La microscopía

TÉCNICAS ESPECIALES DE MICROSCOPÍA

Una de las finalidades de la microscopía es permitir observar los especímenes de la mejor manera posible, logrando un buen balance entre el contraste y la resolución. Esto es de extrema utilidad en muestras incoloras, tales como las células vivas, que en su estado natural son transparentes y con poco contraste, en las cuales los detalles permanecen invisibles a pesar de la resolución. Esto se debe a que las células incoloras absorben muy poca luz y por lo tanto en un microscopio de campo claro no se ven correctamente. Hay células (eritrocitos por ejemplo) que poseen pigmentos propios que le confieren color y contraste suficientes, pero esto es la excepción.

Desafortunadamente, con los microscopios compuestos de campo claro ordinarios, no se puede lograr un buen contraste de células vivas no coloreadas. Los microscopios de campo claro se denominan así debido a que las muestras son observadas en un campo brillante muy iluminado, en el cual, el contraste se sacrifica a expensas de la resolución y viceversa, limitándose por ejemplo el estudio de células y tejidos vivos, en los cuales la adición de sustancias químicas para incrementar el contraste puede provocar cambios o modificaciones en la estructura de la célula e incluso producirle la muerte.

El interés de observar células vivas radica en la posibilidad de captar procesos vitales en pleno desarrollo, tales como la motilidad, la división, la fagocitosis y muchos otros. Estas particularidades han motivado a los investigadores a buscar métodos para incrementar el contraste con la finalidad de obtener imágenes de células vivas con más detalles. De ordinario, en el microscopio convencional, esto se puede lograr de cierta manera si se reduce la apertura del diafragma o se disminuye la cantidad de luz; con estas maniobras se incrementa el contraste, pero lamentablemente también se reduce seriamente la resolución y la nitidez.

Durante años los investigadores han buscado los procedimientos para resolver estas limitaciones al estudiar tanto células incoloras como células teñidas, llegando a aplicar métodos sencillos que logran incrementar el contraste sin afectar tanto la resolución. Por ejemplo, cuando la finalidad es tomar micrografías en blanco y negro, aplicando las técnicas de fotografía convencional se aumenta el contraste empleando filtros de colores y esto ha sido de gran utilidad. En especímenes coloreados de rojo, el empleo de un filtro verde oscurece las áreas rojas e incrementa el contraste, pero aclara las áreas teñidas con colorantes verdes (15).

Más recientemente, con el empleo de programas informáticos de digitalización y edición de imágenes, las micrografías de células incoloras pueden ser tratadas mejorando de manera significativa el contraste (fig. 6-1), sin embargo, para observar más detalles en los especímenes vivos necesariamente hay que emplear otros métodos ópticos de contraste más sofisticados (12). 

Figura 6-1.- Micrografía en campo claro de una célula epitelial de la mucosa bucal antes (izquierda) y después (derecha) de modificación digital para mejorar el contraste. Modificada de Wegerhoff R, Weildich O, Kassens M. (2005). Basis of light microscopy image. (12).

En este sentido, las limitaciones presentadas por los microscopios compuestos ordinarios han sido superadas mediante el diseño y fabricación de microscopios particulares o de accesorios especiales, notablemente en lo que a sistema de iluminación se refiere; ya sea empleando otro tipo de fuente luminosa o utilizando filtros para modificar la energía lumínica empleada y modificando la conformación de los condensadores. Estas modificaciones han permitido la creación de diversos microscopios cuyas funciones amplían las posibilidades del microscopio compuesto estándar, lo que permite obtener otros datos más allá de los límites de la microscopía fotónica convencional.


Se han diseñado técnicas microscópicas más complejas que incrementan el contraste sin afectar la resolución. Son artificios que proporcionan efectos ópticos en la muestra, permitiendo que aquellos detalles que pasan desapercibidos se traduzcan en cambios de intensidades luminosas las cuales si pueden ser reconocidas por el ojo humano. Los principios básicos de estas técnicas especiales de microscopía se basan en:

• La modificación de la manera como incide la luz sobre el espécimen: Empleo de condensadores y filtros:
- Microscopio de campo oscuro.
- Microscopio de contraste de fase.
- Microscopio de luz polarizada, Microscopio petrográfico y metalúrgico.
- Contraste por interferencia diferencial (Differential Interference Contrast) Nomarski.

• La modificación de la fuente emisora de luz: Cambiando la luz blanca por luz ultravioleta o rayos láser:
- Microscopio de luz ultravioleta.
- Microscopio de fluorescencia.
- Microscopio confocal.

Microscopio de campo oscuro

De manera similar a un cielo nocturno en el cual brillan las estrellas o al iluminar con una linterna un cuarto oscuro y las partículas de polvo flotantes en el aire se tornan visibles porque reflejan o difractan la luz, los especímenes observados al microscopio de campo oscuro se ven blancos y brillantes sobre un fondo oscuro (negro).

La iluminación de campo oscuro se puede realizar tanto mediante luz transmitida (trans-iluminación) como con luz incidente (epi-iluminación). En el primer caso, para lograr el efecto se requiere bloquear la parte central del rayo de luz que normalmente pasa a través y alrededor del espécimen, de tal manera que sólo sea iluminado por rayos oblicuos. La manera más fácil y económica de lograrlo consiste en colocar un filtro circular opaco (por ejemplo círculos de cartulina negra o una moneda adherida a un círculo de vidrio o plástico transparente) bajo el condensador de un microscopio compuesto ordinario. Esta maniobra funciona bien con objetivos de 10x-40x; el diámetro del circulo opaco debe ser de aproximadamente 16-18mm para un objetivo de 10x cuya apertura numérica sea de 0.25. Para un objetivo de 20x o 40x con una apertura numérica de 0.65, el diámetro del círculo opaco debe oscilar entre 20-24mm. Para la iluminación con luz incidente o iluminación oblicua se emplea un filtro en forma de luna en cuarto decreciente (en forma de C), obteniéndose una interesante imagen con relieve (15, 96) (fig. 6-2).

El método más apropiado consiste en el empleo de un condensador característico que además mejora la resolución (12, 15) (fig. 6-3). Con este dispositivo se forma un cono hueco de luz (cuyo centro es oscuro) que incide lateralmente sobre la muestra y sólo los rayos que son difractados o reflejados por las estructuras penetran en la lente objetivo y la célula aparece como un objeto luminoso sobre un fondo oscuro (21) (figs. 6-4 y 6-5). 

Figura 6-2.-Modelos de filtros de fácil realización para lograr la técnica de campo oscuro (izquierda y centro) e iluminación oblicua (derecha, en cuarto decreciente). Para campo oscuro el diámetro de la máscara negra central dependerá del objetivo que se emplee. Con objetivos de mayor aumento y apertura numérica, se requiere un disco negro de mayor diámetro. Modificado de Wim van Egmond (2002). 'Easy to make' contrast enhancement filters for the microscope dark-field, oblique and Rheinberg illumination (96).

Figura 6-3.-Configuración esquemática del principio de iluminación de campo oscuro (luz transmitida). El filtro opaco es de forma circular y forma un cono de luz vacío que incide sobre el espécimen en forma oblicua y los rayos refractados, difractados y reflejados por el espécimen penetran en el sistema óptico del microscopio para formar la imagen. Modificado de Davison M, Abramowitz M. Optical Microscopy. Olympus Microscopy Resource Center (15).

Figura 6-4.-Células epiteliales observadas en microscopio de campo oscuro.Modificada de Wegerhoff, R., Weildich O, Kassens M. (2005). Basis of light microscopy image (12).

Figura 6-5.-Micrografías de la superficie de una hoja que muestran diferencias de contraste entre los diversos tipos de iluminación. En la parte inferior se aprecia el tipo de filtro empleado, en campo claro (derecha) el haz de luz pasa sin interrupción. En campo oscuro, aún muchos detalles más pequeños son visibles. En iluminación oblicua se obtiene contraste con relieve. En campo claro el contraste es limitado. Modificado de Wim van Egmond (2002). 'Easy to make' contrast enhancement filters for the microscope dark-field, oblique and Rheinberg illumination (96).

6.1.1.-Iluminación Rheinberg

Inventada alrededor de 1895 por un microscopista inglés llamado Julius Rheinberg. Se basa en la iluminación de campo oscuro (15) y se emplea con objetivos de bajo y mediano aumento. Es una forma de coloración óptica que emplea filtros de colores para iluminar tanto el espécimen como el fondo oscuro, obteniéndose imágenes con efectos muy atractivos y espectaculares, pero con la definición y datos de la iluminación de campo oscuro. Se utiliza un filtro central rodeado de otros filtros en uno o varios colores que contrastan con él. El diámetro de la máscara central dependerá del objetivo y debe ser del mismo tamaño que para campo oscuro. La iluminación Rheinberg combina la iluminación convencional de campo claro en un color con la iluminación de campo oscuro en otro color (figs. 6-6, 6-7 y 6-8).

Figura 6-6.-Algunos ejemplos de modelos de filtros empleados para la iluminación Rheinberg que pueden ser fabricados con plástico de colores o pintados con marcadores permanentes para transparencias. Un filtro de color verde en la periferia incrementa los detalles porque el ojo humano visualiza muy bien ese color. Es importante que el filtro central sea más oscuro que el filtro periférico. Se pueden emplear los colores que se deseen. Tomado de Wim van Egmond (2002). 'Easy to make' contrast enhancement filters for the microscope dark-field, oblique and Rheinberg illumination (96).

Figura 6-7.-Micrografías de la superficie de una hoja que muestran el aspecto obtenido con la iluminación Rheinberg. En la parte inferior se aprecia el tipo de filtro empleado. Modificado de Wim van Egmond (2002). 'Easy to make' contrast enhancement filters for the microscope dark-field, oblique and Rheinberg illumination (96).

Figura 6-8.-Microfotografía de un nematodo iluminado con la técnica de Rheinberg. El parásito aparece de color azul claro sobre un fondo violáceo. Tomado de Santamaría Nino (2007) Microfotografías (97).

6.1.2.-Aplicaciones del microscopio de campo oscuro

Aplicaciones del microscopio de campo oscuro (15, 96, 97):
• Estudio de especímenes de tamaño pequeño no coloreados, tales como microorganismos acuáticos, ovocitos, células en cultivo (cuyos índices de refracción oscilan en un rango de 1.2 a 1.4 y no hay una diferencia notable con el índice de refracción de 1.3 de la solución acuosa en la cual se encuentran).

• Observación de células móviles, como el Treponema pallidum, una espiroqueta causante de la sífilis, la cual con la microscopía óptica ordinaria es muy difícil de visualizar.

• Estudio de procesos fisiológicos como mitosis y migración celular.

Microscopio de contraste de fase

Las investigaciones iniciales de Frits Zernike al inicio de la década de 1930 revelaron que en microscopía, al crear interferencias en la luz empleada para iluminar el espécimen se creaban condiciones que producían un incremento del contraste. Este descubrimiento le valió el premio Nobel en física en el año 1953 y revolucionó la investigación en biomedicina al permitir el estudio de células vivas. Con esta técnica de iluminación se aumenta el contraste de manera notoria entre las partes claras y oscuras de las células transparentes.

El principio es semejante al de campo oscuro; se ilumina la muestra con un cono hueco de luz pero mucho más estrecho. Se emplea un filtro en forma de anillo que disminuye la intensidad de la luz y al mismo tiempo provoca un retraso o desfase en la longitud de onda de la luz. Este método induce variaciones sutiles en el índice de refracción (determinado por el espesor) de los especímenes translúcidos permitiendo visualizar una riqueza de detalles muy finos en la estructura, los cuales pasarían desapercibidos con una iluminación de campo claro (15).

Los heterogéneos componentes celulares absorben la luz de diferente manera y causan pequeñas variaciones de fase en las radiaciones luminosas, es decir, las retrasan ligeramente al disminuir la velocidad a la cual viajan y el retraso varía según el tipo de estructura. En las células y tejidos no coloreados, el escaso contraste se mejora y acentúa al transformar las diferencias de fase (invisibles al ojo humano) en diferencias de intensidad luminosa las cuales sí son detectables. Este tipo de microscopio también se denomina de Fases o Diferencia de Fases (98) (figs. 6-9 y 6-10). 

Figura 6-9.-Esquema que representa parte del principio de la iluminación en contraste de fases. A representa una onda luminosa. En A’ al atravesar el objeto transparente C, la onda se retrasa con respecto a la onda A (que no ha pasado por el objeto). En consecuencia, la onda A’ está desfasada con respecto a la onda A. El ojo humano y las placas fotográficas no son sensibles a estas diferencias de fase. La onda A’’ al pasar por un medio absorbente E reduce su amplitud (la distancia entre la cresta y el valle de la onda) y al contrario de las diferencias de fase, las diferencias de amplitud si son visibles. En R se combinan ondas de igual fase y amplitud las cuales se suman y producen aumento del brillo de la imagen. En S las ondas combinadas están desfasadas y producen incremento del contraste de las sombras y zonas oscuras de la imagen. Otras combinaciones producen el contraste de los tonos de gris. Tomado de Bennett A; Jupnik H; Osterberg H; Richards O W. Phase Microscopy (98).

Figura 6-10.-Esquema que muestra una célula sin coloración en la cual la parte con más espesor corresponde a la zona del núcleo C, el citoplasma a la zona delgada periférica B y el portaobjeto o solución acuosa circundante A. Existen diferentes índices de refracción entre A, B y C los cuales son invisibles al ojo humano. Las ondas que atraviesan una zona más espesa se retrasan y cambian de fase en relación a las ondas que atraviesan una región más delgada. El contraste de fases hace visible esas diferencias al traducirlas en cambios de intensidad (brillo). Compárese el comportamiento de las ondas con la figura 6-9. Tomado de Kapitza H G. (1997). Microscopy from the very begining (13).

Para convertir un microscopio convencional en uno de contraste de fases se sustituye el condensador y el objetivo por los de contraste de fases, los cuales contienen un filtro en anillo y una placa de fases respectivamente (fig. 6-11). Los objetivos de contraste de fases se identifican por sus letras verdes y la indicación del tamaño del anillo de fases (Ph1, Ph2, Ph3 o PhC, PhL, PhP) (12).

El método de Zernike consiste en acelerar las ondas en ¼ de longitud de onda y como resultado la interferencia produce una imagen con detalles oscuros sobre un fondo claro, denominándose contraste de fase oscuro o positivo. Otro método consiste en el efecto contrario, es decir, retrasar o disminuir la velocidad de la luz en ¼ de longitud de onda y la interferencia produce una imagen con detalles brillantes en un fondo oscuro y se denomina contraste de fase brillante o negativo (15) (figs. 6-12 y 6-13).

Figura 6-11.- Diagrama para el microscopio de contraste de fases. K: filtro anular, L: vista transversal del filtro anular, M: condensador, O-O’: objetivo, P – P’: ocular, Q: diafragma del ocular. La placa de fases está colocada entre las lentes del objetivo y funciona como otro filtro que crea la difracción de la luz. a y b: configuración de los filtros para producir el contraste negativo o positivo respectivamente. Modificado de Richards O W. (1954). Phase Microscopy 1950-1954 (99).

Figura 6-12.-Micrografías de una neurona en campo claro (izquierda) con detalles casi invisibles y con iluminación de contraste de fases oscuro o positivo (derecha) en el que los detalles son más evidentes en un fondo claro. Tomado de Kapitza H G. (1997). Microscopy from the very begining (13).

Figura 6-13.-Micrografía de células epiteliales en cultivo mediante la técnica de contraste de fases brillante o negativo, en la cual los detalles y bordes de las células aparecen brillantes (debido a un halo de difracción) en un fondo oscuro.Tomada de Asylum Reseach. Simultaneous Atomic Force and Phase Contrast Microscopy Using the MFP-3D™ AFM. (100).

6.2.1.-Aplicaciones del microscopio de contraste de fases

• Observación de células y tejidos vivos.

• En estudios de diversas disciplinas como por ejemplo fisiología, parasitología, farmacología (procesos celulares, identificación y cuantificación de microorganismos y parásitos en fluidos y tejidos, efecto de medicamentos y otras sustancias en las células y sus procesos de motilidad, ciclosis, digestión, entre otros).

• Estudio de alimentos y medicinas.

• Análisis de materiales industriales (metales, cristales, fibras sintéticas, plásticos, pigmentos, emulsiones y suspensiones minerales).

• Estudios geológicos (minerales).

Microscopio de luz polarizada

Es un microscopio de campo claro al cual se le adicionan filtros que modifican la luz. También se denomina microscopio petrográfico o metalúrgico por su uso inicial en el estudio de minerales, sin embargo su aplicación se ha extendido al campo de la biología, medicina, química y muchas otras disciplinas. Esta técnica microscópica puede emplear tanto la luz transmitida como la luz incidente (trans-iluminación y epi-iluminación respectivamente).

Comparada con las otras técnicas de incremento de contraste, el uso de la luz polarizada es la más efectiva en el estudio de muestras ricas en materiales birrefringentes, puesto que mejora de manera incomparable la calidad de la imagen.
La luz proveniente de una fuente estándar de iluminación vibra y se propaga en todas las direcciones, pero al pasar por un filtro polarizador las ondas y su campo eléctrico oscilan todos en un mismo plano. El polarizador es un dispositivo que solo deja pasar la luz que vibra en un plano determinado denominado eje de polarización (13) (fig. 6-14).

Figura 6-14.-Esquema que muestra el efecto de filtros polarizadores en un rayo de luz. A la izquierda la luz no polarizada se distribuye en todos los planos, pero al pasar por el primer filtro (horizontal) éste sólo deja pasar las ondas que se propagan en un plano horizontal. Si se interpone un filtro polarizador orientado de manera vertical (rotado 90º en relación al horizontal) la luz polarizada no pasa y se detiene. Tomada de Multimedia Encarta Luz Polarizada (28).

Muchos materiales tienen sus átomos uniformemente distribuidos en las tres direcciones principales del espacio y presentan una máxima simetría (cúbica o regular) o por el contrario, en algunos materiales sus átomos carecen de organización. Los primeros tienen las mismas propiedades ópticas, independientemente de la dirección en que se midan. Cuando la luz atraviesa sustancias con estas características, la velocidad es la misma en todas las direcciones y gracias a ello se denominan isótropos. Por el contrario, los materiales cuya organización cristalina es diferente (hexagonal, trigonal, tetragonal, rómbico, entre otras) poseen sus constituyentes dispuestos de manera asimétrica y varían según la dirección; en consecuencia el comportamiento de las ondas luminosas también en diferente, denominándose anisótropos (101). La estructura interna del espécimen determina su comportamiento isótropo o anisótropo.

Cuando se estudia el comportamiento de la luz al atravesar un espécimen, los materiales anisótropos presentan distintos índices de refracción en relación a la dirección del haz de luz; por el contrario, los materiales isótropos presentan un índice de refracción constante. Cuando un rayo de luz incide sobre la superficie de un material anisótropo transparente se presenta el fenómeno de la doble refracción o birrefringencia; esto quiere decir que se producen dos rayos refractados distintos que vibran en planos diferentes que se propagan con diferentes velocidades en el interior del material.

Este microscopio facilita la investigación de las propiedades ópticas de los especímenes y es ideal para observar y fotografiar aquellos elementos que son visibles gracias a la anisotropía, de allí su uso en cristalografía; sin embargo, también se emplea para estudiar el carácter birrefringente de muchas estructuras celulares anisótropas.

El contraste de la imagen se observa gracias a la interacción de la luz polarizada con los elementos birrefringentes del espécimen que producen las dos ondas refractadas, cada una de ellas polarizada en planos perpendiculares. Una vez que las ondas de luz salen del espécimen lo hacen de manera desfasada (ver fig. 6-9) pero son recombinadas al pasar por otro filtro o filtro analizador. De esta manera, el microscopio de luz polarizada permite el estudio comparativo entre minerales tomando en cuenta la absorción del color e índices de refracción. Sin embargo, en biología su principal utilidad consiste en distinguir las sustancias isotrópicas de las anisotrópicas, revelando información detallada sobre la estructura y composición de los materiales con la finalidad de caracterizarlos para fines diagnósticos (102). El ojo humano no capta las direcciones en las que vibra la luz y la luz polarizada puede ser detectada como un incremento en la intensidad luminosa o como un efecto de color. O en lo cotidiano, por ejemplo, con el uso de lentes de sol polarizados se logra reducir el resplandor de la luz ambiental.

El 90% de las sustancias sólidas son anisotrópicas y como materiales isotrópicos se pueden enumerar una variedad de gases, líquidos y cristales.

Este microscopio está equipado con:
• Polarizadores: Un primer filtro polarizador colocado entre la fuente de luz y el condensador que se puede rotar 360º y un analizador o segundo polarizador, colocado por encima del objetivo, entre su lente posterior y el tubo de observación o cámara fotográfica. También puede rotarse 90º o 360º. Los polarizadores antiguos conocido como nicoles estaban conformados por un sistema de prismas de calcita descrito por W. Nicol y. En los microscopios actuales el polarizador está constituido por una lámina polaroid, que consiste en una película de un polímero transparente (revestida de cristales minúsculos de sulfato de iodoquinina orientados en la misma dirección) interpuesta entre dos placas de vidrio (102) (fig. 6-15).

• Condensador polarizador: Debe estar libre de desperfectos en sus componentes ópticos.

• Platina circular: Con capacidad de rotar 360º para facilitar la orientación del eje óptico con el campo de visión. Puede contener un vernier para medir los ángulos de rotación. El espécimen debe rotarse y colocarse en una posición diagonal en la cual los elementos anisotrópicos se observarán más brillantes (birrefringentes).

• Objetivos polarizadores: Diferentes a los objetivos comunes, estos deben estar libres de desperfectos y tener capacidad polarizadora. Son ensamblados de manera que se evita en lo posible el daño de las lentes ya que cualesquier daño por mínimo que sea compromete el rendimiento del objetivo. Poseen la inscripción P, PO, o Pol.

• Ocular con una cruz visible en el campo visual: Para marcar el centro del campo visual.

• Lente de Bertrand: Situada inmediatamente debajo del ocular, es removible y sirve para ver la interferencia con la finalidad de ajustar la iluminación de una manera precisa.

Figura 6-15.-Esquema simplificando la técnica de iluminación con luz polarizada. El filtro polarizador (1) está localizado por debajo del condensador (2) y el espécimen (3) es iluminado con luz polarizada lineal. El analizador (5) rotado en ángulo de 90º en relación a (1) está localizado detrás del objetivo (4). Una lente (6) en el tubo forma la imagen intermedia (7). Tomada de Kapitza H G. (1997). Microscopy from the very begining (13).

Si no hay espécimen en la platina el campo se observará completamente oscuro. Al colocar un portaobjeto con alguna muestra, los elementos anisótropos cambian la dirección de la vibración de la luz polarizada y el contraste se evidencia en la imagen con algunos colores cuando se emplea otro dispositivo denominado plato lambda (figs. 6-16, 6-17 y 6-18).

Figura 6-16.-Micrografía de cartílago hialino visto con luz polarizada en donde se aprecia la birrefringencia del colágeno que forma parte del pericondrio, correspondiendo a las estructuras rosadas brillantes. Tomado de Laboratorio de Investigaciones Histológicas Aplicadas. Universidad Nacional del Litoral. Santa Fe, Argentina (103).

Figura 6-17.-En un paciente con amiloidosis sistémica se realizó un estudio comparativo de dos micrografías de un glomérulo renal. A la izquierda con tinción de rojo Congo los depósitos son de color rojizo o naranja intenso y a la derecha la muestra es visualizada al microscopio de luz polarizada que permite apreciar la verdadera positividad con la birrefringencia de color amarillo. 600x. Tomado de Arias L. Nefropatología (104).

Figura 6-18. Micrografía de luz polarizada de fibrocélulas musculares estriadas en la cual se aprecia el patrón de bandas y estriaciones transversales. Tomado de Junqueira y Carneiro (2005) (105).

6.3.1.-Aplicaciones del microscopio de luz polarizada

• Identificar sustancias cristalinas o fibrosas intracelulares (como el citoesqueleto) y extracelulares (sustancia amiloide, asbesto, colágeno, cristales de uratos y otras de origen exógeno).

• Identificar y estimar cuantitativamente los componentes minerales.