HEMATOLOGÍA

CITOQUÍMICA

Panóptico Rápido

Para tinción de frotis sanguíneos o medulares.

Procedimiento:

Preparar el frotis sanguíneo y secar al aire.

Sumergir el frotis 5 veces durante 1 segundo en la solución 1 o fijador.

Dejar gotear la solución. Sumergir el frotis 5 veces durante 1 segundo en la solución 2 o roja.

 Dejar gotear la solución. Sumergir el frotis 5 veces durante 1 segundo en la solución 3 o azul.

Dejar gotear la solución.

Enjuagar el frotis en una solución tampón de pH 7,2 según Weise. Secar y observar en el microscopio

FOSFATASA ACIDA LEUCOCITARIA

Fosfatasa ácida granulocitaria (FAG): es un enzima que se encuentra en los gránulos secundarios de los leucocitos polimorfonucleares. Sólo se valora las células maduras o los neutrófilos en banda y se realiza una clasificación de la actividad FAG en 3 grados: Grado 0 si no existe precipitado en el interior celular Grado 1 si hay un ligero precipitado Grado 2 si el precipitado es abundante Se calcula el índice de FAG anotando el grado de reacción observado en cada una de 100 células distintas. Después se suma el número de células con grados 1 y 2. En un individuo normal el índice de FAG se sitúa entre 20 y 80. Podemos encontrar valores aumentados en infecciones, embarazo y síndromes mieloproliferativo, así como en el tratamiento con hormonas esteroideas FOSFATASA ALCALINA LEUCOCITARIA Es un examen que mide la cantidad de la enzima fosfatasa alcalina en los glóbulos blancos (leucocitos). Forma en que se realiza el examen    La sangre se extrae de una vena, usualmente de la parte interior del codo o del dorso de la mano. El sitio de punción se limpia con un antiséptico y luego se coloca una banda elástica alrededor del antebrazo con el fin de ejercer presión y restringir el flujo sanguíneo a través de la vena. Esto hace que las venas bajo la banda se llenen de sangre. Inmediatamente después, se introduce una aguja en la vena y se recoge la sangre en un frasco hermético o en una jeringa. Durante el procedimiento, se retira la banda para restablecer la circulación y, una vez que se ha recogido la sangre, se retira la aguja y se presiona moderadamente sobre el sitio de punción para detener cualquier sangrado. En los bebés o niños pequeños, el área se limpia con un antiséptico y se punza con una aguja o lanceta para luego recoger la sangre en una pipeta (tubo pequeño de vidrio), en una lámina de vidrio, sobre una tira de examen o en un recipiente pequeño. Finalmente, se puede aplicar un algodón o un vendaje en el sitio de la punción si el sangrado persiste. Los glóbulos blancos se separan del resto de los componentes sanguíneos y entre sus enzimas está la fosfatasa alcalina, la cual es capaz de modificar sustancias que contienen fosfato en un producto que se fija a ciertos tipos de colorante. Esta enzima se cuantifica de una manera aproximada midiendo el tamaño e intensidad del color de los gránulos teñidos que se forman. Preparación para el examen    Se recomienda el ayuno durante 6 horas antes del examen. El médico puede recomendar la suspensión de los medicamentos que puedan afectar el resultado del examen, incluyendo algunos antibióticos, narcóticos, metildopa, propanol, cortisona, alopurinol, antidepresivos triciclitos, clorpromazina, anticonceptivos orales, medicamentos antiinflamatorios, andrógenos, tranquilizantes, algunos medicamentos antiartríticos y antidiabéticos orales. Lo que se siente durante el examen    Cuando se inserta la aguja para extraer la sangre, algunas personas sienten un dolor moderado, mientras que otras sólo sienten un pinchazo o sensación de picadura. Después, puede haber una sensación pulsátil. Razones por las que se realiza el examen    La fosfatasa alcalina es una enzima presente en diferentes formas en todos los tejidos del cuerpo. Dentro de los glóbulos blancos, esta enzima sirve para confirmar la presencia de ciertos trastornos. Valores normales    Un valor de tinción 20 a 100 (de un máximo de 400) se considera normal. Significado de los resultados anormales    La fosfatasa alcalina generalmente está más alta de lo normal con: Policitemia vera Mielofibrosis La fosfatasa alcalina puede ser normal o más alta de lo normal con: Reacción leucemoide a las infecciones Consumo de anticonceptivos orales por parte de las mujeres La fosfatasa alcalina usualmente disminuye con la leucemia granulocítica crónica. La fosfatasa alcalina puede ser más baja de lo normal a causa de la disminución de la actividad de la médula ósea: Anemia perniciosa Anemia aplásica La trombocitemia primaria es una de las condiciones adicionales bajo las cuales se puede realizar el examen. El análisis de fosfatasa alcalina leucocítica (FAL) es un análisis de laboratorio que se utiliza para medir la cantidad de una determinada enzima (fosfatasa alcalina) en los glóbulos blancos. Los glóbulos blancos (GB) también se denominan leucocitos. Este análisis prácticamente ya no se utiliza en la actualidad. En el pasado, y antes de que hubiera análisis más avanzados, se utilizaba como indicador clave de la leucemia mielógena crónica (LMC), un tipo de cáncer que ataca a los glóbulos blancos. Algunos médicos aún lo indican, con el fin de identificar si hay presencia de LMC y descartar o diagnosticar otros trastornos. Sin embargo, hoy en día generalmente se acepta que se debe realizar el análisis citogenético para confirmar el diagnóstico de LMC. Para poder obtener los resultados del análisis, un técnico de laboratorio debe examinar la sangre al microscopio y contar la cantidad de tinción (un proceso mediante el cual se puede observar la enzima) en 100 glóbulos blancos. Advertisement Part 2 of 6: Uso Uso La fosfatasa alcalina es un conjunto de enzimas que elimina grupos de fosfato de diferentes tipos de moléculas del organismo. Funciona mejor en los entornos alcalinos o básicos (en lugar de los acídicos). Estas enzimas se encuentran en todo el organismo, pero se concentran especialmente en el hígado, los riñones, los tejidos del cuerpo, las vías biliares y la placenta (en las mujeres embarazadas). Las que se encuentran en los glóbulos blancos se denominan fosfatasa alcalina leucocítica (FAL). Los leucocitos son las células de la sangre que defienden al organismo de los virus, las bacterias y otros gérmenes. Son una parte fundamental del sistema inmunitario. Uno de los motivos más importantes por los que los médicos utilizaban los análisis de FAL en el pasado era para diagnosticar LMC. Los niveles de fosfatasa alcalina son de bajos a nulos en los glóbulos blancos malignos. No obstante, como este análisis era subjetivo, hace mucho tiempo que se reemplazó por tecnología más reciente. En la actualidad, cuando se sospecha la presencia de LMC, los médicos generalmente indican un análisis citogenético. En este tipo de análisis, los especialistas analizan los cromosomas de las células en busca de anomalías que indiquen que el paciente tiene cáncer. El análisis de FAL puede seguir siendo un primer análisis para detectar LMC y también puede resultar útil para otros diagnósticos. El médico quizás se lo indique para descartar o confirmar ciertas afecciones médicas, por ejemplo: reacción leucemoide: una cantidad elevada de glóbulos blancos que no es producto de una infección ni de un cáncer mielofribosis: un trastorno de la médula ósea que deja cicatrices policitemia vera: un trastorno de la médula ósea en el que la médula produce una cantidad excesiva de glóbulos rojos anemia aplásica: un trastorno de la médula ósea en el que la médula produce una cantidad insuficiente de glóbulos rojos anemia perniciosa: una reducción en los glóbulos rojos causada por un problema de absorción de la vitamina B12 en los intestinos trombocitosis esencial: la producción excesiva de plaquetas Part 3 of 6: Preparación Preparación El médico le explicará cómo prepararse para el análisis de LAP. Esto podría incluir no comer ni beber durante seis horas antes de la extracción de sangre. Además, quizás deba dejar de tomar ciertos medicamentos que pueden interferir con los resultados. Infórmele al médico acerca de todos los medicamentos y suplementos que toma. Part 4 of 6: Procedimientos Procedimientos Para efectuar el análisis de LAP, se extrae una muestra pequeña de sangre. Generalmente, este procedimiento se lleva a cabo en el consultorio del médico o en el laboratorio del lugar. Un miembro del personal de enfermería o el flebotomista extraen una pequeña cantidad de sangre con una aguja que se inserta en una vena del brazo y la colocan en un frasco pequeño. Esta extracción demora solo algunos minutos y causa un dolor mínimo. Una vez que se extrae la sangre, el paciente debe presionar el lugar de la punción o colocarse un apósito para detener la hemorragia. Part 5 of 6: Riesgos Riesgos La extracción de la muestra de sangre no implica muchos riesgos. Si después de la extracción no presiona el sitio de la punción, es posible que se produzca una leve magulladura. También podría presentarse una flebitis (inflamación de la vena), aunque es poco probable que esto suceda. El médico le indicará que se coloque una compresa tibia sobre la zona inflamada durante todo el día, hasta que la inflamación ceda. Antes de la extracción, debe informarle al médico si padece algún trastorno hemorrágico. Part 6 of 6: Resultados Resultados Una vez que estén disponibles los resultados, el médico conversará con usted al respecto. Le explicará qué significan y cuáles son los próximos pasos que deberá seguir. Los resultados del análisis de LAP pueden variar entre cero y 400. Los valores normales se encuentran entre 20 y 100. Un resultado inferior a lo normal puede ser causado por lo siguiente: trombocitosis esencial reacción leucemoide mielofribosis policitemia vera Un resultado superior a lo normal puede indicar la presencia de anemia aplásica o perniciosa, o bien de LMC. Si el resultado indica presencia de LMC, tal vez el médico le indique un análisis citogenético para confirmar el diagnóstico. El análisis de LAP ya no es un indicador definitivo de este tipo de cáncer. h se utiliza para la demostración histoquímica en peroxidasa leucocitaria. Los reactivos de peroxidasa leucocitaria son para uso diagnóstico in vitro. Los métodos clásicos de la localización citoquímica de la mieloperoxidasa (MP) incluyen el uso de benzidina1 o diaminobenzidina2. En 1977, Hanker y cols.3 describieron el uso de p-fenilenediamina y catecol para detectar la peroxidasa de rábano inyectada. Este sistema indicador es la base del procedimiento de Sigma-Aldrich al detectar la mieloperoxidasa por medio de la siguiente reacción: MP p-fenilenediamina + Producto de reacción insoluble marrón-negro Catecol + H2O2 REACTIVOS TAMPÓN TRIZMAL™ 6,3 CONCENTRADO,  con cloroformo como conservante. REACTIVO INDICADOR DE PEROXIDASA, p-fenilenediamina diHCl (1 parte) y catecol (2 partes). SOLUCIÓN DE HEMATOXILINA ÁCIDA,  Hematoxilina certificada, 1 g/l, pH 3,3 a 25 °C. ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD: Almacenar el tampón Trizmal™ 6,3 concentrado y la solución de hematoxilina ácida a temperatura ambiente (18–26 °C). El reactivo indicador de peroxidasa debe almacenarse refrigerado (2–8 °C). La solución de hematoxilina ácida no debe devolverse al recipiente original después de su uso en un vaso de Coplin. El peróxido de hidrógeno al 3 % en una solución salina tamponada con fosfato debe guardarse en el frigorífico (2–8 °C). Desechar si presenta turbidez. Los reactivos son estables hasta la fecha de caducidad. DETERIORO: Desechar el tampón Trizmal™ 6,3 concentrado si presenta turbidez. Desechar la solución de hematoxilina ácida cuando el tiempo requerido para obtener la tinción adecuada supere en más de 5 minutos el tiempo recomendado en el procedimiento. PREPARACIÓN: El tampón Trizmal™ 6,3 diluido se prepara mezclando 1 volumen de tampón TRIZMAL™ 6,3 concentrado, número de catálogo 90-3C, con 9 volúmenes de agua desionizada. Utilizar una sola vez y desecharlo. La solución fijadora de etanol, 95 % (v/v), se prepara mezclando 5 ml de formaldehído al 37 % con 45 ml de etanol al 95 %. Las preparaciones deben ser del día. Mantenga el envase bien cerrado. El peróxido de hidrógeno al 3 % en una solución salina tamponada con fosfato se prepara añadiendo 1 parte de peróxido de hidrógeno, 30 %, a 9 partes de solución salina tamponada con fosfato, pH 7,4. Debe prepararse al momento. PROCEDIMIENTO RECOGIDA DE LA MUESTRA: Se recomienda que la recogida de la muestra se lleve a cabo de acuerdo con las directrices del documento M29-A2 de la NCCLS. Ningún método de prueba puede garantizar la completa seguridad de que las muestras de sangre o tejido no transmitan infecciones. Por lo tanto, todos los derivados de la sangre o muestras de tejido deben considerarse potencialmente infecciosos. Para el ensayo deben utilizarse frotis de sangre total o de médula ósea recién preparados. La sangre puede recogerse en heparina o EDTA. Debe reducirse al mínimo la exposición a la luz ya que la peroxidasa leucocitaria es fotosensible. Los frotis sin fijar son estables durante 3 semanas si se guardan en la oscuridad1. Antes de la fijación, los frotis deben dejarse al aire durante 10 minutos, protegidos de la luz. MATERIAL ESPECIAL NECESARIO PERO NO SUMINISTRADO: Solución de formaldehído, 37 % Etanol, 95 % (v/v) Solución salina tamponada con fosfato, pH 7,4, número de catálogo P 3813 Peróxido de hidrógeno, 30 % NOTAS: A efectos de comprobación del funcionamiento del sistema, se recomienda procesar los frotis de sangre procedentes de donantes sanos junto con las muestras de paciente. Aunque la mieloperoxidasa generalmente se considera un marcador de células de alineación mielocítica, es obligatorio reconocer que las células monocitoides también pueden mostrar actividad leve de peroxidasa. Los datos obtenidos mediante este procedimiento sólo sirven como ayuda en el diagnóstico y deben ser revisados junto con otras pruebas clínicas o información de diagnóstico. PROCEDIMIENTO: 1. Fijar los frotis a temperatura ambiente durante 30 segundos con solución fijadora. 2. Lavar los portaobjetos con agua corriente a chorro suave durante 2 minutos y secar al aire durante 10 minutos, en la oscuridad. 3. Precalentar 50 ml de tampón TRIZMAL™ 6,3 diluido, en un baño de agua a 37 °C. 4. Inmediatamente antes de su uso, añadir 1 vial de reactivo indicador de peroxidasa, de hidrógeno al 3 %, al tampón Trizmal™ 6,3 diluido precalentado. Mezclar a conciencia. Desechar después de su uso. 5. Colocar los portaobjetos lavados, fijados (paso 2) con solución de reactivo indicador de peroxidasa (paso 4) durante 30 minutos, en un baño de agua a 37 °C, en la oscuridad. 6. Tras la incubación, lavar los portaobjetos con agua corriente a chorro suave durante 15–30 segundos y dejarlos secar. 7. Contrateñir los portaobjetos con solución de hematoxilina ácida, 8. Aclarar los portaobjetos en agua desionizada corriente durante 15–30 segundos. Secar los portaobjetos al aire y examinarlos con el microscopio. CARACTERÍSTICAS DE FUNCIONAMIENTO Los frotis de sangre procedentes de donantes normales se tiñeron para mieloperoxidasa de acuerdo con este procedimiento y mediante el método de benzidina1. Los neutrófilos mostraron una granulación marrón-negra con este procedimiento, y una granulación azul con el procedimiento de benzidina. En ambos casos, los monocitos se tiñeron menos intensamente y los linfocitos no mostraron ninguna actividad de mieloperoxidasa.