Inmunología

la genética y ontogenética de la producción de anticuerpos

APROXIMACIÓN HISTÓRICA: LA PARADOJA GENÉTICA DE LA DIVERSIDAD DE LOS ANTICUERPOS

Conforme se iban acumulando datos de secuencias de inmunoglobulinas se vio que cada anticuerpo difiere en la región V, pero que sólo existe un repertorio limitado de tipos de regiones C. Cualquier modelo genético que intentara explicar la diversidad y estructura de anticuerpos debía de partir de la difícil situación de reconciliar los siguientes datos experimentales:

	cada individuo de cada especie de mamífero es capaz de producir una gigantesca diversidad de especificidades de anticuerpos: 100 millones e incluso aún más. Puesto que las Ig son proteínas, y teniendo en cuenta que el genoma haploide humano contiene del orden de 100.000 genes, ¿cómo explicar genéticamente la variedad de tipos de anticuerpos?
	Hay que explicar que tanto las cadenas H como las L poseen una región N-terminal variable y otra C-terminal constante.
	Hay que dar cuenta de los isotipos y subclases que presentan la misma especificidad de epitopo: es decir, distintas regiones CH se asocian con un mismo tipo de región VH.

7.1.1  Historia de las teorías sobre la formación de anticuerpos

A principios de siglo existían dos teorías sobre la base de producción de los anticuerpos:

	teoría de la línea germinal: según esta teoría, el genoma debe contener un enorme repertorio de genes, uno por cada especificidad de anticuerpo.
	teoría de la variación somática: el genoma contendría un número relativamente pequeño de genes de anticuerpos, que por mecanismos mutacionales (y/o recombinativos) generarían el repertorio completo de anticuerpos del individuo.

Cuando a mediados de siglo se empezaron a acumular datos de secuencias de anticuerpos, ambas teorías se toparon con problemas:

¿Cómo explicar que en una misma cadena exista una porción constante mientras que la otra porción sea muy variable?

	La teoría de la línea germinal no puede aportar ningún mecanismo evolutivo para explicar esto.
	Los partidarios de la variación somática no podían aportar ningún mecanismo genético que explique que una parte de la proteína apenas sufra mutación y la otra sí.
	Además, ¿cómo explicar que un mismo tipo de región VH se asocie con los varios tipos de porciones constantes de cadenas pesadas responsables de los isotipos y subclases?

7.1.2   El modelo de Dreyer y Bennet (1965)

Estos autores propusieron un ingenioso modelo:

1. cada cadena H o L de inmunoglobulina está constituida por la codificación de dos tipos diferentes de genes, uno para la región V y otro para la porción C.
2. Estos genes estarían separados en la línea germinal, pero se unirían durante el desarrollo de los linfocitos B para constituir un mensaje continuo responsable de la producción de la cadena completa correspondiente. (En esto la teoría de Dreyer & Bennet se parece a la de la variación somática).
3. Además, en la línea germinal existirían cientos o miles de genes codificadores de regiones V, y unos pocos genes para las regiones C. (En esto se parece esta teoría a la de la línea germinal).

Estas ideas eran demasiado heterodoxas para su tiempo. Téngase en cuenta que a mediados de los años 60 se estaba desentrañando el código genético y todos los datos experimentales apoyaban el "dogma" de que un gen sólo puede codificar una proteína. La comunidad científica de la época rechazó en su mayoría la "loca idea" (que aún carecía de apoyo experimental) de que dos (o más) genes pudieran determinar una proteína.

La demostración de la teoría de Dreyer & Bennet tardó unos 10 años, una vez que las técnicas de la recién nacida "Ingeniería Genética" permitieron disponer de herramientas como purificación de ARN mensajeros, enzimas de restricción, clonación molecular del ADN, hibridaciones de ácidos nucleicos, etc.

De hecho, la realidad que ha quedado al descubierto supera las "fantasías" de estos autores, porque se ha visto que aunque su idea genérica era correcta, existen varios mecanismos genéticos en la base de la diversidad de anticuerpos:

	múltiples genes en línea germinal determinantes de regiones variables
	mutación somática en las regiones génicas V
	recombinación entre distintos genes V, lo que genera aún mayor diversidad.

7.1.3  Primera confirmación de la hipótesis de Dreyer y Bennet por los experimentos de Tonegawa (1976)

Los experimentos de Susumu Tonegawa y su equipo aportaron las pruebas definitivas de lo que acabamos de decir, por medio de una serie de experimentos clásicos que hicieron uso de las herramientas citadas de biología molecular.

El alumno estudiará en más detalle estos experimentos en las clases de seminarios y problemas de inmunulogía.

De todas formas, hay que aclarar que estos experimentos demuestran lo que ocurre en mamíferos. Recientemente se está viendo que otros grupos de vertebrados poseen "estrategias" genéticas de diversificación diferentes. Por ejemplo, los tiburones presentan un gran número de genes de Ig, pero carecen de recombinación somática. En cambio, en las aves (al menos las estudiadas hasta ahora) existe un pequeño repertorio de genes en la línea germinal, pero luego son sometidos a altos niveles de recombinación somática, por fenómenos de conversión génica, en los que participan pseudogenes de regiones V_L y V_H.

7.2  ORGANIZACIÓN DE LOS GENES DE LAS INMUNOGLOBULINAS

Los genes para las cadenas k , l y H están localizados en distintos cromosomas, formando en cada caso familias multigénicas.

Localización de las familias multigénicas de cadenas de Ig:

Genes para	cromosoma en humanos	cromosoma en ratones
lambda	22 (22q11)	16
kappa	2 (2p12)	6
H	14 (14q32)	12

Cada una de estas familias multigénicas contiene una serie de secuencias codificadoras, llamadas segmentos génicos, que son de distintos tipos

	Las familias de k y l poseen segmentos de tipos L, V, J, C.
	La familia de H posee segmentos de tipos L, V, D, J, C.

Las inmunoglobulinas funcionales se producen durante la maduración de los linfocitos B en un proceso (que describiremos en detalle después) en el que los segmentos se reordenan, de modo que se colocan adyacentes un segmento de cada tipo de los que intervienen en la codificación de cada tipo de cadena:

	V+J de cadenas L (l o k ) determinan la región VL de la cadena ligera.
	V+D+J de cadenas H determinan la región VH de la cadena pesada.
	En cada caso, el segmento C, se coloca cercano al conjunto ya reordenado de V+J o V+D+J para determinar la correspondiente región constante.
	El pequeño segmento L acompaña en 5’ a cada segmento V. Determina un péptido líder corto que sirve para guiar a la cadena polipeptídica en formación hacia el retículo endoplásmico rugoso. Durante el proceso de secreción este péptido se elimina, por lo que no participa de la Ig madura.

7.2.1  Familia multigénica de la cadena l

Ver figuras

7.2.2  Familia multigénica de la cadena k

Ver figuras

7.2.3  Familia multigénica de la cadena H

Ver figuras

7.3  REORDENACIONES GÉNICAS DE LA REGIÓN VARIABLE

Las reordenaciones de segmentos génicos correspondientes a las regiones variables se producen durante la maduración de los linfocitos B en la médula ósea, con una sucesión determinada: primero se organizan los genes de V_H y luego los de V_L. Al final del proceso el linfocito B maduro presenta inmunoglobulinas de membrana de los isotipos IgM e IgD con una determinada especificidad hacia un determinado epitopo. Solamente más tarde, en la periferia, se detectarán reordenaciones de genes de C_H, lo que llevará al cambio de clase, pero sin que cambie la especificidad hacia el epitopo original.

7.3.1  Reordenaciones V-J del ADN de la cadena ligera

En el ratón, existen diferentes opciones, según que nos refiramos a las cadenas de tipo l o de tipo k :

en el caso de cadenas l , sólo se pueden dar las combinaciones siguientes:

	Vl 2 con Jl 2
	Vl 1 con Jl 1
	Vl 1 con Jl 3

En el caso de las cadenas k , cualquiera de los aproximadamente 300 segmentos de tipo Vk se puede combinar aleatoriamente con cualquiera de los 4 segmentos J_Kfuncionales (se excluyen pues los pseudogenes, no funcionales).

Los genes k o l reordenados consisten (en sentido 5’ à 3’) de:

	segmento L (segmento líder o guía)
	un corto intrón
	segmento empalmado V-J (procedente de una reordenación)
	segundo intrón (que puede abarcar uno o más segmentos J no seleccionados por el evento de unión V-J anterior)
	segmento Ck .

Esta secuencia de ADN reorganizado es transcrita por la ARN polimerasa, comenzando por el segmento L, hasta terminar en el lado 3’ del C, lo cual produce un ARN primario, que ulteriormente es sometido al típico procesamiento por corte y empalme ("splicing") y adición de la cola de poli-A en el extremo 3’, para generar el ARNm, que sale desde el núcleo al citoplasma.

El ARNm se une a ribosomas en la superficie del retículo endoplásmico rugoso, con lo que comienza su traducción. Lo primero que surge es la parte correspondiente al péptido líder, que empuja a la cadena polipeptídica en crecimiento al lumen (interior) del REr; finalmente, la cadena proteica se escinde a nivel del péptido líder, quedando la cadena ligera en el interior del REr.

7.3.2  Reordenaciones de V-D-J en el ADN de la cadena pesada

Para generar la porción variable correspondiente a las cadenas pesadas hacen falta dos eventos independientes de reordenación:

1. en primer lugar, un segmento D_H cualquiera se une con un J_H (con delección o inversión del trozo intercalado no seleccionado);
2. el segmento fusionado D_H-J_H resultante se une a su vez aleatoriamente con un segmento V_H, con lo que se obtiene la fusión V_H-D_H-J_H.

Así pues, el material genético resultante queda estructurado, de 5’à 3’ de la siguiente manera:

	segmento líder (L) corto
	pequeño intrón
	segmento fusionado VH-DH-JH
	segundo intrón (que puede incluir los segmentos J no seleccionados del lado 3’ respecto del evento de fusión correspondiente)
	una serie de genes CH, uno para cada isotipo o subclase, separados entre sí por intrones más o menos largos.

La ARN polimerasa reconoce un promotor situado aguas arriba (sentido 5’) del segmento líder (L), y transcribe hasta cubrir el Cm y terminar con el Cd ; entonces se detiene, con lo que se genera el transcrito primario, el cual será procesado por medio de una poliadenilación y corte-empalme diferenciales, que producen dos tipos de ARN mensajeros:

	ARNm para cadenas m : incluye los segmentos L-V-D-J-Cm -poliA
	ARNm para cadenas d : incluye los segmentos L-V-D-J-Cd -poliA.

Obsérvese que ambos tipos de ARNm son iguales en lo que respecta a L-V-D-J (la porción que al ser traducida creará la parte de unión al Ag), pero que van a determinar dos isotipos diferentes de anticuerpos.

Cada ARNm es traducido y procesado (eliminación del péptido líder), generándose, respectivamente, cadenas pesadas de tipo m y d , pero con la misma especificidad. Cuando dichas cadenas se combinen independientemente con cadenas ligeras, se obtendrán IgM e IgD de la membrana del linfocito B maduro.

7.3.3  Mecanismo de las reordenaciones del ADN de la región variable

Antes de describir lo que se sabe de este notable fenómeno de reordenación a nivel molecular, hay que hacer una referencia a las secuencias de ADN que están en la base de este mecanismo.

7.3.3.1  Secuencias señalizadoras de recombinación (RSS)

Se trata de unas secuencias de ADN conservadas que aparecen flanqueando los segmentos V, D y J, de la siguiente manera:

	al lado 3’ de cada segmento V
	al lado 5’ de cada segmento J
	a ambos lados de cada segmento D.

Las RSS tienen una estructura primaria característica:

	un heptámero palindrómico conservado
	un nonámero conservado, rico en A y T
	entre el heptámero y el nonámero, una secuencia no conservada, que se caracteriza por tener 12 o 23 nucleótidos. Esto supone que podemos distinguir dos tipos de secuencias RSS:

1. RSS de una vuelta (con 12 nucleótidos intercalados entre el heptámero y el nonámero. Obsérvese que se llaman de una vuelta porque doce pares de bases corresponde aproximadamente a la distancia de una vuelta de la hélice del ADN).
2. RSS de dos vueltas (con 23 nucleótidos intercalados)

Observen en los esquemas la disposición característica de RSS de una vuelta y de dos vueltas respecto de los segmentos V, D y J:

	en las cadenas l , en el lado 3’ de cada segmento V hay una RSS de dos vueltas, mientras que en el lado 5’ de cada segmento J hay una RSS de una vuelta.
	En las cadenas k , en el lado 3’ de cada V hay una RSS de una vuelta, mientras que en el lado 5’ de cada J hay una RSS de dos vueltas.
	En las cadenas pesadas, tanto el lado 3’ de V como el lado 5’ de J posee una RSS de dos vueltas, mientras que ambos lados de cada segmento D poseen RSS de una vuelta.

Esta disposición no es nada "casual", ya que la reordenación de segmentos se debe a emparejamientos entre dos secuencias RSS, de modo que sólo se puede emparejar una RSS de una vuelta con otra RSS de dos vueltas. Esta regla asegura que los segmentos V_L sólo se unirán a segmentos J_L, y que los segmentos V_H, D_H y J_H se unirán en el orden adecuado, evitándose las uniones "ilegítimas" entre segmentos del mismo tipo.

7.3.3.2   Unión de los segmentos génicos

En los últimos años se van desentrañando detalles del fenómeno de recombinación que se da entre parejas de secuencias RSS, responsables de las unión de los segmentos V-(D)-J.

Esta recombinación origina la formación dos tipos de junturas (es decir, las zonas de aposición de segmentos o extremos de segmentos que antes estaban alejados unos de otros):

	una juntura codificadora, formada por la unión de dos secuencias codificadoras que se fusionan entre sí para dar un solo mensaje continuo;
	una juntura de señales, formada por la unión de las dos RSS que han participado en el evento (una RSS con espaciador de 12 p.b. y otra RSS con espaciador de 23 p.b.).

Cuando los dos segmentos génicos que van a participar en la reordenación tienen la misma orientación de transcripción, la recombinación produce la delección del material intermedio (intercalado entre los dos segmentos), junto con las dos señales RSS, en forma de un ADN circular, que se pierde.

Cuando los dos segmentos génicos están en orientaciones opuestas (p. ej., la mitad de los Vk humanos están invertidos respecto de los Jk ), la recombinación que genera la unión de ambos produce la inversión de uno respecto del otro, con la consiguiente retención del material intercalado junto con las dos RSS.

La recombinación se da en varios pasos. Lo que describimos a continuación no deja de ser por el momento un modelo hipotético apoyado en algunos datos experimentales, pero al que aún hace falta confirmar algunos puntos:

1. Reconocimiento entre la RSS de una vuelta y la RSS de dos vueltas mediante recombinasas específicas de estas secuencias.
2. Sinapsis: las dos RSS y los segmentos adyacentes correspondientes se alinean y quedan en mutua proximidad.
3. Rotura del ADN por endonucleasas específicas de sitio, a nivel del límite entre cada RSS y la secuencia codificadora adyacente respectiva.
4. Se recortan los extremos de las secuencias codificadoras: se eliminan unos cuantos nucleótidos de cada extremo codificador generado, por medio de alguna endonucleasa que actúa sobre cadenas sencillas.
5. (Opcional) Adición de hasta 15 nucleótidos en los extremos cortados en el paso anterior (estos son los llamados N-nucleótidos), a nivel de los extremos cortados de V, D y J de la cadena pesada.
6. Reparación y ligación para unir entre sí las secuencias codificadoras de los dos segmentos, así como para unir entre sí las dos secuencias RSS.

Obsérvese la diversidad de junturas codificadoras que se pueden formar entre dos segmentos génicos concretos:

	variaciones según el mayor o menor recorte sufrido por los extremos de las secuencias codificadoras;
	variaciones según el número y naturaleza de los N-nucleótidos (en cadenas pesadas);

flexibilidad en la unión entre las secuencias codificadoras (una vez que existen dos extremos "reparados", uno por cada secuencia codificadora, los nucleótidos concretos por los que se producirá el empalme pueden variar de un evento concreto a otro).

Todo ello contribuye a que la diversidad de secuencias finales de las regiones CDR3 de las inmunoglobulinas sea enorme.

7.3.3.3  Genes de activación de recombinación

Aunque se desconocen casi todos los detalles sobre la enzimología de estas reacciones de recombinación, se han identificado dos genes cuyos productos actúan sinérgicamente en la unión de los segmentos V-(D)-J. Se trata de los conocidos como genes de activación de recombinación, RAG1 y RAG2.

Se trata de dos genes estrechamente ligados, que desempeñan un papel (al parecer directo) en la maquinaria de recombinación de los segmentos génicos de porciones variables de inmunoglobulinas. Inducen roturas de cadena doble en el ADN a nivel del límite entre RSS y secuencias codificadoras, y sólo actúan sobre el ADN de línea germinal de las inmunoglobulinas (más adelante veremos que hacen algo parecido también con los genes de las cadenas de TCR). Sólo se expresan en precursores de células B (hasta el estadio conocido como células pro-B), pero no en linfocitos B maduros.

La reordenación de genes de cadenas H parece estar controlada por el ciclo celular:

	Los genes RAG actúan en células detenidas en fase G1 del ciclo.
	La reordenación productiva parece conducir a la inhibición de la actividad RAG-2 (por fodforilación dependiente de p34cdc2, una quinasa dependiente de ciclina.

7.3.3.4 Flexibilidad de unión: reordenaciones productivas y no productivas

Aunque las roturas de ADN de cadena doble que inician las reordenaciones entre V, (en su caso, D) y J ocurren de modo preciso en el límite entre RSS y secuencias codificadoras, la ulterior unión entre las secuencias codificadoras de dos segmentos génicos presenta una gran flexibilidad (variedad), lo cual contribuye a la hipervariabilidad del sitio de unión del antígeno (como dijimos, afectando a la CDR3).

Cada vez que se produce un evento de empalme, éste es aleatorio (o sea, no está determinado qué nucleótido del extremo de un segmento se va unir con no importa qué otro nucleótido del otro segmento implicado en la unión). Por lo tanto, cuando se tenga la fusión entre los dos segmentos, el mensaje fusionado resultante puede estar o no estar en fase adecuada para que la traducción en los ribosomas genere un polipéptido funcional. A las reordenaciones que están en fase (se entiende fase adecuada para su correcta traducción) se las llama reordenaciones productivas, mientras que las que no han resultado en fase, se denominan reordenaciones no productivas. Muchas de estas últimas poseen en sentido 3’ respecto de la zona de fusión, codones sin sentido (de parada de traducción), por lo que generan proteínas truncadas totalmente no funcionales.

Si una célula B en desarrollo reordena uno de los dos alelos de un tipo de cadena de inmunoglobulina, y resulta no productiva, entonces lo intenta con el otro alelo. Si tampoco es productivo, la célula entra en apoptosis. En la médula ósea, sólo un 8 % de de las células pre-B llegan a la madurez y logran salir como linfocitos B maduros e inmunocompetentes.

7.3.3.5 Exclusión alélica

La exclusión alélica es el hecho de que cada célula B exprese sólo uno de los dos alelos de cada tipo de cadena (pesada y ligera) de inmunoglobulina. Ello asegura que cada célula B tenga sólo una determinada especificidad antigénica.

Yancopoulos & Alt han propuesto un posible mecanismo por el que se explica que una vez que se ha logrado una reordenación productiva en un alelo se impidan definitivamente nuevos intentos de reordenación de ese tipo: una vez que se logra una reordenación productiva, la proteína codificada correspondiente actúa para evitar ulteriores reordenaciones de ese tipo, y si procede, desencadenar las reordenaciones de otro tipo

1a) reordenación V_H-D_H-J_H empleando el primer alelo:

	si productiva: la cadena m inhibe la reordenación del otro alelo de cadena H, y se pasa a fase 2)
	si no productiva, se intenta la reordenación del otro alelo (1b):

1b) reordenación V_H-D_H-J_H empleando el segundo alelo:

	si productiva, se pasa a fase 2)
	si no productiva, la célula entra en apoptosis

2a) reordenación de Vk _--Jk (primer alelo):

	si productiva, la cadena ligera k se empareja con la pesada m , para dar IgM, que provocaría la inhibición de ulteriores reordenaciones (tanto del segundo alelo de k como los dos alelos de l ).
	si no productiva, se "prueba suerte" con el otro alelo de k :

2b) reordenación de Vk -Jk usando el otro alelo:

	si productiva, pasa lo mismo que en el primer punto de 2a)
	si no productiva, se intentan reordenaciones con los genes de l (fase 3)

3a) reordenación de Vl -Jl usando uno de los dos alelos (primer alelo):

	si productiva, la cadena l se empareja con la m , para generar IgM, que inhibiría la reordenación del otro alelo de l
	si no productiva, lo intenta con el otro alelo (fase 3b):

3b) reordenación de Vl -Jl usando el otro alelo:

	si productiva, se produce IgM funcional
	si no productiva, la célula ha perdido todas las posibilidades en esta peculiar "lotería", y entra en apoptosis.

7.4   BASE GENÉTICA DEL CAMBIO DE CLASE

Como ya sabemos, cada linfocito B maduro virgen posee IgM e IgD de membrana. Cuando el antígeno específico se une a estas mIg se desencadena (ayudado por otros factores) la activación y diferenciación de estos linfocitos B. Durante este período que sigue a la estimulación, el ADN de la familia multigénica de la cadena H puede sufrir nuevos cambios que hacen que la unidad V_HD_HJ_H concreta que ya se había seleccionado se ensamble ahora con cualquier segmento génico C_H. Este fenómeno se denomina cambio de clase (o de isotipo), y parece que su base genética es como sigue:

	En la figura se puede apreciar que todos los genes CH (excepto el Cd ) poseen, a unos 2-3 kb corriente arriba, unas secuencias conservadas, denominadas secuencias S (secuencias de cambio de clase; la S procede del inglés "switch"). Dichas secuencias constan de repeticiones en tándem de una secuencia consenso de 52 pb; las repeticiones pueden llegar a suponer una longitud de 1 a 10 kb.
	Una serie de recombinasas específicas reconocen y alinean pares de secuencias S, generando un bucle con el material intercalado entre ambas. La recombinación tiene lugar a nivel de ambas secuencias, de modo que la unidad VHDHJH queda ahora situada junto a otro de los genes CH, perdiéndose en forma de círculo el material intermedio.
	Parece que el proceso de cambio de clase puede venir modulado por varia citoquinas producidas por linfocitos TH.

Por ejemplo, la interleuquina IL-4 induce el cambio de clase en el orden siguiente:

Cm à Cg ₁ à Ce .

7.5   FUENTES RESPONSABLES DE LA DIVERSIDAD DE ANTICUERPOS

Quizá ahora es el momento de resumir los distintos orígenes que explican la extraordinaria diversidad de anticuerpos que cada individuo produce.

7.5.1  Existencia de segmentos génicos múltiples en línea germinal

Ya hemos hablado de la variedad de segmentos de las familias multigénicas, sobre todo de tipo Vk y V_H, pero también de tipo J y D.

7.5.2  Combinaciones entre estos segmentos

En la tabla se puede ver un cálculo en ratón de las combinaciones teóricas posibles (teniendo en cuenta que cualquier segmento de un tipo puede combinarse aleatoriamente con cualquiera de otro tipo del mismo locus genético):

	300 tipos de VH x 13 tipos de DH x 4 tipos de JH = 1.6·104 tipos de cadenas H
	300 tipos de Vk x 4 tipos de Jk = 1.2·103 tipos de cadenas k
	2 tipos funcionales de Vl x 3 tipos de Jl = 6 tipos de cadenas l .

En este sentido, se puede ver que tanto la teoría germinal como la de variación somática tenían su parte de razón: existen múltiples genes (pero no tantos como hubiera exigido la teoría germinal primitiva) que se recombinan aleatoriamente (como propugnaba la teoría de la variación somática).

Ya sabemos que el proceso de recombinación supone empalmar entre sí dos segmentos de tipos distintos y dos secuencias RSS. Aunque las secuencias señalizadoras de la recombinación (RSS) se empalman siempre de modo preciso, la unión de dos segmentos codificadores a menudo es imprecisa (por eso se habla de flexibilidad).

Esta flexibilidad (imprecisión) de unión puede generar reordenaciones no productivas (teóricamente 2/3 de las veces), pero también genera combinaciones adicionales productivas, en las que aparecen aminoácidos alternativos en la juntura. Ello implica que se incrementa la diversidad de especificidades de anticuerpos, a nivel de la CDR3, tanto de cadenas ligeras como pesadas.

Se puede hacer un sencillo cálculo para apreciar en cuánto se incrementa en teoría la variabilidad debido a este mecanismo: por término medio, cada unión V_LD_L, D_HJ_H y V_HD_H puede producir tres aminoácidos distintos. Por lo tanto:

	cadenas H: 3x3 = 9 (casi un orden de magnitud de aumento para las cadenas pesadas)
	cadenas k : factor 3 de aumento de variabilidad
	cadenas l : factor 3 de aumento de variabilidad.

7.5.3  Adición de N-nucleótidos

A nivel del polipéptido, las zonas de unión D_HJ_H y V_HD_H contienen algunos aminoácidos que no están codificados en los respectivos segmentos D, J y V. De hecho, estos aminoácidos no tienen una codificación genética propiamente dicha, sino que vienen determinados por los llamados nucleótidos N, que se adicionan ex-profeso durante la fase de unión D-J y V-DJ.

La reacción viene catalizada por la desoxinucleotidiltransferasa terminal (TdT), que va añadiendo aleatoriamente hasta 15 nucleótidos en las junturas, de modo que la región final la podemos representar así: V_H -N-D_H-N-J_H. (La TdT es una especie de ADN-polimerasa independiente de molde).

La diversidad adicional que esto representa es bastante grande, y afecta exclusivamente a la CDR3 de la cadena pesada.

7.5.4  Hipermutación somática

Hasta ahora hemos venido hablando de los mecanismos responsables de producir el repertorio primario de anticuerpos, que ocurre durante la fase independiente de antígeno, es decir, aquella fase en la que los linfocitos están madurando en la médula ósea antes de salir a periferia.

Uno pensaría en principio que una vez que el linfocito B maduro sale de la médula con sus inmunoglobulinas de membrana, habiendo reordenado definitivamente sus segmentos V, D y J, no debería experimentar más cambios genéticos a nivel de esos segmentos. Pero el sistema inmunitario nos vuelve a sorprender, ya que existe un nivel adicional de variación: una vez que los linfocitos B contactan con el antígeno y migran a los folículos linfoides para crear los centros germinales, se produce el fenómeno conocido como hipermutación somática, por el que los genes reordenados de regiones variables tanto de cadenas ligeras como pesadas sufren una altísima tasa de mutación, que va generano continuamente nuevas variantes de inmunoglobulinas a partir de la reordenación génica original.

Este mecanismo tan sofisticado parece que evolutivamente apareció ya al comienzo de la filogenia de los vertebrados, ya que existe en los tiburones actuales.

La tasa de mutación es altísima: 10^-3·pb^-1·generación^-1, es decir, un millón de veces más que la normal.

El número de mutaciones se va incrementando durante la respuesta inmune, sobre todo en la respuesta secundaria y ulteriores.

Igualmente, conforme aumenta la edad del individuo aumentan las mutaciones, lo cual parece que se debe a que existen más células B de memoria que van entrando en el proceso de hipermutación somática.

Parece que la hipermutación somática va ligada de alguna manera al cambio de clase, ya que no afecta a la IgM, pero sí a IgG e IgA.

Obsérvese en los esquemas que la zona afectada por la hipermutación somática es la que se sitúa entre el pequeño intrón que separa el segmento L del V y el potenciador (enhancer) interno (E_ik ); pero dentro de ella existen sitios calientes mutacionales (hotspots), sobre todo a nivel de las CDR, especialmente la CDR1 y CDR2. Las mutaciones más frecuentes son transiciones que llevan a sustituciones en la secuencia de aminoácidos de las CDR. El resultado es que aparecen nuevas variantes de Ig a partir de la original.

¿A qué se debe este notable fenómeno de altísima tasa de mutaciones en una zona tan concreta del genoma? Por ahora se desconoce el mecanismo, pero ahí van unas cuantas pistas e hipótesis a partir de experimentos recientes:

	Se sabe que para que se dé esta hipermutación somática, hace falta la presencia de esos potenciadores, el interno (Ei) y el situado aguas abajo del segmento C (E3’).
	Se plantea la fascinante hipótesis de que la evolución creó una presión selectiva que favoreció la aparición de secuencias tales como las reordenadas que codifican la porción V de las Ig, que hacen que hacia ellas se dirijan mutaciones con alta frecuencia; dichas mutaciones crean a su vez variantes en las posiciones más útiles para generar variedades de Ig nuevas que luego serán sometidas en el individuo a un proceso selectivo de tipo darwiniano, responsable de la maduración de afinidad de los anticuerpos.
	Efectivamente, de las numerosas variantes aleatorias que van surgiendo en los linfocitos B de los centros germinales, algunas son de mayor afinidad que la original, y otras serán de menor afinidad. A partir de ahí, el antígeno dirige un proceso selectivo que va enriqueciendo las poblaciones de linfocitos B con inmunoglobulinas de mayor afinidad; proliferan más aquellos linfocitos con versiones de Ig de mayor afinidad (y quizá también de mejor cinética). Este fenómeno es lo que se conoce como maduración de la afinidad.

7.6 EXPRESIÓN DE LOS GENES DE LAS INMUNOGLOBULINAS

Las secciones 7.6.1 y 7.6.3 van a tratar de la ruta de expresión de genes de inmunoglobulinas, así como del procesamiento y destino celular de éstas. La sección media (7.6.2) matiza lo que ocurre en aquellos casos de procesamiento del ARN primario que desembocan en fenómenos de expresión diferencial.

7.6.1 Transcripción y traducción de los genes de las cadenas de Ig

Cada segmento génico de tipo V_H o V_L posee a poca distancia del respectivo líder (L) unas secuencia promotora, incluyendo una típica "caja TATA" para la entrada del complejo de la ARN-polimerasa II. Sin embargo, en la línea germinal estos promotores son muy débiles, por lo que no promueven la transcripción.

En los mapas genéticos de los segmentos se puede observar la existencia de intensificadores (potenciadores, enhancers); por ejemplo, véase el intensificador situado entr los segmentos J_H y el primer segmento de porción constante de cadenas pesadas. En la línea germinal estos intensificadores están muy lejos de sus respectivos promotores (de 200 a 300 kb). Pues bien, al ocurrir la reordenación de los segmentos de la región variable, estos intensificadores quedan ahora cerca (unas 2 kb) del respectivo promotor, con lo que se logra potenciar la transcripción unas 10.000 veces.

La actividad de promotores e intensificadores está regulada por diversos factores de transcripción, algunos comunes a otros tipos celulares, y otros específicos del linaje de los linfocitos B. Cada factor o conjunto de factores concretos se unen a una secuencia conservada característica.

Por ejemplo, el motivo de ADN denominado OCTA, y la proteína Oct-2 parecen bastante específicos del linaje de los linfocitos B.

Otro ejemplo de factor (relativamente) específico es la proteína denominada NF-k B. En los linfocitos B no estimulados dicha proteína está inactiva porque forma un complejo citoplásmico con la proteína I-k B. Sin embargo, cuando la célula B es estimulada experimentalmente de modo adecuado (p. ej., con citoquinas, con mitógenos o con ciertos virus), se pone en marcha una cadena de quinasas y segundos mensajeros que finalmente conduce a la fosforilación del factor I-k B, con lo que éste libera al NF-k B, que puede así migrar al núcleo, donde reconoce específicamente a una secuencia (k B) presente en el intensificador del gen de Ig, con lo que colabora en la transcripción de los genes reordenados de la cadena k .

Al poco de haber comenzado la transcripción, y al igual que ocurre con la mayoría de genes nucleares, el ARN naciente experimenta el típico proceso de modificación del extremo 5’(adición de la caperuza del 7-metilguanosina).

Una vez terminada la transcripción, el ARN primario sufre la poliadenilación: la enzima poliadenina polimerasa reconoce la secuencia AAUAAA que existe cerca del extremo 3’, corta a unas 15-30 bases en sentido 3’, y añade al nuevo extremo generado una ristra de AMP procedentes del ATP.

A continuación se produce el corte y empalme (splicing): eliminación de intrones y empalme de exones. (Recordar que aquí, se considera como intrón a todo el trozo de ADN que queda entre dos segmentos seleccionados, y que tal trozo puede albergar segmentos génicos no seleccionados que a todos los efectos forman parte del ADN intrónico que se pierde). El ARNm maduro sale del núcleo y llega a los polirribosomas del retículo endoplásmico rugoso para ser traducido. Lo que pasa después se explica en la sección 7.6.3, pero antes vamos a interrumpir la linearidad de la narración para referirnos a importantes fenómenos de procesamiento del ARN de cadenas de inmunoglobulinas que pueden darse.

7.6.2  Procesamiento diferencial del ARN primario

Dejando aparte el mecanismo básico de expresión de los genes de inmunoglobulinas, que como hemos visto es similar al de muchos genes eucarióticos, hay que hacer referencia al hecho de que en ciertos casos el ARN primario resultante de la acción de la ARN polimerasa II puede sufrir fenómenos de procesamiento (maduración) diferencial, que desembocan en la producción simultánea o sucesiva en el tiempo de tipos diferentes de inmunoglobulinas.

Concretamente, lo que estudiaremos a continuación son sendos mecanismos responsables de

	producir alternativamente versiones de membrana y secretada de cada especificidad de inmunoglobulina;
	producir simultáneamente IgM e IgD de membrana en el linfocito B maduro.

7.6.2.1 Expresión alternativa de Ig de membrana y de Ig secretada

Antes de pasar a explicar por qué un mismo linaje de células B produce en unos momentos Ig de membrana y en otros (ya como células plasmáticas) produce Ig secretadas (anticuerpos) con la misma especificidad antigénica, es conveniente volver sobre las diferencias de secuencia y estructurales entre ambos tipos de inmunoglobulinas.

Observar que los genes de porciones constantes de cadenas H están constituidos por una serie de exones e intrones; de hecho, cada exón se va a corresponder con uno de los dominios constantes de cadenas pesadas.

Obsérvese que en el caso del gen Cm , al final de su 4º exón (Cm ₄) existe una disposición característica formada por el siguiente orden:

	una secuencia S que codifica los aproximadamente 20 aminoácidos de la cola de la versión secretada; inmediatamente después existe un típico sitio de poliadenilación (al que llamaremos, para entendernos, sitio #1);
	un intrón;
	un pequeño exón, llamado M1;
	otro intrón;
	un pequeño exón llamado M2, inmediatamente seguido de una señal de poliadenilación, a la que llamaremos sitio #2. Los dos exones M1 y M2, en el caso de que se junten adecuadamente, codifican la porción carboxiterminal típica de las Ig de membrana.

Pues bien, el transcrito primario del que hablábamos puede sufrir dos tipos de procesamiento alternativos (mutuamente excluyentes en la misma célula), a saber:

1. Puede ocurrir la poliadenilación en el sitio #1, (situado tras el segmento S) con lo cual se pierde todo el trozo en 3’ (incluyendo M1 y M2); el resultado es que se produce Ig secretada.
2. Si la poliadenilación tiene lugar en el sitio #2, esto acarrea el siguiente splicing: el extremo del 4º exón (m ₄) se empalma con el inicio de M1, y el final de M1 se une a su vez con el inicio de M2. Como se puede ver, en este procesamiento se pierde como ADN intrónico el segmento S, y además, el hecho de que el exón 4º se prolongue en la suma de M1+M2 hace que la inmunoglobulina se ancle a membrana.

La versión de membrana se produce en linfocitos B maduros, mientras que la versión secretada se produce en células plasmáticas.

7.6.2.2 Expresión simultánea de mIgM y mIgD en linfocitos B maduros

En las células B maduras vírgenes, la transcripción de los genes reordenados de cadenas pesadas produce un ARN primario en el que están representados los genes Cm y Cd (véase en los gráficos que entre ambos genes no hay secuencias de cambio de clase, al contrario de lo que ocurre cuando consideramos cualquier otra pareja de genes C sucesivos). En este ARN primario, bastante largo (unas 15 kb) existen cuatro sitios de poliadenilación:

	sitio #1, para IgM secretada
	sitio #2, para IgM de membrana
	sitio #3, para IgD secretada
	sitio #4, para IgD de membrana

Pues bien, la razón de que el linfocito B maduro virgen (no cebado) produzca sólo las versiones de membrana de IgM e IgD es que en esta célula se están produciendo simultáneamente poliadenilaciones en los sitios #2 y #4:

	la poliadenilación en #2 produce mIgM;
	la poliadenilación en #4 va a acompañada de splicing diferencial, que se "salta" todo el segmento correspondiente a Cm , con lo que se produce mIgD.

7.6.3 Síntesis, ensamblado y secreción de las inmunoglobulinas

El ARN mensajero, al llegar al polirribosoma del REr comienza a ser traducido. Al generarse la porción correspondiente al péptido guía (líder), éste encauza la cadena polipeptídica hacia el interior del REr; el péptido guía se escinde, y el resto de la proteína queda retenido en el lumen del retículo.

A continuación tienen lugar el ensamblaje de la Ig, es decir, la unión de las cadenas constituyentes por puentes disulfuro, y la adición de oligosacáridos, con lo que las cadenas van transitando desde el REr al aparato de Golgi, por medio de vesículas membranosas.

Parece que incluso existe un cierto orden de ensamblaje para cada tipo de Ig:

	orden para la IgM: H+L à HL; 2 HL à H2L2 (Ig)
	orden para la IgG: H+H à H2; H2+L à H2L; H2L+L à H2L2 (Ig).

El destino final de la Ig dependerá del tipo de secuencia carboxiterminal de las cadenas pesadas:

	Si la Ig contiene la secuencia "S", queda libre dentro de la vesícula membranosa, que al fusionarse con la membrana citoplásmica (en la célula plasmática) provocará la liberación de la Ig al exterior (Ig secretada, anticuerpo circulante).
	Si la Ig contiene la secuencia típica de membrana (codificada por los dos miniexones M1+M2),queda anclada a la membrana de la vesícula; cuando ésta termine fusionándose con la membrana citoplásmica de la célula B, las Ig quedarán ancladas a ésta.

7.7 DESARROLLO ONTOGENÉTICO DE LAS CÉLULAS B

El proceso de desarrollo que conduce desde los primeros precurores reconocibles de linaje de B hasta las células plasmáticas secretoras de anticuerpos se puede dividir en dos grandes fases:

	fase independiente de antígeno, que ocurre en la médula ósea (órgano linfoide central o primario), y que concluye con la salida de la médula del linfocito B maduro virgen e inmunocompetente;
	fase dependiente de antígeno, que se da en los órganos linfoides secundarios o periféricos, y que conduce a la diferenciación del linfocito B en dos subclones hermanos: uno de células plasmáticas secretoras de Ac y otro de linfocitos B cebados de memoria.

En esta sección vamos a abordar en más detalle la primera fase (ya que la segunda forma parte de la respuesta humoral que estudiaremos detenidamente en el lugar apropiado: tema12). Además, podremos comprobar en qué orden y en qué contexto van apareciendo los distintos mecanismos genéticos que hemos ido conociendo a lo largo de este tema. Pero antes de descender a detalles, veamos un resumen de ambos procesos:

Fase independiente de antígeno:

Los precursores del linaje de B van interaccionando con células y moléculas del estroma de la médula ósea; mientras tanto, ocurre una serie de reordenaciones génicas, cada una de las cuales caracteriza un estadio madurativo distinto:

Pro-B	Pre-B	célula B inmadura	célula B madura
DH à JH	VHà DHJH	VHDHJH VLà JL
	pseudo-IgM	MIgM	mIgM mIgD

La célula B madura virgen abandona la médula ósea y circula por sangre y linfa, pudiendo alojarse temporalmente en órganos linfoides periféricos (bazo, ganglios).

Fase dependiente de antígeno:

Si el linfocito B interacciona con el antígeno para el que es específico, se activa, se expande clonalmente y se diferencia en un subclón de células plasmáticas productoras de anticuerpos (que secretan IgG, IgA, IgM, IgE) y un subclón de células B de memoria.

7.7.1 Fase independiente de antígeno

7.7.1.1 Aspectos histológicos

En cavidades del hueso esponjoso ocurre la linfopoyesis de células B. La maduración tiene lugar en sentido radial, desde el endostio hacia el seno venoso central.

Los progenitores linfoides adyacentes al endostio van produciendo reordenaciones génicas y dividiéndose, de modo que cada progenitor genera unos 64 descendientes.

Estos descendientes, que ya son del estadio de células pre-B, emigran hacia el centro de la cavidad; la mayoría mueren por apoptosis (siendo fagocitados sus restos por macrófagos especializados llamados macrófagos de cuerpos tingibles). Finalmente, las células B maduras salen al seno venoso central.

Durante todo este proceso se dan interacciones estrechas entre células estromales y las distintas fases madurativas del linaje de células B. Cerca del endostio predominan las células estromales reticulares, mientras que cerca de los senos venosos se reconocen las células estromales adventicias, que son importantes en el mecanismo de tránsito de la célula B madura a dicho seno.

7.7.1.2 Aspectos moleculares

El comienzo del linaje específico de células B se caracteriza (en ratón) por la aparición del marcador de linaje conocido como B220 (=CD45R). Es decir, dicha molécula de superficie se comporta como marcador "pan-B" (presente en todos los estadios del linaje de B).

Las células pro-B se multiplican e interaccionan con las células estromales reticulares; esta interacción hace que la célula pro-B se diferencie a célula pre-B.

Células estromales		célula pro-B/pre-B
Ácido hialurónico	ß ß interacciones à à	CD44
VCAM-1	ß ß interacciones à à	VLA-4
Factor célula madre (SCF)	ß ß ß ß ß ß ß ß ß	R c-Kit sin activar
SCF	à à activación à à à	R c-Kit activado
		c-Kit (tirosín-quinasa) induce la diferenciación a célula pre-B
		pre-B con receptor para IL-7
Célula estromal secreta IL-7	à à à à à à à à à	unión IL-7 con receptor en pre-B
		la pre-B deja de sintetizar moléculas de adhesión
		pre-B se despega de la célula estromal y comienza a proliferar

	Durante las fases de progenitor linfoide, pro-B y parte de pre-B se expresan los genes de activación de recombinación (RAG-1 y RAG-2), así como el gen de la desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT).
	Durante las fases de progenitor y pro-B se reordena DH à JH en ambos cromosomas.
	En fase pre-B se intentan reordenaciones productivas VH à DHJH (Si no son productivas, la célula entra en apoptosis; si alguna de las dos es productiva, la célula escapa de la apoptosis, probablemente por la acción "de rescate" de la célula estromal). Simultáneamente está ocurriendo la adición de N-nucleótidos.
	Ahora tiene lugar la síntesis del receptor de células pre-B: se ensambla VHDHJH con el gen Cm , con lo que se producen cadenas pesadas de tipo m ; se unen por splicing dos segmentos de los que no habíamos hablado aún: VpreB y l 5, que conduce a la síntesis de lo que se llama cadena L sustititutiva ("pseudo-L"). El ensamblaje de dos cadenas m y dos cadenas pseudo-L produce la pseudo-IgM de membrana (que va acompañada de Iga /Igb ), que es el receptor característico de células pre-B Este receptor de pre-B está implicado en algunos de los fenómenos que vienen a continuación:
	la cadena pesada m H logra la exclusión alélica (quizá reconociendo alguna señal exterior).
	El receptor en su conjunto induce la expansión proliferativa de las células pre-B que han logrado la reordenación productiva de la cadena H (se trata pues, de una selección positiva por el receptor de las propias células pre-B).
	Ahora, en ese conjunto de células pre-B seleccionadas tiene lugar la reordenación aleatoria de genes de cadenas k. Si tiene éxito (productiva), se provoca la exclusión alélica del otro alelo de k y de los dos alelos de l. Si el primer alelo de k no es productivo, se intenta con el segundo, y si tampoco es productivo, se intenta con los l . Si finalmente ninguno de los alelos de l son productivos, se entra en apoptosis. Si el primer alelo de l es productivo, se provoca la exclusión alélica del otro.

	En resumidas cuentas, si la célula ha logrado reordenaciones productivas y ha escapado a la apoptosis, ha alcanzado la fase de célula B inmadura, que expresa en su superficie auténtica mIgM, con una determinada especificidad
	Estas B inmaduras son de vida corta (3-4 días), y durante este período se produce el proceso de selección negativa: una parte de los linfocitos poseen mIg con especificidades autorreactivas, es decir, que reconocen moléculas del propio organismo (auto-antígenos). En respuesta al auto-antígeno la célula B inmadura hace un intento de "corregirse", induciendo una reordenación secundaria de genes de cadena L:
	La unión auto-antígeno ß à mIgM desencadena la detención de la diferenciación y al mismo tiempo mantiene o eleva los niveles de expresión de los genes RAG-1 y RAG-2, para "probar suerte" con otra reordenación de segmentos génicos de cadenas ligeras.
	Las células B inmaduras que hayan logrado reordenaciones que generen mIgM no auto-reactivas (bien sea en el primer intento o en esta fase de "corrección" de última hora) siguen adelante en su maduración.
	En cambio, las B inmaduras que en esta segunda oportunidad que supone la corrección de cadenas L sigan siendo auto-reactivas, entran en apoptosis y mueren, o bien quedan anérgicas. Estamos, pues, ante un mecanismo para la evitación de clones de células B autoinmunes.
	Al madurar, los linfocitos B coexpresan mIgM + mIgD en sus superficies. Salen de la médula ósea a través del seno venoso (ayudados, como dijimos, por las células adventicias del estroma) y emigran a los órganos linfoides secundarios (periféricos), donde aumentan el nivel de mIgD, de modo que éste llega a superar en 10 veces la cantidad de mIgM. Estos linfocitos B maduros vírgenes se pueden alojar temporalmente en dichos órganos, debido a que expresan receptores de alojamiento (homing) apropiados.

7.7.2  Fase dependiente de antígeno

En la periferia, el linfocito B puede encontrarse o no con el antígeno para el que son específicas sus inmunoglobulinas de membrana.

	Si la célula B virgen recién madurada no encuentra su antígeno específico, muere por apoptosis al cabo de unos pocos días o semanas (menos de un mes).
	En cambio, si entra en contacto con su antígeno específico, se convierte en linfocito B activado, que como veremos en el tema 12, con una serie de señales químicas se expande clonalmente y se diferencia en dos subclones: uno de células plasmáticas secretoras de anticuerpos y otro de células B cebadas de memoria.

Al activarse el linfocito B destinado a convertirse en célula secretora de anticuerpos, pierde su mIgD y experimenta un cambio de clase. Cuando madura a células plasmáticas, ocurre el splicing diferencial responsable de producir las versiones secretadas de las inmunoglobulinas. Además, aumenta mucho la tasa de transcripción de los genes reordenados, por lo que se producen y secretan grandes cantidades de Ac con la misma especificidad que las mIg del linfocito B progenitor. Las células plasmáticas son células a término que ya no se diferencian más, y mueren por apoptosis al cabo de unos días.

Las células B de memoria que quedan en los centros germinales de los órganos linfoides secundarios sufren hipermutación somática, por lo que va madurando la afinidad de sus mIg. Tienen vida larga (de meses a muchos años). Parece ser que el que tengan esa esperanza de vida tan larga depende al menos en parte de sus mIgD: las cadenas pesadas d parecen regular la persistencia de células B maduras de memoria en la periferia.

7.8    UNA POBLACIÓN DISTINTA DE LINFOCITOS B: CÉLULAS B CD5⁺

Durante el desarrollo fetal, a la semana 17ª emigra a los ganglios linfáticos fetales una primera población de células B que son distintas a las estudiadas hasta ahora:

	Poseen mIgM, pero presentan el marcador de superficie CD5+, que comparten con timocitos y células T.
	Expresan inmunoglobulinas a partir de genes no mutados de línea germinal.
	Producen sobre todo IgM, pero también IgG e IgA, que se denominan "anticuerpos naturales". Dichos anticuerpos son de baja avidez, pero curiosamente son polirreactivos, y responden bien a los antígenos timo-independientes (no requieren colaboración de linfocitos T coadyuvantes, TH).
	Se ha propuesto que sus posibles funciones podrían ser el representar una primera línea de defensa contra ciertos microorganismos, el de eliminación de auto-componentes dañados y la participación en las redes idiotípicas.

El equivalente en ratón de estas células se denomina Ly-1⁺