emplean diferentes sustancias para conseguir los gradientes de densidad, como son sacarosa, percol, cloruro de cesio, etc. Los gradientes pueden ser autogenerados como es el caso de los basados en cloruro de cesio en que se forman en el propio proceso de centrifugación, o preformados como es el caso de la sacarosa o del percol. En este último caso la preparación se realiza antes de la centrifugación mediante un formador de gradientes, dispositivo que consiste en dos cubetas conectadas por la base y con agitación         en las que se colocan las soluciones con los dos extremos de concentración. A medida que se va sacando de una de ellas la otra reemplaza el líquido extraido y modifica linealmente la concentración.
    Una alternativa es la centrifugación en gradiente discontinuo, en la que se crea un gradiente por etapas en el interior de un tubo al apilar sucesivamente volúmenes homogéneos de soluciones de diferente densidad. En las interfases de las diferentes capas se acumularán las partículas que flotan (son menos densas) en la capa inferior pero que se hunden (son más densas) en la capa superior.
        En la centrifugación por gradiente de densidad, la separación de una muestra se logra por sedimentación a través de un gradiente de densidad, esto es, una solución que incrementa en densidad desde la parte superior hacia la inferior del tubo de centrifuga. Dos aproximaciones distintas son posibles usando esta técnica; centrifugación zonal y centrifugación de equilibrio en gradiente.
        La centrifugación de equilibrio en gradiente separa las partículas con base en sus densidades diferentes, la muestra puede ser cargada directamente sobre un gradiente de densidad preformado y la centrifugación llevada a cabo. Mientras en la centrifugación zonal la densidad del gradiente no debe exceder a la de las partículas a separar, en la centrifugación de equilibrio en gradiente la condición fundamental es que la densidad máxima del gradiente final debe siempre exceder a la densidad de las partículas (1, 2).
        La centrifugación de equilibrio en gradiente permite que las especies sedimentantes se muevan por el gradiente hasta que alcanzan un punto donde su densidad y la del gradiente son idénticas, por lo cual también se le llama centrifugación isopícnica. En este punto no se producirá una sedimentación posterior debido a que flotan sobre un "colchón" de material que posee una densidad superior que la suya propia.
        Esta técnica se emplea para separar partículas similares en tamaño pero distintas en densidad. Puesto que la mayoría de las proteínas poseen casi la misma densidad, este método no se suele utilizar para su separación. Sin embargo, en situaciones donde intervienen diferentes densidades, la centrifugación isopícnica es el método adecuado. Esto es cierto para moléculas, tales como ácidos nucleicos, así como diferentes organelos celulares (3).
Diseño especifico de un gradiente de densidad
        Un buen resultado en el aislamiento de unas moléculas en particular mediante la centrifugación en gradiente de densidad requiere una consideración cuidadosa de los parámetros del gradiente de densidad. Estos parámetros incluyen

• El material que se emplea para establecer el gradiente. Es un solvente distribuído con diferentes concentraciones en una columna en donde la parte apical es la positiva por contener el solvente con mayor densidad.
• El fluído del gradiente de densidad consiste de un adecuado soluto de bajo peso molecular en un solvente en el cual las partículas de las muestras pueden ser suspendidas.
• La fuerza iónica
• La viscosidad
• Las características osmóticas
• La pendiente del gradiente
• El pH
• La presencia de agentes estabilizantes tales como mercaptanos; EDTA, substratos enzimáticos y Magnesio.

      La solución de una muestra contiene partículas para ser separadas en capas o zonas en una columna de gradiente de densidad elaborado. Las moléculas y organelos son separados de acuerdo a su masa y forma. Dentro de los materiales que se utilizan están la sacarosa, la cual permite formar disoluciones con una densidad de hasta 1.28 g/cm³, el glicerol que puede emplearse a densidades inferiores a 1.15 g/cm³, el ficoll, la metrizamida con capacidad para generar densidades de hasta 1.45 g/cm³, el cloruro de cesio con un rango de densidades hasta de 1.7 g/cm³, el sufato de cesio, y el percoll entre otros.
        Es importante tener presente que el material que se use sea inerte o al menos no tóxico para el material biológico, las propiedades fisicoquímicas deben conocerse antes de usarse para determinar la concentraciones precisas del gradiente además debe facilitar la separación de la muestra del material sin pérdida de la muestra o su actividad. (1, 3) Elaboración

Preparar la solución stock del gradiente.

Realizar las diferentes diluciones para establecer una escala de densidad y concentración consecutiva del gradiente.

Determinación de la concentración y volúmen de la muestra.

Disposición del gradiente a partir del que tiene mayor a menor densidad de forma sincrónica.

Disposición de la muestra.

Consideraciones para elaborar un gradiente de densidad:

Poseer un amplio rango de densidad.

No afectar la actividad biológica de la muestra.

No hipo o hiperosmótica.

Fácil remoción a partir del producto purificado.

No sea sensible al rango de luz UV y visible.

Económico y accesible.

Esterilizable.

No corrosivo, tóxico e inflamable.

        El gradiente más usado es el de sacarosa ya que es un medio resistente porque es poco viscoso y polar.
        Básicamente, el índice de migración en un medio resistente depende del movimiento de la partícula en el medio y la fuerza debido a la fuerza centrípeta o de gravedad.Tipos de gradientes
Gradientes lineales
        Son aquellos en los que la densidad aumenta linealmente con el incremento en la distancia desde el centro de rotación, pueden ser continuos o discontinuos, estos últimos se usan para incrementar la capacidad de un gradiente bien definido o para efectuar una separación mayor de dos especies.
        Aunque estos tipos pueden emplearse aportando grandes ventajas, deben usarse con cuidado y discriminación. Los gradientes discontinuos se forman colocando con cuidado en capas las disoluciones de densidades distintas en los tubos de centrifuga.
        El método más ampliamente usado para producir gradientes discontinuos es comenzar con la solución más densa y colocarlos en capas de menor densidad sucesivamente, existe la posibilidad de carga por arriba usando una pipeta, una jeringa o una pipeta Pasteur, teniendo siempre precaución en la forma como se coloca y evitando la formación de aire que cause turbulencia sobre los gradientes formados. (figura 1)
 Figura 1. Formación de un gradiente discontinuo desde arriba (A) Con pipeta; (B) Con jeringa; (C) Con pipeta Pasteur. Aunque el método de carga por arriba es probablemente el más usado, existe también la posibilidad de carga por abajo colocándose soluciones más densas por debajo de las menos densas (figura 2).
Figura 2. Formación de un gradiente discontinuo desde abajo(A-B)Punta de cánula de metal en jeringa hacia el fondo del tubo; (C) Solución más densa colocada lentamente por debajo de las capas más livianas; (D) La cánula es retirada contra la pared del tubo.
Los gradientes continuos pueden ser hechos a partir de gradientes discontinuos, de tal manera que los limites de forma entre las capas comienzan a desaparecer en la medida que los solutos difunden, así las discontinuidades comienzan a linearizarse y en un tiempo suficiente la densidad se volverá completamente uniforme. (figura 3).  Figura 3.Formación de un gradiente continuo a partir de un discontinuo por difusión.(línea punteada) gradiente escalonado en un tiempo cero; la difusión progresivamente suaviza el escalonado (azul, verde), para producir un gradiente lineal (rojo).

Una forma de hacerlo es rotando cuidadosamente el tubo de una posición vertical a una horizontal, bajo estas condiciones un gradiente discontinuo se convertirá en continuo en menos de 1 hora (figura 4). Figura 4. Formación de un gradiente continuo a partir de un discontinuo por difusión posterior a reorientación
 
 
 

Gradientes no lineales
        No siempre es deseable usar un gradiente lineal, en algunos casos para la resolución particular de algunas especies sedimentantes puede ser deseable un perfil convexo, cóncavo, complejo o en forma de S (figura 5); los gradientes convexos son particularmente útiles para la resolución de una muestra que contenga alta concentración de partículas de un amplio rango de densidades o viceversa puede utilizarse uno cóncavo. Para generar este tipo de gradientes es posible utilizar cámaras continuas (figura 6) o mezcladores de gradientes los cuales permiten la formación de hasta seis gradientes de una sóla vez. (figura 7)
Figura 5. Perfiles de gradientes de densidad no lineales. Gradiente convexo (rojo), gradiente en forma de S (púrpura), gradiente complejo (azul) y gradiente cóncavo (verde).
 
 
 
 
 
 
 
 

Figura 6. Cámara doble fabricante de gradientes continuos. El liquido denso en cámara A se mezcla continuamente con el liquido menos denso en cámara B. Flujo producido por bomba peristaltica (P) la cual coloca el liquido cada vez más denso en el fondo del tubo de centrifuga. La llave (T) controla el flujo del liquido de A a B . La mezcla en la cámara B se da con un plancha agitadora (M) y un magneto (SB). Mezclador de gradientes
Recolección de los gradientes
        Una vez se han separado una serie de especies moleculares u organelos en un gradiente de densidad, es importante recuperar los componentes separados. El modo de recolección depende del tipo de tubo usado para el gradiente, la distribución de las partículas en el gradiente y el objetivo del fraccionamiento.
    Se pueden utilizar jeringas, pipetas Pasteur o bombas peristalticas y se puede hacer por punción si el tubo esta construido con policarbonato (figura 8), es posible recolectarlo con desplazamiento ascendente (figura 9) o con desplazamiento descendente. Figura 8. Descarga del gradiente por punción del tubo. El tubo es sujetado entre el disco de sello (SD) sobre el tubo soporte (TS) y el sujetador superior (TC). Una aguja (HN) avanza hacia el fondo del tubo.
Figura 9. Recolección del gradiente por desplazamiento ascendente desde una bureta (B) hacia el fondo del tubo a través de una bomba peristaltica (P).
        Estos métodos permiten que los contenidos en los tubos de centrifuga salgan secuencialmente a una serie de tubos de ensayo. Con los contenidos de tubo de centrifuga distribuidos en una serie de tubos de ensayo individuales, es posible averiguar la distribución de los componentes que se deseen. En el caso de organelos celulares esto se puede hacer mediante la localización de las actividades enzimáticas del "marcador" específico; también se puede verificar la morfología mediante microscopía electrónica. Los organelos y moléculas que carezcan de actividades enzimáticas fácilmente ensayables se localizan bien por su absorción de luz o marcaje radiactivo (1, 3, 4). 

    El equipo usado es una ultracentrífuga, la cual posee un motor que sostiene un eje capaz de soportar latas fuerzas de gravedad (g). Este eje a la vez contiene un rotor para la colocación de las columnas o tubos que contienen la muestra; este rotor genera en los tubos de 20000 a 100000 rpm que pueden ser de 10000 a 100000 fuerzas de gravedad.