La microscopía

Formación de la imagen en el microscopio compuesto

Formación de la imagen en el microscopio compuesto

Con la finalidad de facilitar la comprensión de la propiedad de aumento que tienen las lentes y en consecuencia el microscopio para observar objetos minúsculos, es necesario conocer algunos aspectos del fenómeno de la visión. El ojo humano está constituido de tal manera que sólo puede tener una visión clara cuando los rayos luminosos incidentes son paralelos o ligeramente divergentes, debido a que la retina requiere la participación del cristalino para enfocar los rayos en su superficie.

El límite para visión cercana es la mínima distancia a la cual se puede observar claramente un objeto; varia de un individuo a otro y se estima entre 15 y 25 cm (6 y 10 pulgadas respectivamente), depende de la edad y otros factores. El valor considerado normal es de 25 cm. El tamaño aparente de un objeto depende del ángulo formado por dos líneas proyectadas desde el centro del ojo a las extremidades de dicho objeto (fig. 4-14)

Figura 4-14. Las líneas dibujadas desde el ojo a A y R forman un ángulo, el cual es dos veces más grande que el ángulo de las líneas O-W. De igual manera, la distancia del ojo a la flecha OW es dos veces la distancia del ojo a la flecha AR. La flecha en AR aparece dos veces más grande que la flecha en OW. Las proporciones se mantienen al alejar o acercar la flecha. Tomado de Hogg J. The Microscope: Its History, Construction and Applications (73).

Este ángulo así formado se conoce como ángulo de visión o ángulo visual (73). La utilidad de una lente convexa interpuesta entre el ojo y un objeto cercano consiste en la reducción de la divergencia de los rayos luminosos emanados del objeto, de manera que puedan entrar al ojo en un estado de moderada divergencia, como si emanaran de un objeto situado más allá del límite de visión cercana y en consecuencia se forma la imagen en la retina (fig. 4-15).

Figura 4-15. Diagrama que representa una lente bi-convexa cercana al ojo y a una flecha pequeña (objeto en estudio) cuyos conos dibujados representan parte de los rayos de luz divergentes emanados de varios puntos. Los rayos emanados del objeto muy cercano, al incidir en la pupila, son aún tan divergentes que no permiten formar una imagen enfocada en la retina; pero al pasar primero por la lente son desviados para formar líneas casi paralelas que si pueden ser captadas por el ojo si éste está a su vez muy cercano a la lente. Tomado de Hogg J. The Microscope: Its History, Construction and Applications (73).

Esos rayos luminosos emanados del objeto cercano y desviados por la lente son recibidos por el ojo como si fuesen emanados directamente por una flecha (objeto) más grande, aparentemente situada en el límite de visión cercana del observador (aprox. 25 cm del ojo). La diferencia de tamaño entre la flecha real y la flecha imaginaria estará determinada por el poder de aumento de la lente. La imagen formada no es real, no puede ser proyectada en una pantalla o recogida en una placa fotográfica; es una imagen mental. Por esta razón la imagen se denomina virtual y la distancia desde la lente hasta la imagen formada se denomina distancia focal virtual (74,75).

Al interponer una lente bi-convexa entre un objeto y el ojo se incrementa el ángulo de visión y en consecuencia el objeto se verá más grande (fig. 4-16)

Figura 4-16. Sin la lente colocada en f’g’ el ojo verá la flecha con el ángulo formado por las líneas punteadas b y c, formando la imagen b’c’. Los rayos b’f’ y c’g’ emanados de las extremidades de la flecha son refractados por la lente hacia el ojo en dirección f y g, los cuales crean un ángulo visual mayor que hace que la fecha se vea más grande (d-e). Tomado de Hogg J. The Microscope: Its History, Construction and Applications (73).

Lo que se conoce sobre las propiedades de las lentes permitirá comprender el principio del microscopio compuesto, denominado así, en oposición a la lupa (microscopio simple) en base a que está conformado por dos sistemas de lentes, los cuales deben estar centrados, es decir, tener el mismo eje óptico. El primer sistema, cercano al objeto en estudio, se denomina objetivo, posee una distancia focal muy corta y es posible colocar el objeto un poco más allá de su punto focal para obtener una imagen real, invertida y aumentada.

El sistema de lentes a través del cual el observador examina se denomina ocular y funciona como una lupa que aumenta la imagen real producida por el objetivo. La distancia entre el ocular y el objetivo debe ser calculada de manera que la imagen real obtenida por el objetivo se forme entre el ocular y su punto focal (11). El aumento del microscopio dependerá en principio de la longitud focal del objetivo. Mientras más pequeña sea esta longitud y el objeto se acerque al objetivo, más grande será la imagen real. El aumento también depende de la distancia focal del ocular y mientras más corta sea esta, mayor será el aumento (fig. 4-17).

Figura 4-17. Esquema simplificado que muestra el trayecto que siguen los rayos emanados del espécimen en estudio y su paso a través de las lentes objetivo y ocular para la formación de las imágenes. La flecha ab corresponde al espécimen, que está colocado un poco por delante del foco (f) del objetivo, el cual forma una imagen real, aumentada e invertida en a’b’. Esta imagen se forma por dentro del foco (f ’) de la lente ocular. El ojo del observador percibirá a través del ocular la imagen virtual, aumentada y derecha a’’b’’ de la imagen real a’b’.

Accesorios del microscopio

Habiéndose familiarizado con la estructura y funcionamiento del microscopio compuesto, hay que considerar aquellos accesorios que conducen a una excelente práctica microscópica y que facilitan el trabajo, haciéndolo más rápido y efectivo o ampliando las capacidades del instrumento. Dentro de las actividades o posibilidades se pueden citar:

• Medir y cuantificar: Consiste en la micrometría (morfometría) aproximada de los especímenes observados al microscopio. Para cuantificar longitudes, cantidades (conteo de células, núcleos, partículas), ángulos. Se emplean oculares de medición con retículos o gradillas en combinación con micrómetros especializados, láminas calibradas, cámaras de conteo y el vernier. En la actualidad se han desarrollado instrumentos para morfometría que emplean tecnología digital y los datos obtenidos pueden ser transmitidos a un computador, permitiendo así la automatización, el almacenamiento de los datos y la obtención de variables estadísticas a partir de ellos.

• Dibujar: Dibujar las preparaciones microscópicas es una actividad de las más completas y precisas que permite obtener una representación fiel del espécimen en estudio tal y como el observador la percibe y representa la suma de detalles que se observan al cambiar el plano de enfoque, obteniéndose la sensación de relieve y profundidad. Se emplean las cámaras claras y otros dispositivos para dibujar que están concebidos con una serie de espejos y prismas que hacen coincidir en la retina o en una pantalla tanto el campo observado como el plano en el cual se debe dibujar. Se sigue sobre una hoja de papel el contorno de la imagen observada al mismo tiempo que se dibuja con un lápiz.

• Fotografiar: Una manera de preservar lo observado al microscopio es mediante la microfotografía. Las imágenes obtenidas se archivan y se emplean en publicaciones científicas y presentaciones con fines docentes y banco de datos. Se necesitan adaptadores para conectar la cámara a un tubo semejante al tubo del ocular en microscopios trinoculares. Se emplean desde las cámaras fotográficas clásicas hasta las cámaras digitales especializadas para acoplar al microscopio y las cámaras fotográficas digitales de uso común. Actualmente la fotografía clásica resulta complicada, costosa, de resultados menos atractivos y ha sido desplazada por la fotografía digital que es de más fácil y práctica ejecución. Con las cámaras digitales de alta resolución se obtienen resultados muy satisfactorios e inmediatos que pueden ser archivados en el computador para su posterior análisis y procesamiento.

• Filmar: La captura de imágenes en movimiento se realiza mediante cámaras de video (digitales o no) que registran la actividad de especímenes vivos, células en cultivo, cámaras de perfusión, dispositivos con motor y automatizados, entre otros, para la demostración y análisis de procesos fisiológicos en videomicroscopía.

• Incrementar el contraste: Para facilitar la observación de especímenes con una estructura particular y células vivas se emplean filtros, condensadores y otros dispositivos que transforman al microscopio de campo claro en un instrumento para tal fin, lográndose la microscopia fotónica especial (campo oscuro, contraste de fases, polarización, entre otras).

• Procesamiento de imágenes: Con el empleo del computador y de software especializados para captura, administración y procesamiento de las microfotografías, en la actualidad se ha llegado a nuevos niveles en facilidad de uso y sofisticación que simplifican la investigación científica (76, 77).

Tipos de microscopios

Existen diversas clases de microscopios, según la conformación, la naturaleza de los sistemas de luz y otros elementos utilizados para obtener las imágenes.

El microscopio óptico puede ser monocular, binocular, trinocular (para microfotografía). En los microscopios binoculares la observación se hace con los dos ojos y esto permite una observación más cómoda y se percibe una mayor nitidez de los detalles en la imagen. Se fabrican en diferentes tamaños incluyendo microscopios pequeños portátiles o de viaje. Dentro de los tipos de microscopios se describen:

• Microscopio vertical: Es el microscopio convencional, perfeccionado a partir de los modelos antiguos, que posee la fuente de luz ubicada en la base, por debajo de la platina. Es el microscopio de uso más común.

• Microscopio invertido: La estructura del microscopio es invertida en comparación al microscopio convencional. La fuente de luz está ubicada por encima de la platina y el principio de funcionamiento y formación de la imagen es el mismo que el del microscopio tradicional. Utilizado principalmente para cultivos celulares (células vivas) sin una preparación previa y para monitorear actividades (crecimiento, comportamiento) (fig. 4-18).

Figura 4-18.-Microscopio invertido con el revólver y objetivos por debajo de la platina. La fuente de luz se ubica en la parte superior. Tomado de Instrumental Pasteur. Microscopio Olympus. (78).

• Microscopio estereoscópico: Este tipo de microscopio proporciona una imagen estereoscópica, en tres dimensiones (3D) del espécimen. Se fundamenta en la visión binocular convencional, en la que los dos ojos observan el espécimen con ángulos levemente distintos. El microscopio estereoscópico debe ser binocular. Se utiliza para observar especímenes de gran tamaño, sin corte o preparación previa puesto que emplea luz incidente y no funciona por trans-iluminación. Es ideal para realizar microdiseccion (fig. 4-19).

Figura 4-19.-Microscopio estereoscópico. Tomado de Kosmos Scientific de México (79).

• Microscopio quirúrgico: Es un microscopio que se emplea en microcirugía. Proporciona un campo muy bien iluminado y un aumento de las estructuras anatómicas, facilitándole al cirujano una mayor visibilidad de los tejidos sanos y patológicos que serán manipulados más cuidadosamente y con menores posibilidades de lesión. Algunos modelos más sofisticados tienen piezas automatizadas robóticas. Se utiliza principalmente en intervenciones quirúrgicas en las que se amerite una minuciosa disección, como por ejemplo del cráneo y cerebro o del globo ocular (fig. 4-20) (80, 81).

Figura 4-20.-Cirujano empleando microscopio quirúrgico. Tomado de Cerrón, V (80).

• Microscopios fotónicos especiales: Ciertos especímenes, principalmente las células vivas o muestras no coloreadas, al ser observados en el microscopio común de campo claro, muestran un muy pobre contraste de sus estructuras y no aportan datos relevantes, a pesar del poder de resolución de los objetivos empleados. Para ello se han creado microscopios con ciertas particularidades que permiten la observación de ese tipo de especímenes con un incremento muy satisfactorio del contraste. Entre ellos se citan:

Microscopio de campo oscuro.

Microscopio de luz ultravioleta.
Microscopio de fluorescencia.

Microscopio de polarización.

Microscopio de contraste de fases.

Microscopios interferenciales.