La microscopía

Microscopio de contraste por interferencia diferencial

Microscopio sofisticado de contraste en trans-iluminación, también denominado microscopio Nomarski, ideal para visualizar especímenes no coloreados y transparentes. Permite obtener información sobre la densidad óptica de la muestra y observar detalles que de ordinario son invisibles. Los objetos se ven oscuros o claros en un fondo gris, de manera semejante a las imágenes del microscopio de contraste de fases, pero sin halos de difracción. Emplea luz polarizada la cual pasa por dos prismas birrefringentes (Nomarski, Wollaston) (fig. 6-19) que la fraccionan en dos rayos cuyos trayectos e índices de refracción son diferentes, dando como resultado una imagen del espécimen en 3D o relieves que corresponden a las variaciones de la densidad óptica de la muestra con énfasis en líneas y bordes, como si la célula proyectara sombras hacia un lado (13) (fig. 6-20).

Figura 6-19.-Disposición de los componentes básicos del microscopio de contraste por interferencia diferencial. Modificado de Wikipedia, Enciclopedia Libre (106).

Figura 6-20.-Micrografía de contraste por interferencia diferencial de células epiteliales. Nótese el aspecto tridimensional. Tomada de Raisman J., González A. Hipertextos en el área de biología (94).

6.4.1.-Aplicaciones del microscopio de contraste por interferencia diferencial

• Estudio de células vivas, no coloreadas.

• En el estudio de especímenes un tanto gruesos que no permiten el uso de contraste de fases.

• En tratamientos de fertilización in-vitro.

Microscopio de fluorescencia

Este microscopio hace uso de la fluorescencia y se convierte en una herramienta de inestimable valor para la investigación científica, ya que permite alcanzar altos niveles de sensibilidad y resolución microscópica, permitiendo una apreciación diferente de la información que se puede obtener de los especímenes y que generalmente pasa desapercibida.

La fluorescencia es un fenómeno de luminiscencia que fue observado inicialmente por Sir George Stokes en el año 1852, para luego ser explicada físicamente en el año 1935 por Alexander Jablonski (107). Es la propiedad que tienen ciertos elementos químicos denominados fluoróforos o fluorocromos de emitir luz visible cuando sobre ellos incide una radiación intensa; en otras palabras, absorben una luz de una longitud de onda determinada (por ejemplo luz ultravioleta o luz monocromática azul) y luego emiten otra luz de una mayor longitud de onda (de un determinado color, verde, rojo, amarillo) (fig. 6-21). Es un fenómeno de luminiscencia de vida corta, emitida simultáneamente con la excitación.

Figura 6-21.-Imagen que muestra el principio de la fluorescencia. Arriba se observa el rayo incidente (color azul claro) de una determinada longitud de onda, el cual es absorbido por las partículas fluorescentes (esferas naranja) que responden emitiendo otra luz, en este caso de color verde que exhibe una longitud de onda mayor que la de la luz incidente. Tomado de Fluorescencia y fluorocromos (108).

Los términos de fluorocromo y fluoróforo definen los siguientes conceptos:
• Fluorocromo: Marcador colorante fluorescente empleado en investigación para crear contraste en zonas determinadas de los especímenes.

• Fluoróforo: Parte de una molécula (fluorocromo, proteína) que le imparte la propiedad de fluorescencia.

Existen numerosos tipos de fluorocromos y cada uno de ellos tiene su espectro de absorción y de emisión específico que depende de la composición y estructura de la molécula fluorescente (tabla 6-1) (fig.6-22).

Fluorocromo	Longitud de onda de absorción (nm)	Longitud de onda de emisión (nm)
Cascade blue	374-403	422-430
Fluoresceína (FITC)	494	520
Rodamina (TRITC)	540	570
Naranja de acridina	460-502	526-650
Yoduro de propidio	536	617

Tabla 6-1.-Algunos de los principales fluorocromos empleados en inmunofluorescencia y sus respectivos espectros de absorción y emisión en valores aproximados. Modificado de Costa J. 2004 (109).

Figura 6-22.-Espectro de excitación y de emisión de dos fluorocromos de uso común. La línea negra continua representa el espectro de excitación, la línea negra punteada muestra el espectro de emisión. La fluoresceína al ser excitada por una luz de longitud de onda de aproximadamente 495 nm (azul) emite una luz de color verde cuya longitud de onda esta alrededor de 519 nm. Modificado de Excitation and Emission Spectra of Fluorescent Dyes. Leica Microsystems (110).

También existen fluorocromos intracelulares naturales, tales como nucleótidos de nicotina reducidos (NADH, NADPH), nucleótidos de flavina oxidados, clorofilas, proteínas fluorescentes (Green Fluorescent Protein GFP) y esto debe ser tomado en cuanta al realizar esta técnica con marcadores fluorescentes.

La microscopía de fluorescencia es muy útil porque la molécula fluorescente, aún cuando sea muy pequeña, puede ser observada debido a la luz que emite. Los fluorocromos actúan como fuentes de luz de un color determinado que pueden ser localizadas en áreas específicas de la muestra que se estudia. El marcaje selectivo de moléculas y otros compuestos celulares se realiza mediante la técnica de inmunofluorescencia (21).

6.5.1.-Requerimientos para el microscopio de fluorescencia

• Fuente de luz: Se necesita una intensa fuente de luz para excitar la fluorescencia en el espectro específico de cada fluorocromo. Hay que tomar en cuenta que la fluorescencia es pasajera y la iluminación produce un efecto de fotoblanqueo en el fluorocromo; además, las células vivas pueden ser dañadas por la intensa radiación. La luz debe ser de una longitud de onda corta. Se emplean lámparas de mercurio a alta presión que funcionan de un modo diferente a las lámparas de filamentos incandescentes. También se utiliza luz ultravioleta y rayos laser. Muchos modelos funcionan con epi-iluminación (13).

• Filtros: Son los que permiten el paso de luz de una determinada longitud de onda, la del rango y color necesario para excitar al fluorocromo y bloquean las longitudes no deseadas. Una vez filtrada, la luz incide sobre el espécimen por reflexión de un espejo dicroico (epi-iluminación) y es nuevamente filtrada para poder ser observada (fig. 6-23).

• Objetivos: Deben tener gran capacidad para transmitir la luz y proveer una imagen de alta calidad. De igual manera deben poseer una gran apertura numérica.

Figura 6-23.-Esquema básico de la iluminación en el microscopio de fluorescencia. La luz blanca emitida por la fuente de luz es filtrada dejando pasar por ejemplo, solo la luz azul. El espejo dicroico refleja la luz de cierta longitud de onda (en este caso azul) pero deja pasar otras. Filtra la luz azul que excita al fluorocromo (fluoresceína) pero por el contrario, deja pasar la luz verde emitida. Tomada de wikipedia.org (111).

Los filtros empleados son útiles porque por ejemplo, cuando se emplea la fluoresceína, el espécimen se ilumina con una luz azul monocromática pura y filtrada. Para visualizarlo se emplea otro filtro el cual es completamente opaco a la luz azul pero deja pasar la luz verde (o amarilla y roja emitidas por otros fluorocromos). Las estructuras celulares marcadas mediante inmunofluorescencia aparecen iluminadas de verde contrastando con un fondo negro (fig. 6-24).

Figura 6-24.-Micrografias de células en división, tomadas con un microscopio de fluorescencia. Se emplearon tres fluorocromos: DAPI (emite luz azul) para marcar cromosomas, GFP (proteína verde fluorescente intracelular que emite luz verde) y rodamina (luz roja) para marcar microtúbulos. Cada fluorocromo amerita el uso de filtros específicos, dependiendo de la longitud de onda necesaria para su excitación, señalada arriba y a la izquierda en cada imagen y expresada en nm. Tomada de wikipedia.org (111).

6.5.2.-Aplicaciones del microscopio de fluorescencia

Son numerosas las aplicaciones de la microscopía de fluorescencia, notablemente en biología y medicina (112, 113, 114):

• Marcaje de moléculas en células y tejidos para su caracterización e identificación.

• Estudio de células normales y patológicas.

• Estudios inmunológicos.

• Mineralogía.

Microscopio de luz ultravioleta

Es un microscopio en el que se usa la luz ultravioleta, que es una radiación cuya longitud de onda es de aproximadamente 200 nm y en consecuencia permite un mayor poder de resolución que la luz visible.

La luz ultravioleta es invisible para el ojo humano, no puede ser captada por la retina y además es muy nociva; es por ello que la imagen no se observa directamente, por el contrario debe visualizarse mediante fluorescencia, fotografía o un sensor digital. Todos los elementos ópticos del microscopio, incluyendo las láminas porta y cubre-objetos están hechos de cuarzo o fluorita; no pueden ser de vidrio puesto que este material no transmite la luz ultravioleta (115).

La estructura del microscopio es básicamente igual a la del microscopio de fluorescencia, con fuente de luz, filtros, objetivos y espejos especiales; estos últimos son aluminizados. La fuente luminosa corresponde a lámparas de arco de mercurio o xenón. En términos generales es un microscopio costoso. Las imágenes obtenidas son semejantes a las del microscopio de fluorescencia, las estructuras marcadas aparecen brillantes contrastando con un fondo negro.

6.6.1.-Aplicaciones del microscopio de luz ultravioleta

• Se emplea en ciencia forense para el análisis de ADN, drogas y estudios de evidencias.

• Estudios biológicos.

Microscopio confocal: O Microscopio láser de barrido

En la microscopía fotónica clásica el tejido debe cortarse finamente para ser examinado y mientras más delgado sea, más nítida será la imagen; pero con este método se pierde la información tridimensional durante el corte. Si una muestra gruesa es observada al microscopio fotónico, la imagen que se enfoca se ve contaminada por la superposición de los elementos del tejido que están fuera de foco, tanto por encima como por debajo del plano enfocado; la imagen enfocada se deteriora a causa de las estructuras superpuestas borrosas o no enfocadas.

Con el microscopio confocal estas limitaciones han sido superadas, ya que es un instrumento que permite realizar cortes ópticos finos a muestras de tejidos más o menos gruesos y realizar reconstrucciones en tres dimensiones a partir de cortes seriados. Fue inventado en el año 1955 por el científico estadounidense Marvin Minsky (116) al estudiar neuronas. Su mecanismo, basado en el microscopio de fluorescencia hace posible la obtención de imágenes de la arquitectura tridimensional de células y tejidos.

Los detalles de la óptica del microscopio confocal son complejos y complementado por métodos electrónicos y de computación, este instrumento permite enfocar únicamente un plano determinado del espécimen, eliminando la luz (fluorescencia) procedente de las regiones que no están en el plano de enfoque (fig. 6-25). 

Figura 6-25.- Comparación entre dos micrografías de una célula en mitosis, contrastada con un doble marcaje fluorescente, tanto para los cromosomas (verde) y la actina (rojo). A la izquierda se aprecia una imagen donde la profundidad de campo abarca prácticamente todo el espesor de la célula y en consecuencia la imagen se ve un tanto borrosa a pesar de estar enfocada. A la derecha se observa una imagen obtenida con el principio confocal, que consiste en un corte óptico de la célula donde se captura la fluorescencia que proviene exclusivamente de las estructuras que están en el plano de enfoque, obteniéndose una imagen más nítida.Tomado de Laser Scanning Confocal Microscopy. The Imaging Technology Group (117).

Este microscopio tiene mucho éxito en el mundo científico gracias a la alta calidad de las imágenes que proporciona a partir de especímenes preparados con las técnicas de laboratorio habituales para la microscopía de fluorescencia y por supuesto, al creciente número de aplicaciones.

6.7.1.-Ventajas del microscopio confocal

• Uso de la fluorescencia (epi-fluorescencia).

• Enfoca un solo plano del espécimen.

• Elimina la información proveniente de otros planos no enfocados del espécimen.

• Obtención de cortes ópticos seriados a partir de muestras con cierto grosor o cuyo corte fino se dificulta.

• Gracias a programas de computación, se combinan los cortes ópticos seriados y a partir de ellos se reconstruye en tres dimensiones la estructura observada.

6.7.2.-Principio de la microscopía confocal

El microscopio confocal añade el principio de iluminar el espécimen punto por punto y elimina la luz proveniente de los planos no enfocados. Para ello se necesita una fuente de luz muy potente, así como también un filtro con un agujero que se coloca en el trayecto del rayo de luz (118) (figs. 6-26, 6-27). Minsky lo logró con una lámpara de arco de zirconio, pero en los microscopios modernos se emplea un rayo laser, cuya longitud de onda puede estar disponible en un amplio rango de frecuencias.

Figura 6-26.-Esquema que muestra de manera simplificada el principio del microscopio confocal y el trayecto de la luz. El rayo laser (luz azul) es filtrado por un agujero y un espejo dicroico; luego es enfocado mediante un lente objetivo sobre el espécimen y estimula la fluorescencia presente en el mismo (luz verde). La fluorescencia es recolectada por el objetivo y dirigida al espejo dicroico que la refleja y dirige hacia un detector. Un segundo filtro con agujero se coloca frente al detector y sólo deja pasar la luz proveniente del plano de enfoque (línea continua). La fluorescencia fuera de foco de las zonas que están por encima y por debajo del plano de enfoque (en líneas discontinuas) no pasa por el agujero y por lo tanto no formará parte de la imagen. Modificado de Olschewski F. (2000). Software in confocal microscopy (118).

La luz coherente del rayo laser es dirigida por espejos hacia el espécimen (el cual ha sido previamente tratado mediante marcadores fluorescentes) iluminándolo punto por punto y de manera seriada; la fluorescencia resultante es medida también punto por punto. Para obtener la información completa, el rayo laser debe ser desplazado por todo el espécimen (en los planos x, y, z) y este proceso es lo que se conoce como escaneo o barrido. Para reconstruir las imágenes a partir de los datos obtenidos, se emplean programas de computación adecuados (119).

6.7.3.-Configuración del microscopio confocal

Los microscopios confocal modernos son instrumentos altamente sofisticados y sus elementos principales son:
• La fuente de luz: Generalmente emplea una fuente de luz muy poderosa (laser o lámpara de arco). Se pueden utilizar sistemas de rayos laser multi-frecuencia (en el rango ultravioleta, luz visible e infra-roja) adaptados a los tipos de marcadores fluorescentes empleados para el contraste de los elementos celulares. Se han desarrollado dos técnicas, la de escaneo con un solo rayo (laser) y el escaneo con múltiples rayos. La primera es la más popular y emplea un par de espejos controlados por computadora para escanear el espécimen. La técnica multi-rayos utiliza una lámpara de arco y el escaneo se realiza gracias a un disco rotatorio (disco de Nipkow) conformado por micro-lentes y micro-agujeros. Esta última técnica de iluminación disminuye el daño a los especímenes e incrementa la detección (119).

• Sistema óptico: El sistema óptico de los microscopios está basado en los principios fundamentales que se mantienen inalterados, sin embargo están complementados con los avances en óptica moderna y la tecnología electrónica.

• Filtros de interferencia: Incluyen espejos dicromáticos o dicroicos, barreras con agujero de diámetro variable y diversos filtros de excitación (para seleccionar la longitud de onda de excitación del fluorocromo).

• Detectores: Son fotodetectores muy sensibles a la fluorescencia emitida. Para los microscopios con múltiples rayos generalmente se usan cámaras CCD (charge- coupled device).

• Computadora: Configurada con los requisitos suficientes de memoria y procesador, tarjetas de video de alta resolución, complementadas con software de captura, análisis y procesamiento de imágenes, así como también de impresoras de muy alta calidad (fig. 6-28).

Figura 6-27.-Micrografías comparativas entre las técnicas de fluorescencia con iluminación convencional o de campo amplio (serie superior, a, c, e) y la iluminación en microscopía confocal (serie inferior b, d, f). Nótese en la serie superior la cantidad de señal (fluorescencia) que está fuera de foco y la contrastante nitidez de las imágenes de la serie inferior en las cuales sólo se obtiene exclusivamente la información del plano de enfoque. Las muestras de la izquierda (hipotálamo de ratón) y centro (músculo liso de rata) fueron marcadas con diversos fluorocromos (dobles y triples marcajes). Las imágenes de la derecha corresponden a un grano de polen de girasol el cual es autofluorescente. Tomado de Claxton N, Fellers T, Davidson M. (2008). Laser Scanning Confocal Microscopy (119).

Figura 6-28.-Modelo de microscopio confocal. Tomado de Assessment of Food Ingredient Functionality using Laser Microscopy (120).

6.7.4.-Cortes ópticos y reconstrucción 3D

Con el microscopio confocal es posible obtener una imagen de un plano determinado del espécimen. Esta imagen se denomina sección o corte óptico fino y puede estar en el rango de 0.5-1.5 micrómetros. Se pueden obtener de una manera no invasiva a partir de especímenes fluorescentes cuyo espesor puede variar entre 50-100 micrómetros (121). Las imágenes se obtienen en una secuencia o serie, de manera manual o mediante un sistema automatizado. Las imágenes 2D (dos dimensiones) obtenidas a intervalos regulares siguiendo el eje óptico son combinadas y utilizadas para recrear una estructura en tres dimensiones (3D) mediante el empleo de software especializados (figs. 6-29, 6-30).

Figura 6-29.-Secciones ópticas seriadas de un grano de polen de Pinus contorta. Cada imagen fue obtenida a un intervalo de 3 micrómetros. Tomado de Claxton N, Fellers T, Davidson M. (2008). Laser Scanning Confocal Microscopia (119).

Figura 6-30.-Reconstrucciones tridimensionales a partir de cortes ópticos obtenidos con el microscopio confocal. (a) grano de polen, (b) muestra de hígado de ratón, (c) corte grueso de corteza cerebral de rata. Se emplearon varios marcadores fluorescentes. (d) auto fluorescencia de una porción de raíz de helecho. Las reconstrucciones fueron realizadas a partir de series de 30-45 cortes ópticos. Tomado de Claxton N, Fellers T, Davidson M. (2008). Laser Scanning Confocal Microscopy (119).

6.7.5.-Aplicaciones del microscopio confocal

En comparación a los otros tipos de microscopios, el microscopio confocal proporciona un método altamente sofisticado y mejorado para obtener imágenes. 
En investigaciones en el campo de la biología celular y biomedicina es muy útil para medir procesos dinámicos, realizar videos para capturar secuencias en muy corto tiempo en células vivas y otras aplicaciones (120, 122, 123, 124, 125, 126):
• Procesos celulares: Para medir actividades enzimáticas, reacciones de oxidación, pH intracelular, fagocitosis, apoptosis, comunicaciones intercelulares. Electrofisiología.

• Estudios de ADN y ARN.

• Morfología de organoides citoplasmáticos.

• Cirugía y otros métodos clínicos.

• Otras aplicaciones en el campo de la física, la química y en tecnología alimentaria.

Otros tipos de microscopios

Además de los tipos de microscopios mencionados anteriormente, se describen a continuación otros microscopios con aplicaciones muy concretas y de uso más especializado:

6.8.1.-Microscopios de barrido con sondas

También denominados de sonda de barrido (scanning probe microscopes): Son instrumentos primordiales en la nanociencia. Se constituyen básicamente de una plataforma y una sonda o aguja fina que recorre la superficie de la muestra con gran precisión (escaneo o barrido). Este filamento se coloca muy cerca (a 1 nm) del objeto a estudiar, generando una corriente eléctrica y se desplaza por la superficie, captando electrones que se escapan en lo que se llama efecto túnel. Los electrones saltan de la punta a la muestra y viceversa. La corriente del efecto túnel varía dependiendo de la distancia entre la sonda y la muestra. De esta manera se reproduce la topografía o relieve de la muestra con una alta resolución y mediante programas informáticos, la imagen es traducida por la computadora, pudiéndose distinguir un átomo de otro y se genera una imagen en tres dimensiones.

Dependiendo del tipo de sonda se puede obtener información sobre las propiedades químicas, eléctricas, mecánicas o físicas de la microestructuras o nanomateriales (127). Como aplicaciones en biotecnología se realiza el estudio genético de moléculas de ADN, ARN (128) y la manipulación y desplazamiento de átomos para ser colocados donde se requiera. Estos microscopios deben estar colocados sobre un sistema anti-vibración y van acoplados a una computadora. Dentro de esta categoría de microscopios se citan los más importantes:

• Microscopio de efecto túnel: Creado por Binning y Rohrer en el año 1981, por lo que fueron laureados con el Premio Nobel en 1986 por este descubrimiento. Es el prototipo inicial de esta generación de microscopios. Los materiales deben ser conductores o semi-conductores (fig. 6-31, 6-32).

Figura 6-31.- Imagen que muestra la sonda (punta de la aguja) situada a una distancia muy corta de la superficie de la muestra. Tomado de Microscopios de barrido con sondas. Nanoquímica. (127).

Figura 6-32.-Micrografía de la superficie de un cristal en el cual se aprecian los átomos de silicio, mediante la técnica de microscopio de efecto túnel. Tomado de Díaz C. Página de electrónica. Átomo (129).

• Microscopios de fuerza atómica: Es un instrumento mecano-óptico similar al microscopio de efecto túnel, pero también se emplea en materiales no conductores, como las muestras biológicas. La sonda es una aguja un tanto más fina, de escasos micrómetros de largo y de unos 10nm de diámetro, la cual se dobla al desplazarse sobre la muestra, detectando de esta manera las irregularidades en la superficie, “palpando la muestra” y por ende su forma. Se captura la información proveniente de la fuerza magnética de superficie de la muestra lográndose ver moléculas muy pequeñas y átomos. Este microscopio tiene muchas aplicaciones en biología celular (130, 131, 132, 133) (figs. 6-33, 6-34, 6-35).

Figura 6-33.-Imagen de la sonda sobre la superficie del material en estudio en un microscopio de fuerza atómica. Tomado de Microscopios de barrido con sondas. Nanoquímica. (127).

Figura 6-34.-Microscopio de fuerza atómica. Tomado de Nano y micro-partículas en materiales multicomponentes. Análisis de imagen (134).

Figura 6-35.-Estudio del efecto de antibióticos sobre la superficie de células sanguíneas humanas (glóbulos rojos). Imagen tomada con microscopio de fuerza atómica. Tomado de Cole E. (135).

• Otros microscopios de barrido con sondas: 
- Microscopio de barrido térmico: Mide la conductividad térmica de la superficie del espécimen y de esta manera se obtiene información sobre la topografía (127).

- Microscopio de barrido óptico de campo cercano: Emplea una fibra óptica por la cual se hace pasar un haz de luz, el cual a su vez pasa por una micro-abertura (en el orden de decenas de nanómetros). La sonda es inmóvil y el espécimen se desplaza, midiendo las propiedades ópticas y la topografía de la muestra. La resolución puede alcanzar alrededor de 100 nanómetros (127).

- Microscopio de iones en campo: Los ejemplares se observan en una cámara de alto vacío la cual es cargada con un gas como el helio o el neón. La muestra se congela y se le aplica un voltaje positivo; los átomos del gas se ionizan y el material provoca una magnetización que repele los iones, los cuales chocan sobre un detector que recoge la información, obteniéndose así una imagen de alta definición por los iones gaseosos rechazados. Se emplea para el análisis de átomos, en el estudio o microanálisis de nanomateriales y elaboración de microsondas para microscopios de barrido con sondas. Es uno de los microscopios que ha permitido la obtención de imágenes muy nítidas a escala atómica (136) (fig. 6-36)

Figura 6-36.-Imagen de la punta muy fina de una aguja o nanosonda de tungsteno, en donde cada estructura esférica corresponde a un átomo. Las estructuras alargadas corresponden a trazas dejadas por los átomos en movimiento durante la captura de la imagen (1 s). Imagen obtenida con un microscopio de iones en campo. Tomada de Physics new graphics. The sharpest man made thing (137).

6.8.2.-Microscopio de fluorescencia de excitación con dos fotones

Es otro de los microscopios novedosos y recientes más importantes para la investigación biológica que permite un estudio no invasivo y la formación de imágenes en 3D. Está basado en una técnica relacionada con la microscopía confocal que permite obtener cortes ópticos de especímenes fluorescentes pero con mayor poder de penetración (hasta un milímetro).

El principio consiste en un método especial para excitar las moléculas fluorescentes con ventajas obvias sobre el microscopio confocal. La excitación de la molécula fluorescente se realiza mediante la absorción simultánea de dos fotones (con la técnica de fluorescencia convencional la molécula fluorescente absorbe un fotón). Esto se logra al hacer incidir de manera discontinua y pulsátil (en intervalos de picosegundos) un laser altamente enfocado y ha permitido el estudio de células vivas y otros especímenes, los cuales pueden ser observados por un tiempo más prolongado.

De esta manera la emisión de la fluorescencia se cuadriplica y se disminuye notablemente el daño ocasionado por el laser sobre las células. Esta técnica es ideal para localizar reacciones fotoquímicas y de moléculas efectoras. La técnica microscópica se complementa con computadoras altamente eficientes (138, 139) (fig. 6-37).

Figura 6-37.- Estudio “In vivo” realizado con microscopía de dos fotones. La mayor penetración permite el monitoreo de la actividad neuronal y de los cambios morfológicos de las células nerviosas en el cerebro de un ratón vivo. Este microscopio puede detectar señales fluorescentes de las capas más profundas (hasta 0.9 mm) de la superficie de la corteza cerebral, de manera que se pueden observar las neuronas de todas las capas de la corteza en el animal vivo. Tomado de Nemoto T. Section of Information Processing (Two-photon microscopy) (140).

6.8.3.-Microscopio acústico

Este tipo de microscopio muy particular que fue introducido en el año 1974 (141) y su equivalente en microscopía electrónica, denominado microscopio electrónico acústico de barrido (142). Están basados en la generación de ondas sonoras que inciden sobre el espécimen y las variaciones en el sonido reflejado determinan el contraste y la formación de una imagen. Las ondas reflejadas por el espécimen son colectadas por un transductor que transmite la señal a un monitor de rayos catódicos. Este tipo de microscopio se empleó principalmente en la observación de la ultraestructura celular con una resolución comprendida entre 0.5-0.7 µm. En algunos modelos se utilizó agua como un medio de inmersión que facilitaba la distribución de las ondas sonoras. Tanto el escaso poder de resolución como la baja calidad de las imágenes obtenidas por esta técnica determinaron que el microscopio acústico tuviera poca aceptación ya que sus aplicaciones eran muy limitadas en las investigaciones científicas.