TINCIÓN SUDAN
El sistema de tinción Sudan Black B de Sigma-Aldrich se utiliza en la demostración istoquímica de gránulos neutrófilos en frotis de sangre o médula ósea. El sistema de tinción Sudan Black B es para uso diagnóstico in vitro.
Varios lípidos, incluyendo los fosfolípidos, las grasas neutras y los esteroles, se tiñen intensamente con Sudan Black B. La reacción de los gránulos neutrófilos con el tinte fue descrita por Sheehan y Storey en 19471. Generalmente, el patrón de tinción leucocitaria de Sudan Black B es parecido al de la mieloperoxidasa2. Las células que se encuentran a lo largo de las vías linfáticas muestran una tinción negativa, mientras que las formas mieloides y monocitoides muestran las reacciones positivas características. Por lo tanto,
Sudan Black B está considerado como un auxiliar útil en la identificación de las leucemias mielocíticas y mielomonocíticas2.
Los métodos antiguos utilizaban una fijación de vapor de formaldehído en los frotis de sangre2, técnica que puede dar como resultado una pérdida celular y artefactos de tinción.
El procedimiento de Sigma-Aldrich utiliza un fijador de glutaraldehído tamponado y un tiempo de incubación más corto, lo que da como resultado una excelente tinción sin pérdida celular ni distorsión3.
REACTIVOS
REACTIVO DE TINCIÓN SUDAN BLACK B,
Sudan Black B, 0,18 % (p/v), en 69 % de etanol y con fenol tamponado con fosfato.
SOLUCIÓN DE HEMATOXILINA, GILL Nº 3, número de catálogo GHS-3
Hematoxilina certificada, 6 g/l, yodato sódico, 0,6 g/l, sulfato de aluminio, 52,8 g/l, y estabilizante.
SOLUCIÓN DE GLUTARALDEHÍDO,
Glutaraldehído, 4 % en tampón borato, pH 7,6.
ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD:
Almacenar el reactivo de tinción Sudan Black B a temperatura ambiente (18–26 °C).
La etiqueta del reactivo indica la fecha de caducidad.
Almacenar la solución de hematoxilina, Gill Nº 3 a temperatura ambiente (18–26 °C), protegida de la luz. La etiqueta del reactivo indica la fecha de caducidad. Filtrar antes de su uso. Se recomienda devolver el material a su envase original después de su uso. Desechar si la solución se vuelve marrón (sobreoxidación por aire) o púrpura (pérdida de acidez).
Almacenar la solución de glutaraldehído en el frigorífico (2–8 °C). La etiqueta del reactivo indica la fecha de caducidad. Desechar si presenta turbidez.
La solución fijadora de glutaraldehído es estable durante varios meses si se almacena en una botella de vidrio cerrada herméticamente y guardada en el frigorífico (2–8 °C).
PREPARACIÓN:
Preparar la solución fijadora añadiendo 25 ml de ACS o acetona de grado reactivo a 75 ml de solución de glutaraldehído, número de catálogo 380-2.
SISTEMA DE TINCIÓN
PROCEDIMIENTO
RECOGIDA DE LA MUESTRA :
Se recomienda que la recogida de la muestra se lleve a cabo de acuerdo con las directrices del documento M29-A2 de la NCCLS. Ningún método de prueba puede garantizar la completa seguridad de que las muestras de sangre o tejido no transmitan infecciones. Por lo tanto, todos los derivados de la sangre o tejido deben considerarse potencialmente infecciosos.
Pueden utilizarse frotis de sangre total o anticoagulada o de médula ósea recién preparados. Fijar cuanto antes.
MATERIAL ESPECIAL NECESARIO PERO NO SUMINISTRADO:
Acetona, reactivo ACS
NOTAS:
A efectos de comprobación del funcionamiento del sistema, se recomienda procesar los frotis de sangre procedentes de donantes sanos junto con las muestras de paciente.
Los datos obtenidos mediante este procedimiento sólo sirven como ayuda en el diagnóstico y deben ser revisados junto con otras pruebas clínicas o información de diagnóstico.
PROCEDIMIENTO:
1. Enfriar la solución fijadora de glutaraldehído en el frigorífico (2–8 °C).
2. Las extensiones o frotis de sangre o médula ósea se fijan durante 1 minuto a 2–8 °C con una suave agitación seguida de un lavado concienzudo con agua desionizada.
3. Para teñir con el reactivo de tinción Sudan Black B, sumergir durante 5 minutos con agitación intermitente.
4. Enjuagar 3 veces o más en etanol al 70 % hasta que ya no desprenda tinte.
Seguidamente, enjuagar a fondo con agua destilada.
5. Contrateñir con solución de hematoxilina, Gill Nº 3, durante 5 minutos y seguidamente enjuagar a fondo con agua del grifo.
6. Después de secar al aire, los portaobjetos pueden montarse en DPX para histología, o en otro medio de montaje permanente que sea adecuado.
CARACTERÍSTICAS DE FUNCIONAMIENTO
Los neutrófilos y sus precursores muestran una granulación intracelular azul-negra2.
Los monocitos se tiñen menos intensamente y los linfocitos no se tiñen con Sudan Black B2.
Los frotis de sangre procedentes de donantes normales se tiñeron con Sudan Black B de acuerdo con el procedimiento descrito y mediante el método clásico de Sheehan- Storey1. Los neutrófilos mostraron una granulación azul-negra con el procedimiento Nº 380 de Sigma-Aldrich y también con el procedimiento de Sheehan-Storey. En ambos casos, los monocitos se tiñeron menos intensamente y los linfocitos no mostraron ninguna actividad de mieloperoxidasa.
Tinción de Hierro en Médula Osea
Principio
En la reacción del azul de Prusia el hierro iónico no ligado a la hemoglobina (Fe3+) reacciona con hexacianoferrato (II) potásico en solución clorhídrica.
Precipita un complejo insoluble en las células sanguíneas, de médula ósea o en células tisulares, localizándose de esta forma el hierro celular libre.
4 Fe3+ + 3 K4Fe(CN)6 = Fe4[Fe(CN)6]3 + 12 K+
Material
Como material de partida para la tinción deberían utilizarse solamente frotis sanguíneos y/o frotis de médula ósea nativos y de preparación reciente. En principio es obsoleta cualquier adición de substancias inhibidoras de la coagulación.
Son necesarios frotis sanguíneos y /o de médula ósea delgados, secados al aire, guardados como máximo durante 3 días.
Los frotis deben secarse al aire como mínimo durante 30 minutos y fijarse durante 3 minutos con metanol.
Reactivos
Merck art. nro. 1.12084 HEMATOGNOST Fe®
En el kit de tinción:
Reactivo 1: Potasio hexacianoferrato (II) 250 ml
Reactivo 2: Ácido clorhídrico 250 ml
Reactivo 3: Solución de rojo nuclear sólido 2 x 250 ml
Preparación
Preparación de la solución de tinción para frotis y cortes*:
Se mezclan a partes iguales el reactivo 1 y el reactivo 2. Usando la cubeta Hellendahl de 60 ml (con ensanche) se recomienda un volumen de 30 a 40 ml del reactivo 1, o respectivamente 2.
La solución de tinción debería desecharse después de cada proceso de tinción.
Reactivo 3**: Para obtener una óptima diferenciación óptica de la precipitación de hierro en el citoplasma debe utilizarse una solución de rojo nuclear sólido, la cual produce una tinción color rosa pálido. En el caso de que se necesite o desee una información más detallada acerca de la morfología celular, puede utilizarse también cualquiera de los conocidos métodos de tinción “clásicos” (Giemsa, May-Grünwald, hemalumbre, etc.).
Asimismo es posible efectuar una tinción con HEMATOGNOST Fe® sobre el mismo preparado a continuación de alguno de los métodos antes mencionados (sin los pasos 4 y 5).
Técnica
I. Frotis sanguíneos o de médula ósea
1. Fijar en metanol los frotis sanguíneos o de médula ósea delgados 3 min.
2. Secar al aire
3. Introducir los preparados en solución de tinción* recién preparada e incubar 20 min.
4. Enjuagar con agua destilada
5. Introducir los preparados en el reactivo e incubar 5 min.
6. Enjuagar con agua destilada
7. Secar al aire (si es necesario, cubrir)
II. Cortes de tejidos*
1. Desparafinar los cortes de tejidos (5-6 ìm ) y rehidratar con series de alcohol descendentes.
2. Introducir los preparados en solución de tinción* recién preparada e incubar 20 min.
3. Lavar cuidadosamente con agua destilada.
4. Introducir los preparados en reactivo 3** e incubar. 5 min.
5. Enjuagar con agua destilada
6. Deshidratar los cortes con series de alcohol ascendentes y con xileno.
7. Cubrir con Entellan® Nuevo
Cubierto con Entellan® Nuevo y cubreobjetos la estabilidad de la tinción es de varios meses.
La reacción a 37 °C hace que las precipitaciones de color tengan una definición más nítida.
Evaluación
Con un microscopio con objetivo 100x (binocular, aceite de inmersión) se examinan minuciosamente de 1000 a 2000 células de un frotis sanguíneo, en una sala oscura. La reacción de azul de Prusia se caracteriza por un intenso color turquesa. Los siderocitos se determinan en %o respecto a los eritrocitos contados.
Para la evaluación de frotis de médula, se cuentan 100 precursores rojos nucleados. Además de la determinación cuantitativa de los sideroblastos, también hay que considerar el tipo y la cantidad de los depósitos de hierro (ver abajo).
Valores normales
I. En la sangre periférica para el adulto el valor normal de siderocitos es del 0-3%o. Para recién nacidos es del 3-17%o.
II. En la médula el valor normal de sideroblastos es del 20-40%.
En cortes de tejidos, el hierro libre se ve como gránulos intensamente azules.
Los núcleos se tiñen ligeramente de rojo, el citoplasma aparece rosado.
En el corte pueden demostrarse hasta 0,002 μg de hierro con la reacción.
Indicaciones sobre alteraciones patológicas en el contenido de
hierro
Aumento
En caso de anemias sideroacrésticas y hemoliticas, anemia perniciosa, intoxicación con plomo, esplenecomía.
Una sobrecarga masiva de hierro en el organismo lleva a la detección de los llamados sideroblastos anulares. Aquí los depósitos de hierro son gruesos y ordenados en forma anular en el citoplasma de los precursores eritrocitarios.
Las células reticulares también son Fe3+-positivas.
Disminución
La carencia de hierro lleva a una disminución de sideroblastos. Las células reticulares están casi libres de depósitos de hierro.
Histología:
Valores aumentados de ferritina en suero indican hemocromatosis. Tal sospecha ha de ser demostrada por medio de una biopsia de hígado con determinación del contenido de hierro en el hígado. Aquí basta en general la determinación semicuantitativa con la reacción del azul de Prusia. Las células principalmente afectadas son las células del parénquima y epiteliales del conducto biliar.
Nota técnica
El microscopio usado debería corresponder a los requisitos de un laboratorio de diagnóstico médico.
Preparación de las muestras
Todas las muestras deben tratarse de acuerdo con el estado de la tecnología.
Todas las muestras deben estar rotuladas inequívocamente.
Deben usarse instrumentos adecuados para la toma de muestras y en la preparación, y deben seguirse las instrucciones del fabricante para la aplicación/el empleo.
Diagnóstico
Los diagnósticos deberán ser establecidos solamente por personas autorizadas y cualificadas.
Deberán emplearse terminologías vigentes.
Deberán elegirse y realizarse ensayos ulteriores según métodos reconocidos.
Almacenamiento
El kit de tinción debe almacenarse entre +15°C y +25°C .
Los reactivos pueden usarse hasta la fecha de caducidad indicada.
Estabilidad
Después de abrir el frasco por primera vez, el contenido almacenado entre +15°C y +25°C es utilizable hasta la fecha de caducidad indicada.
Los frascos deben mantenerse siempre bien cerrados.
Capacidad
El kit de tinción es suficiente para 6-8 tinciones en cubeta empleando la cubeta de 60 ml de Hellendahl ampliada.
Tinción de Hierro en Médula Osea
Principio
En la reacción del azul de Prusia el hierro iónico no ligado a la hemoglobina (Fe3+) reacciona con hexacianoferrato (II) potásico en solución clorhídrica.
Precipita un complejo insoluble en las células sanguíneas, de médula ósea o en células tisulares, localizándose de esta forma el hierro celular libre.
4 Fe3+ + 3 K4Fe(CN)6 = Fe4[Fe(CN)6]3 + 12 K+
Material
Como material de partida para la tinción deberían utilizarse solamente frotis sanguíneos y/o frotis de médula ósea nativos y de preparación reciente. En principio es obsoleta cualquier adición de substancias inhibidoras de la coagulación.
Son necesarios frotis sanguíneos y /o de médula ósea delgados, secados al aire, guardados como máximo durante 3 días.
Los frotis deben secarse al aire como mínimo durante 30 minutos y fijarse durante 3 minutos con metanol.
Reactivos
Merck art. nro. 1.12084 HEMATOGNOST Fe®
En el kit de tinción:
Reactivo 1: Potasio hexacianoferrato (II) 250 ml
Reactivo 2: Ácido clorhídrico 250 ml
Reactivo 3: Solución de rojo nuclear sólido 2 x 250 ml
Preparación
Preparación de la solución de tinción para frotis y cortes*:
Se mezclan a partes iguales el reactivo 1 y el reactivo 2. Usando la cubeta Hellendahl de 60 ml (con ensanche) se recomienda un volumen de 30 a 40 ml del reactivo 1, o respectivamente 2.
La solución de tinción debería desecharse después de cada proceso de tinción.
Reactivo 3**: Para obtener una óptima diferenciación óptica de la precipitación de hierro en el citoplasma debe utilizarse una solución de rojo nuclear sólido, la cual produce una tinción color rosa pálido. En el caso de que se necesite o desee una información más detallada acerca de la morfología celular, puede utilizarse también cualquiera de los conocidos métodos de tinción “clásicos” (Giemsa, May-Grünwald, hemalumbre, etc.).
Asimismo es posible efectuar una tinción con HEMATOGNOST Fe® sobre el mismo preparado a continuación de alguno de los métodos antes mencionados (sin los pasos 4 y 5).
Técnica
I. Frotis sanguíneos o de médula ósea
1. Fijar en metanol los frotis sanguíneos o de médula ósea delgados 3 min.
2. Secar al aire
3. Introducir los preparados en solución de tinción* recién preparada e incubar 20 min.
4. Enjuagar con agua destilada
5. Introducir los preparados en el reactivo e incubar 5 min.
6. Enjuagar con agua destilada
7. Secar al aire (si es necesario, cubrir)
II. Cortes de tejidos*
1. Desparafinar los cortes de tejidos (5-6 ìm ) y rehidratar con series de alcohol descendentes.
2. Introducir los preparados en solución de tinción* recién preparada e incubar 20 min.
3. Lavar cuidadosamente con agua destilada.
4. Introducir los preparados en reactivo 3** e incubar. 5 min.
5. Enjuagar con agua destilada
6. Deshidratar los cortes con series de alcohol ascendentes y con xileno.
7. Cubrir con Entellan® Nuevo
Cubierto con Entellan® Nuevo y cubreobjetos la estabilidad de la tinción es de varios meses.
La reacción a 37 °C hace que las precipitaciones de color tengan una definición más nítida.
Evaluación
Con un microscopio con objetivo 100x (binocular, aceite de inmersión) se examinan minuciosamente de 1000 a 2000 células de un frotis sanguíneo, en una sala oscura. La reacción de azul de Prusia se caracteriza por un intenso color turquesa. Los siderocitos se determinan en %o respecto a los eritrocitos contados.
Para la evaluación de frotis de médula, se cuentan 100 precursores rojos nucleados. Además de la determinación cuantitativa de los sideroblastos, también hay que considerar el tipo y la cantidad de los depósitos de hierro (ver abajo).
Valores normales
I. En la sangre periférica para el adulto el valor normal de siderocitos es del 0-3%o. Para recién nacidos es del 3-17%o.
II. En la médula el valor normal de sideroblastos es del 20-40%.
En cortes de tejidos, el hierro libre se ve como gránulos intensamente azules.
Los núcleos se tiñen ligeramente de rojo, el citoplasma aparece rosado.
En el corte pueden demostrarse hasta 0,002 μg de hierro con la reacción.
Indicaciones sobre alteraciones patológicas en el contenido de
hierro
Aumento
En caso de anemias sideroacrésticas y hemoliticas, anemia perniciosa, intoxicación con plomo, esplenecomía.
Una sobrecarga masiva de hierro en el organismo lleva a la detección de los llamados sideroblastos anulares. Aquí los depósitos de hierro son gruesos y ordenados en forma anular en el citoplasma de los precursores eritrocitarios.
Las células reticulares también son Fe3+-positivas.
Disminución
La carencia de hierro lleva a una disminución de sideroblastos. Las células reticulares están casi libres de depósitos de hierro.
Histología:
Valores aumentados de ferritina en suero indican hemocromatosis. Tal sospecha ha de ser demostrada por medio de una biopsia de hígado con determinación del contenido de hierro en el hígado. Aquí basta en general la determinación semicuantitativa con la reacción del azul de Prusia. Las células principalmente afectadas son las células del parénquima y epiteliales del conducto biliar.
Nota técnica
El microscopio usado debería corresponder a los requisitos de un laboratorio de diagnóstico médico.
Preparación de las muestras
Todas las muestras deben tratarse de acuerdo con el estado de la tecnología.
Todas las muestras deben estar rotuladas inequívocamente.
Deben usarse instrumentos adecuados para la toma de muestras y en la preparación, y deben seguirse las instrucciones del fabricante para la aplicación/el empleo.
Diagnóstico
Los diagnósticos deberán ser establecidos solamente por personas autorizadas y cualificadas.
Deberán emplearse terminologías vigeNTe caducidad indicada.
Estabilidad
Después de abrir el frasco por primera vez, el contenido almacenado entre +15°C y +25°C es utilizable hasta la fecha de caducidad indicada.
Los frascos deben mantenerse siempre bien cerrados.
Capacidad
El kit de tinción es suficiente para 6-8 tinciones en cubeta empleando la cubeta de 60 ml de Hellendahl ampliada.
v RECUENTO MANUAL DE LOS RETICULOCITOS.
Los eritrocitos atraviesan seis etapas hasta conseguir su maduración.
Los reticulocitos son los glóbulos rojos jóvenes que circulan en la sangre desde hace menos de un día (duración de vida de los glóbulos rojos:120 días ).
Estos se encuentran ya en médula ósea y en sangre perisférica, en médula ósea permanecerán 2 días madurando, y en sangre perisférica 1 día más. Convirtiéndose finalmente en hematíes maduros.
Fundamento:
Ellos se evidencian sobre unos frotis gracias a ciertos colorantes supravitales como el azul de metileno o azul de cresil brillante, que permite observar los organoides citoplasmáticos que aún llevan y que han desaparecido en los glóbulos rojos adultos: es la <
Puede apreciarse sobre un porta el porcentaje de glóbulos rojos que son reticulocitos, pero es deseable expresar los resultados en valores absolutos, así pues como el ciclo vital de un hematíes es de 120 días, la médula ósea reemplaza todos los días aproximadamente 1% de hematíes.
Material y reactivo:
- Microscopio 100x.
- Portas.
- Tubo comercial con azul cresil billante al 1% o azul de metileno.
- Pipeta Pasteur.
Muestra:
- Sangre venosa con EDTA o sangre capilar.
Procedimiento:
1. Añadir 3 gotas de sangre al tubo comercial.
2. Mezclar bien.
3. Incubar a temperatura ambiente de 10 a15 minutos.
4. Volver a mezclar y hacer las extensiones.
5. Dejar secar.
6. Observar con objetivo de inmersión 100x.
Cálculo:
Se realiza el recuento de reticulocitos en 10 campos, en los cuales, haya aproximadamente 100 hematíes/campo.
Seguidamente calculamos la proporción de reticulocitos en dichos campos.
Valores normales:
· En adultos de 0.5 a 2%.
· En recién nacidos de 2,5 a 6,5%, alcanzando al valor del adulto a las dos semanas de vida.
Observaciones:
Los reticulocitos se pueden observan como hematíes con granulaciones o filamentos, de color azul oscuro.
También podemos observar con esta tinción cuerpos de Heinz, que son alteraciones en las cadenas de hemoglobina o déficit de alguna enzima eritrocitaria, dan lugar a la hemoglobina inestable que se desnaturaliza con facilidad dando lugar a precipitado dentro del hematíe.
Cuando existe anemia, con disminución del número de hematíes. Su valor deber ser corregido de acuerdo a la intensidad de la anemia, aplicándose la siguiente fórmula:
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