Técnicas de microscopía electrónica
El principio de la microscopía electrónica es muy similar al de la microscopia de luz y se han desarrollado dos principales técnicas (14):
1. Microscopía electrónica de transmisión: Se observa a través del espécimen (trans- iluminación). El espécimen se corta en láminas ultrafinas (en el orden de nanómetros) que se colocan en una rejilla de cobre, la cual es bombardeada con un haz de electrones enfocado. Una silueta del espécimen se proyecta en una pantalla fluorescente o placa fotográfica situada por debajo del mismo. La resolución puede ser de 0,2nm.
2. Microscopía electrónica de barrido: Se observa la superficie de un espécimen sólido (epi-iluminación). Se puede lograr una resolución de 10nm y un aumento hasta de 20.000x. Se producen imágenes muy interesantes en 3D (tridimensionales) gracias a una mayor profundidad de campo. Se escanea la superficie del espécimen con un haz de electrones (primarios) y los electrones que rebotan (secundarios) son recogidos por un detector. La señal se observa en un monitor de televisión. Los átomos del espécimen producen rayos X que también son detectados.
A partir del modelo construido por Knoll y Ruska en 1931 (fig.5-1), varias casas comerciales (RCA, Siemens, GE, entre otras) han producido diversos modelos de microscopios electrónicos modernos, pero todos ellos basados en el modelo original.
Conformación del microscopio electrónico de transmisión:
Conformación del microscopio electrónico de transmisión:
• Una cámara al vacío, el cual es generado por una bomba.
• Una columna donde se genera y viaja el haz de electrones.
• Un sistema óptico que forma una imagen en una pantalla fluorescente o en una placa fotográfica.
• Circuito electrónico estabilizador de voltaje.
Como se vio anteriormente, el haz de electrones se obtiene calentando el filamento del cátodo; los electrones se aceleran aplicando un voltaje entre el cátodo y el ánodo. El cátodo posee un potencial altamente negativo.
El sistema óptico consiste en un condensador que concentra y dirige el haz de electrones hacia el espécimen; una lente objetivo y otra lente proyectora, las cuales en conjunto producen una imagen aumentada que se proyecta en una pantalla fluorescente o una película fotográfica.
El espécimen se coloca en un dispositivo que permite moverlo en dos direcciones, en un plano perpendicular al plano del eje del microscopio. La columna posee un sistema de vaciado conectado a bombas de difusión o bombas mecánicas que crean el vacio.
El alto voltaje negativo aplicado al cátodo es producido por un circuito eléctrico de alto voltaje y las corrientes aplicadas a las lentes son producidas por circuitos de bajo voltaje. Las bombas de difusión e incluso las lentes (en ciertos modelos de microscopios) son enfriadas mediante un mecanismo de circulación de agua (14).
Figura 5-1.-El primer microscopio electrónico desarrollado por Knoll y Ruska (1931). (1) Tubo de descarga, (2) cátodo, (3) válvula, (4) espacio para lente electrostática (opcional), (5) lente magnética objetivo, (6) lente de proyección, (7) columna de alto vacío, (8) salida a la bomba de vacío, (9) caja de Faraday para medir la corriente del haz de electrones, (10) pantalla fluorescente o placa fotográfica, (11) válvula para medir el vacío, (12) apertura del ánodo, (13) aperturas o diafragmas, (14) válvula de vacío, (15) ventana de observación, (16) pantalla fluorescente removible para observación, (17) cámara. Nótese que este primer modelo carece de condensador. Modificado de Freundlich M. (1963) (20).
Elementos que conforman el microscopio electrónico de transmisión:
• Emisor de electrones:
Al igual que en el microscopio fotónico, la fuente de irradiación es pequeña, a partir de la cual se genera un estrecho haz de electrones. El haz de electrones de alta energía puede obtenerse de varias maneras (84):
Al igual que en el microscopio fotónico, la fuente de irradiación es pequeña, a partir de la cual se genera un estrecho haz de electrones. El haz de electrones de alta energía puede obtenerse de varias maneras (84):
- Por emisión termoiónica: Es la forma más común y se realiza a partir de un delgado filamento de tungsteno dispuesto en forma de V. El metal debe calentarse a una muy alta temperatura mediante una corriente eléctrica (muy alto voltaje) para acelerar a un número importante de electrones que se desprenderán de la punta de la V. Los electrones que se liberan tienden a formar una nube próxima a la superficie del metal y con la aplicación de un campo eléctrico entre el filamento (cátodo) y una porción de la columna (ánodo) los electrones son acelerados. Otros materiales pueden ser empleados en la confección del cátodo, tales como oxido de bario, platino, lantano, entre otros (fig. 5-2).
-Por emisión de campo: Se aplica un fuerte campo eléctrico (109 Vm) para extraer los electrones del filamento de metal (tungsteno). La temperatura es mucho menor que en la emisión termoiónica. Se obtiene un haz de electrones de mayor intensidad y se requiere de un vacío absoluto.
Figura 5-2.-Filamento de hexaboride de lantano LaB6. Tomada de The Electron Gun. Electron Microscopy (85).
• Condensador:
Con la introducción del condensador, conformado por una lente electromagnética, el haz de electrones puede ser enfocado de manera más precisa en el espécimen. La lente está colocada aproximadamente a media distancia entre el cátodo y el plano del objeto (equivalente a la platina en el microscopio fotónico). En algunos microscopios se coloca un doble condensador con la finalidad de lograr mayor resolución y aumento; de esta manera se reduce el riesgo de daño térmico y contaminación del espécimen. En la búsqueda de un mayor aumento, es necesario emplear un haz de electrones más potente e intenso, lo cual literalmente quema el espécimen, de allí que la observación deba hacerse rápidamente para que el tiempo de exposición a los electrones sea corto (14).
Con la introducción del condensador, conformado por una lente electromagnética, el haz de electrones puede ser enfocado de manera más precisa en el espécimen. La lente está colocada aproximadamente a media distancia entre el cátodo y el plano del objeto (equivalente a la platina en el microscopio fotónico). En algunos microscopios se coloca un doble condensador con la finalidad de lograr mayor resolución y aumento; de esta manera se reduce el riesgo de daño térmico y contaminación del espécimen. En la búsqueda de un mayor aumento, es necesario emplear un haz de electrones más potente e intenso, lo cual literalmente quema el espécimen, de allí que la observación deba hacerse rápidamente para que el tiempo de exposición a los electrones sea corto (14).
• Sistema óptico:
Un microscopio electrónico de transmisión funciona de manera análoga al microscopio de luz. En lugar de un haz de fotones, se emplea un haz de electrones aumentado y enfocado ya sea por lentes eléctricas (electrostáticas) o magnéticas (electromagnéticas). Un electrón al moverse por un campo magnético cambia su dirección y se desplaza en ángulo recto con respecto a la dirección del campo magnético. El grado de desviación es inversamente proporcional a la fuerza del campo y a la carga del electrón. De igual manera, un electrón que se mueve en un campo eléctrico también cambia su dirección. Como resultado de la atracción entre una placa de carga positiva y la carga negativa del electrón, éste último es desviado hacia la placa. En consecuencia, hay dos vías para desviar los electrones con la finalidad de utilizarlos de manera análoga a un rayo de luz y producir una imagen aumentada de un objeto. Esto se logra mediante un campo eléctrico o mediante un campo electromagnético. Ambos tipos de campos serían empleados como “lentes”.
Un microscopio electrónico de transmisión funciona de manera análoga al microscopio de luz. En lugar de un haz de fotones, se emplea un haz de electrones aumentado y enfocado ya sea por lentes eléctricas (electrostáticas) o magnéticas (electromagnéticas). Un electrón al moverse por un campo magnético cambia su dirección y se desplaza en ángulo recto con respecto a la dirección del campo magnético. El grado de desviación es inversamente proporcional a la fuerza del campo y a la carga del electrón. De igual manera, un electrón que se mueve en un campo eléctrico también cambia su dirección. Como resultado de la atracción entre una placa de carga positiva y la carga negativa del electrón, éste último es desviado hacia la placa. En consecuencia, hay dos vías para desviar los electrones con la finalidad de utilizarlos de manera análoga a un rayo de luz y producir una imagen aumentada de un objeto. Esto se logra mediante un campo eléctrico o mediante un campo electromagnético. Ambos tipos de campos serían empleados como “lentes”.
Los tipos de lentes empleadas en el microscopio electrónico obedecen entonces a dos modelos, las lentes electrostáticas y las lentes electromagnéticas. Durante años los fabricantes se han debatido entre ambos tipos de lentes, con la finalidad de demostrar cual lente era la más eficiente y daba mejores resultados. Los modelos electromagnéticos demostraron ser superiores (86).
Lentes electromagnéticas y aberraciones:
De manera simplificada se puede decir que las lentes electromagnéticas son electroimanes que están formados por un solenoide o bobina muy bien comprimida, constituida por un material conductor filamentoso, por el cual pasa una corriente eléctrica constante. El solenoide está alojado dentro de un contenedor de metal en forma de anillo, el cual posee una hendidura o ranura en su cara interna (fig. 5-3). El flujo magnético y las líneas de fuerza se concentran en la ranura y en el centro del anillo.
De manera simplificada se puede decir que las lentes electromagnéticas son electroimanes que están formados por un solenoide o bobina muy bien comprimida, constituida por un material conductor filamentoso, por el cual pasa una corriente eléctrica constante. El solenoide está alojado dentro de un contenedor de metal en forma de anillo, el cual posee una hendidura o ranura en su cara interna (fig. 5-3). El flujo magnético y las líneas de fuerza se concentran en la ranura y en el centro del anillo.
Propiedades de las lentes electromagnéticas: Las propiedades de las lentes son (14):
• Cada campo magnético posee una simetría axial y actúa como una lente para los electrones.
• Todas las lentes electromagnéticas son positivas.
• La velocidad de los electrones no se ve afectada.
• La imagen formada está rotada e invertida en relación al objeto.
• Cada campo magnético posee una simetría axial y actúa como una lente para los electrones.
• Todas las lentes electromagnéticas son positivas.
• La velocidad de los electrones no se ve afectada.
• La imagen formada está rotada e invertida en relación al objeto.
Aberraciones: Las mismas aberraciones que afectan las lentes ópticas de cristal afectan la formación de las imágenes en las lentes electromagnéticas (14):
• Aberración de esfericidad: Es la más importante en la microscopía electrónica y es el factor que más limita el poder de resolución.
• Distorsión: Cambios en la imagen de la forma de los objetos (en barril, en almohadilla y distorsión espiral).
• Curvatura de campo.
• Astigmatismo.
• Aberraciones cromáticas: Originadas por variaciones en la velocidad de los electrones, los cuales pueden abandonar el cátodo emisor a diferentes velocidades, las cuales pueden ser modificadas al ser sometidos a la aceleración por la diferencia de voltaje.
• Otras: producidas por la rotación de los electrones al pasar por el campo magnético.
• Distorsión: Cambios en la imagen de la forma de los objetos (en barril, en almohadilla y distorsión espiral).
• Curvatura de campo.
• Astigmatismo.
• Aberraciones cromáticas: Originadas por variaciones en la velocidad de los electrones, los cuales pueden abandonar el cátodo emisor a diferentes velocidades, las cuales pueden ser modificadas al ser sometidos a la aceleración por la diferencia de voltaje.
• Otras: producidas por la rotación de los electrones al pasar por el campo magnético.
Figura 5-3.-Comparación entre una lente electromagnética y una lente de cristal. En la primera (izquierda) en corte longitudinal, una bobina de cobre (material conductor) está aislada en una cubierta de metal que posee una ranura en la cara interna (N-S). En la parte superior, la línea azul representa el objeto y en la parte inferior, la imagen del mismo obtenida por la lente. En amarillo se muestra el trayecto de electrones y fotones, dependiendo del tipo de lente. Modificado de Matter. Electromagnetic Lenses (87).
La mayoría de microscopios electrónicos emplean lentes electromagnéticas. Una razón de peso es que las lentes electrostáticas, en comparación a las magnéticas, son más sensibles a la calidad del vacío y limpieza de los componentes; de igual manera, en las primeras, algunas aberraciones son más severas y requieren de campos electrostáticos muy poderosos los cuales pueden ocasionar alteraciones eléctricas dentro de la columna del microscopio, afectando el haz de electrones.
El sistema óptico se emplea para producir una imagen del espécimen. Generalmente se colocan tres lentes (fig. 5-4):
- Lente objetivo: Es la más importante, pues determina el poder resolutivo del microscopio.
- Lente intermedia.
- Lente de proyección: En algunos casos es doble. La función de esta lente es la de producir el aumento final.
- Lente objetivo: Es la más importante, pues determina el poder resolutivo del microscopio.
- Lente intermedia.
- Lente de proyección: En algunos casos es doble. La función de esta lente es la de producir el aumento final.
• Platina:
Cumple una función similar a la platina en el microscopio fotónico garantizando el intercambio de especímenes y el movimiento preciso del mismo durante la observación. En el microscopio electrónico de transmisión la platina es un dispositivo extraíble en el cual se coloca la rejilla de cobre sobre la cual se ha depositado el corte ultrafino del tejido. La platina debe conservarse muy limpia, de lo contrario se verá afectado el movimiento de la muestra, entorpeciendo la observación.
• Pantalla o visor y la cámara fotográfica:
La imagen se proyecta en una pantalla fluorescente en la cual la energía cinética de los electrones se transforma en luz gracias a la fluorescencia. La pantalla consiste en una superficie revestida de una capa de cristales de sulfato de zinc. Cada cristal es una unidad que emana luz cuando sobre ella inciden electrones y en consecuencia la resolución de la pantalla dependerá de la talla de los cristales (14).
La imagen se proyecta en una pantalla fluorescente en la cual la energía cinética de los electrones se transforma en luz gracias a la fluorescencia. La pantalla consiste en una superficie revestida de una capa de cristales de sulfato de zinc. Cada cristal es una unidad que emana luz cuando sobre ella inciden electrones y en consecuencia la resolución de la pantalla dependerá de la talla de los cristales (14).
Las imágenes pueden grabarse en una película fotográfica. Al igual que los fotones, los electrones al incidir sobre la emulsión fotográfica producen cambios en los cristales de bromuro de plata, obteniéndose un negativo en blanco y negro, que una vez revelado por métodos clásicos fotográficos puede ser copiado en papel. De esta manera se obtiene la microfotografía (micrografía) electrónica.
• Sistema de vacío:
Los electrones al chocar con las moléculas de aire se dispersan y luego de repetidas colisiones son detenidos. Esta dispersión puede arruinar las posibilidades de obtener imágenes bien definidas. Es por ello que el haz de electrones empleado en la microscopia electrónica debe viajar en un espacio al vacío, es decir, bien evacuado y sin moléculas de aire. La diferencia de alto voltaje entre el cátodo y el ánodo podría ocasionar descargas si existiera un número suficiente de moléculas de gas que facilitarían la ionización en este espacio. De allí que es necesario mantener una baja presión de gas en la cámara donde se encuentra el filamento emisor de electrones, lo cual a su vez alarga el tiempo de vida útil del mismo al prevenir la oxidación del filamento de tungsteno. Un vacío deficiente se identifica gracias a las descargas producidas.
Los electrones al chocar con las moléculas de aire se dispersan y luego de repetidas colisiones son detenidos. Esta dispersión puede arruinar las posibilidades de obtener imágenes bien definidas. Es por ello que el haz de electrones empleado en la microscopia electrónica debe viajar en un espacio al vacío, es decir, bien evacuado y sin moléculas de aire. La diferencia de alto voltaje entre el cátodo y el ánodo podría ocasionar descargas si existiera un número suficiente de moléculas de gas que facilitarían la ionización en este espacio. De allí que es necesario mantener una baja presión de gas en la cámara donde se encuentra el filamento emisor de electrones, lo cual a su vez alarga el tiempo de vida útil del mismo al prevenir la oxidación del filamento de tungsteno. Un vacío deficiente se identifica gracias a las descargas producidas.
La presión del aire en la columna del microscopio debe estar entre 10-4 a 10-5 mm Hg. Esto es considerado como alto vacío y se produce mediante el uso de bombas mecánicas que extraen el aire del interior de la columna del microscopio. Las bombas pueden ser de difusión en las cuales las moléculas de aire difunden en vapor de aceite y de mercurio (14).
Figura 5-4.-Izquierda: Modelo Philips moderno acoplado a una computadora. Derecha: Primer microscopio Electrónico de Transmisión del occidente del país, utilizado por el Dr. Julio M. Sosa en la Universidad de Los Andes. Tomado de The Electron Gun. Electron Microscopy. (85) y Oficina de Prensa Universidad de Los Andes. Centro Latinoamericano y del Caribe para la Investigación sobre la Enseñanza de la Ciencia (Celciec) y (88) respectivamente.
Los cortes finos de tejido no muestran el arreglo tridimensional de los constituyentes celulares y aunque la tercera dimensión puede ser reconstruida a partir de cortes seriados, es un método largo y pesado. El microscopio electrónico de barrido permite la visualización de las muestras en 3D y el haz de electrones no atraviesa la muestra, por el contrario, incide sobre la superficie de la misma y los electrones secundarios son captados por un detector y la señal es enviada a una pantalla de televisión. La profundidad de campo obtenida por este microscopio es considerable; la imagen es constituida de zonas brillantes y zonas oscuras que dan un aspecto tridimensional. Sin embargo, solamente la superficie puede ser observada. La técnica se emplea para estudiar células intactas y tejidos (21).
Componentes básicos del microscopio electrónico de barrido (fig. 5-5):
• Sistema de alto vacío.
• El filamento emisor de electrones (cátodo).
• Lentes (electromagnéticas, electrostáticas o superconductoras).
• Generador del escaneo: El haz de electrones es desplazado por la superficie del espécimen de una manera predeterminada.
• Detector de electrones secundarios.
• Pantalla de televisión.
Figura 5-5.-Diagrama esquemático que muestra los componentes fundamentales del microscopio electrónico de barrido. Modificado de Nixon W. The General Principles of Scanning Electron Microscopy (89).
El haz de electrones o electrones primarios, al incidir en la superficie de la muestra genera electrones secundarios, los cuales se originan del espécimen y son colectados por un detector de electrones. Además de electrones secundarios, también se producen rayos X, infra-rojos, y ultravioleta (89).
El espécimen es colocado en una platina portaobjeto y puede ser desplazado o rotado en varias direcciones, permitiendo un amplio rango de posibilidades de observación.
Otros accesorios pueden añadirse al microscopio, tales como computadoras para análisis directo, impresoras, videocámaras, circuito cerrado de televisión, entre otros (fig. 5-6).
Figura 5-6.-Microscopio electrónico de barrido. A la izquierda se aprecia el microscopio propiamente dicho, notablemente la columna y la cámara en la cual se coloca el espécimen. A la derecha los monitores acoplados para la observación de las imágenes en 3D.
Formación de la imagen en los microscopios electrónicos
Los pasos básicos de la formación de la imagen en el microscopio electrónico, tanto de transmisión como de barrido son (figs. 5-7, 5-8 y 5-9):
1. Un haz de electrones se forma en el cátodo y es acelerado hacia el espécimen gracias a un potencial eléctrico positivo.
2. El haz de electrones es enfocado mediante el empleo de lentes electromagnéticas.
3. En la muestra irradiada ocurren interacciones las cuales afectan el haz de electrones.
4. Las interacciones y efectos son detectadas y transformadas en una imagen.
5. La imagen es formada en un dispositivo (pantalla fluorescente, monitor de televisión, placa fotográfica).
Figura 5-7.-Representación esquemática del sistema óptico del microscopio electrónico de transmisión, en el cual se aprecia un proceso de aumento en tres etapas y la formación de la imagen. Modificado de Sjöstrand F. (1967). Electron Microscopy of Cells and Tissues. Vol. 1, Instrumentation and Techniques (14).
Figura 5-8.-Esquema que muestra de manera simplificada la formación de la imagen en el microscopio electrónico de transmisión. Modificada de Electron Microscopy (23).
Figura 5-9.-Esquema que muestra de manera simplificada la formación de la imagen en el microscopio electrónico de barrido.
Poder de resolución: Aumentos
El poder de resolución está determinado en parte por la longitud de onda de la radiación empleada para iluminar el espécimen y es inversamente proporcional a la misma, es decir, a menor longitud de onda, mayor poder de resolución. El haz de electrones puede tener longitudes de onda variables, las cuales influyen en el límite de resolución que a su vez dependerá del voltaje empleado para acelerar los electrones (tabla 5-1).
Voltaje de Aceleración (kV)
|
Longitud de onda (Å)
|
Limite de resolución teórico (Å)
|
10
|
0.122 (0.122nm)
|
3.7 (0.37nm)
|
20
|
0.086 (0.0086nm)
|
2.9 (0.29nm)
|
50
|
0.054 (0.0054nm)
|
2.1 (0.21nm)
|
100
|
0.037 (0.0037nm)
|
1.7 (0.17nm)
|
200
|
0.025 (0.0025nm)
|
1.3 (0.13nm)
|
500
|
0.014 (0.0014nm)
|
0.9 (0.9nm)
|
1000
|
0.009 (0.0009nm)
|
0.7 (0.07nm)
|
Tabla 5-1.-Relación del voltaje de aceleración, la longitud de onda del haz de electrones y el poder de resolución en el microscopio electrónico de transmisión expresadas en kilovoltios (kV), angstroms (Å) y nanómetros (nm). Modificado de Sjöstrand F. (1967). Electron Microscopy of Cells and Tissues. Vol. 1, Instrumentation and Techniques (14).
Con el microscopio electrónico se puede alcanzar una resolución de aproximadamente 40.000 veces más que el poder de resolución del microscopio de luz y 2 x 106 veces el poder de resolución del ojo humano.
En el microscopio fotónico para obtener imágenes a mayores aumentos, simplemente se cambia el objetivo. En el microscopio electrónico esto no es posible y el aumento se obtiene modificando el haz de electrones y el voltaje de la lente proyectora, puesto que el aumento de la lente objetivo es fijo. Por ejemplo, para observar a mayores aumentos es necesario utilizar una mayor e intensa radiación de electrones y modificar la distancia focal de la lente proyectora, pero disminuyendo a su vez el diámetro del haz, con un tiempo de exposición del espécimen sumamente corto. Al intensificar el haz de electrones se incrementa también la temperatura y se puede quemar la muestra que se observa. Al aumentar la potencia del haz se reduce el tamaño del área que se observa y el campo visual representa áreas muy diminutas en el objeto. Para un aumento de aproximadamente 80.000x, el diámetro del área del campo visual es menor a un micrón (1µm). Esta área diminuta que se observa ocupará todo el diámetro de la pantalla de observación o de la placa fotográfica. De manera inversa, para observar a menores aumentos, el haz de electrones posee un mayor diámetro y el área de observación a su vez también es mayor; en consecuencia, a mayor diámetro del haz de electrones, menor aumento y a menor diámetro del haz, mayor aumento (14).
Microscopía electrónica de transmisión
La resolución que se puede lograr con el microscopio electrónico depende del espesor del corte del tejido y de factores que determinen el contraste. Si el corte es grueso se enmascaran los detalles finos, los cuales se hacen cada vez más imperceptibles y oscuros debido a la superposición de elementos que se presentan en los diversos planos de profundidad. De allí que es imperativo el empleo de cortes ultrafinos.
De manera resumida, los pasos necesarios en el procesamiento del tejido antes de ser observado al microscopio electrónico de transmisión son los siguientes (14, 21, 23):
1. Fijación: El tejido debe ser fijado, endurecido y preservado con tetraóxido de osmio (OsO4) y glutaraldehído, con un cuidadoso manejo del pH (con cacodilato de sodio), para mantener las membranas y las proteínas celulares en una malla tridimensional resistente. Los aldehídos crean puentes cruzados entre sí y enlaces covalentes con los grupos amino que estén libres en las proteínas. De esta manera se previene la degradación oxidativa por la muerte del espécimen.
2. Contraste: Las organelas y estructuras de interés deben ser electrón-densas y contrastar con el fondo (background). La electrondensidad se incrementa con el número atómico de los elementos y solo átomos pesados crean contraste. Se contrasta con tetraóxido de osmio, acetato de uranilo o citrato de plomo.
3. Deshidratación: El espécimen va a estar en el vacío y no puede contener agua, pues esta se evaporará y dispersará los electrones. El agua se elimina mediante alcoholes en grado creciente de concentración.
4. Inclusión: El espécimen deshidratado se coloca en óxido de propileno y resinas epóxicas o acrílicas, las cuales se endurecen y forman un bloque sólido de plástico muy duro.
5. Corte: Se emplea un ultramicrótomo que permite rebanar el tejido en cortes ultrafinos con una cuchilla de diamante, logrando cortes del orden de los 100 nm. Los electrones tiene un bajo poder de penetración y no es conveniente usar cortes gruesos.
6. Observación y toma de micrografías.
Algunas aplicaciones del Microscopio electrónico de transmisión:
• Estudios de ultraestructura de tejidos vegetales, animales y humanos (91,92, 93).
• Realización de estudios de histoquímica e inmunohistoquímica para identificarcompuestos específicos.
• Reconocimiento de virus y sus características ultraestructurales.
• Estudios de citoquímica.
• Estudios de estructuras moleculares.
• Determinación de estructura cristalina en minerales, metales y otros materiales.
• Estudio de fases y zonas cristalinas en polímeros.
• Determinación del tamaño de partículas.
• Cambios estructurales de materiales sometidos a diferentes tratamientos.
La preparación de los especímenes difiere un poco de la preparación para el microscopio electrónico de transmisión, pues el microscopio electrónico de barrido muestra imágenes en tres dimensiones (3D) en aumentos de hasta 20.000x y una resolución que puede llegar a los 5nm.
Preparación de la muestra (21, 23):
1. Fijación: Según métodos estándar de fijación.
2. Deshidratación: Mediante varios métodos, pero uno de los más utilizados es el de deshidratación por punto crítico en CO2, en el cual el agua pasa rápidamente de estado líquido a vapor sin ebullición. La deshidratación por alcohol produce artificios en el espécimen y no es utilizada.
3. Corte: Algunos especímenes no ameritan ser rebanados, pues se observará la superficie del mismo.
4. Contraste: El espécimen deshidratado es revestido por una capa de grafito o de oro.
5. Observación y toma de microfotografías.
Algunas aplicaciones del Microscopio electrónico de barrido:
• Morfología de células y tejidos animales, humanos o vegetales (91).
• Morfología interna de células y tejidos.
• Morfología superficial de minerales.
• Formas de cristalización de minerales.
• Cambios morfológicos de materiales sometidos a tratamientos químicos.
• Estudio de moléculas.
• Reconocimiento de fósiles.
Microfotografía electrónica: Interpretación de las imágenes
Al observar y estudiar las microfotografías electrónicas se debe ser muy cuidadoso en la interpretación de las imágenes de la ultraestructura celular. Muchas interrogantes han persistido en la mente de los microscopistas, quienes han tratado de explicar y buscar respuestas a ellas. Durante muchos años se ha planteado la duda si en realidad lo que se observa en las micrografías electrónicas de transmisión corresponde a la realidad, o si por el contrario, es el aspecto de los elementos celulares modificados por las sustancias y métodos empleados en el procesamiento del tejido (artificios de técnica); o debidos a la muerte celular y sus efectos en el citoplasma, notablemente en los lisosomas. Estas dudas sobre los artificios de técnica han podido disiparse (en parte) mediante el uso de controles negativos y al comparar entre sí las micrografías de microscopía de luz, electrónica de transmisión y de barrido. Con el empleo de técnicas más recientes como inmunofluorescencia y microscopía confocal muchas estructuras presentes en la célula han sido estudiadas, corroborando su aspecto morfológico observado previamente en las micrografías electrónicas.
El contraste observado en las microfotografías electrónicas de transmisión depende de ciertas propiedades del espécimen, del sistema óptico del microscopio y de las condiciones de iluminación y reproducción fotográfica.
Las regiones del espécimen que contienen metales pesados empleados en la obtención del preparado, aparecen como regiones oscuras (electron-densas) debido al poder que poseen los átomos del metal pesado en dispersar los electrones que inciden sobre la muestra. Las regiones del espécimen (por ejemplo cristales) que poseen una mayor densidad aparecerán más oscuras que las regiones vecinas amorfas (fig. 5-10). A mayor cantidad de metal depositado, mayor electrondensidad, lo cual permite un marcado contraste, el cual es revelado en una amplia gama que va desde el negro, pasando por los tonos de gris hasta llegar al blanco; esto último representa las zonas en las que no se depositó el metal. Variaciones en el espesor del espécimen afectan la interpretación debido a la superposición de elementos; a mayor espesor, mayor contraste, de allí que el espesor del corte debe ser mínimo (alrededor de 100 nanómetros). Los cortes son colocados en una rejilla (portaobjeto) de cobre revestida de una película plástica y este material puede incrementar la granulosidad en la imagen y puede interferir seriamente con el contraste de la microfotografía (14).
Las microfotografías electrónicas de barrido muestran una imagen 3D (tridimensional) del espécimen analizado. En la micrografía las zonas más oscuras corresponden a los planos más profundos y las zonas más claras a los planos más superficiales del espécimen, a partir de los cuales se originó una mayor cantidad de electrones secundarios. Al componerse la imagen de zonas claras y oscuras se puede apreciar el relieve y las depresiones, que en conjunto, conformarán el aspecto tridimensional (fig. 5-11).
El contraste observado en las microfotografías electrónicas de transmisión depende de ciertas propiedades del espécimen, del sistema óptico del microscopio y de las condiciones de iluminación y reproducción fotográfica.
Las regiones del espécimen que contienen metales pesados empleados en la obtención del preparado, aparecen como regiones oscuras (electron-densas) debido al poder que poseen los átomos del metal pesado en dispersar los electrones que inciden sobre la muestra. Las regiones del espécimen (por ejemplo cristales) que poseen una mayor densidad aparecerán más oscuras que las regiones vecinas amorfas (fig. 5-10). A mayor cantidad de metal depositado, mayor electrondensidad, lo cual permite un marcado contraste, el cual es revelado en una amplia gama que va desde el negro, pasando por los tonos de gris hasta llegar al blanco; esto último representa las zonas en las que no se depositó el metal. Variaciones en el espesor del espécimen afectan la interpretación debido a la superposición de elementos; a mayor espesor, mayor contraste, de allí que el espesor del corte debe ser mínimo (alrededor de 100 nanómetros). Los cortes son colocados en una rejilla (portaobjeto) de cobre revestida de una película plástica y este material puede incrementar la granulosidad en la imagen y puede interferir seriamente con el contraste de la microfotografía (14).
Las microfotografías electrónicas de barrido muestran una imagen 3D (tridimensional) del espécimen analizado. En la micrografía las zonas más oscuras corresponden a los planos más profundos y las zonas más claras a los planos más superficiales del espécimen, a partir de los cuales se originó una mayor cantidad de electrones secundarios. Al componerse la imagen de zonas claras y oscuras se puede apreciar el relieve y las depresiones, que en conjunto, conformarán el aspecto tridimensional (fig. 5-11).
Figura 5-10.- Microfotografía electrónica de una mitocondria al Microscopio electrónico de transmisión. Las zonas más oscuras son denominadas electron-densas y las zonas claras son denominadas electron-lúcidas. Nótese la variada electrondensidad, la cual depende del grado de afinidad de las estructuras por los metales empleados para el contraste. Aumento 60.000x. Tomada de Raisman, J., González A. Hipertextos en el área de biología. Microscopía electrónica (94).
Figura 5-11.- Microfotografía electrónica de un glomérulo renal al Microscopio electrónico de barrido. La imagen obtenida se observa en tres dimensiones, donde la profundidad de campo permite visualizar los diversos relieves. Aumento 1.200x.
Semejanzas y diferencias entre la microscopía electrónica y la microscopia de luz
• Diseño y funciones de sus elementos.
• En relación al sistema de iluminación: La radiación empleada incide directamente sobre la muestra en estudio. Está conformado por una fuente emisora de la radiación y un condensador que enfoca el rayo sobre el preparado histológico.
• El espécimen se coloca entre el sistema de iluminación y los objetivos o sistemas de formación de la imagen.
• En relación al sistema óptico: Las lentes acopladas producen una imagen aumentada del espécimen en estudio. Conformado por una lente objetivo que forma una imagen intermedia y la lente proyectora (ocular, en el caso del microscopio fotónico) que a su vez aumenta la imagen intermedia para formar la imagen aumentada final.
• Pueden convertir la radiación empleada en una imagen permanente (microfotografía).
Elemento
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Microscopio fotónico
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Microscopio electrónico
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| LENTES |
De cristal o vidrio, con distancias focales fijas
| Magnéticas, a partir de metales magnéticos, alambre de cobre enrollado, cuya distancia focal varía en relación con la corriente que pasa por la bobina de cobre |
| AUMENTO | Se consigue cambiando los objetivos, rotando el revólver | El aumento del objetivo es fijo (distancia focal) mientras que la distancia focal de la lente proyectora varía para lograr los aumentos |
| PROFUNDIDAD DE CAMPO | Pequeña, por lo que se pueden ver diferentes planos de enfoque al mover el tornillo micrométrico | Mayor, por lo que se puede ver enfocado todo el espesor del corte ultrafino del espécimen |
| FUENTE DE LA RADIACIÓN | Haz de luz: fotones. Generalmente situada por debajo del espécimen (aunque hay excepciones) | Haz de electrones. Ubicada siempre en lo alto del instrumento, por encima del espécimen |
| ALTO VACÍO | No es necesario | Imprescindible, para facilitar el desplazamiento de los electrones |
| RESOLUCIÓN | 0,2 µm | 0,2nm |
Tabla 5-2.-Comparación entre las características generales de los microscopios de luz y microscopios electrónicos.
Figura 5-12.-Comparación de tres tipos de microscopios y sus características más resaltantes
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