martes, 5 de abril de 2016

Inmunología

procesaminetos de antígenos

 INTRODUCCIÓN

Para que un linfocito T reconozca un antígeno a través de su TCR hace falta que ese antígeno sea digerido intracelularmente hasta convertirlo en péptidos, y que éstos sean expuestos en el surco de moléculas MHC del propio haplotipo. En este tema veremos pues estos dos aspectos interconectados a los que acabamos de aludir:
  1. Procesamiento del antígeno: es la degradación del antígeno proteico hasta péptidos.
  2. Presentación del antígeno procesado: es la asociación de algunos de esos péptidos con moléculas codificadas por genes del complejo principal de histocompatibilidad (MHC).
Las moléculas MHC de clase I, en una situación normal se unen a péptidos derivados de moléculas propias, y en el caso de infección por un parásito intracelular (virus, ciertas bacterias, protozoos) se unen a péptidos derivados de proteínas del patógeno. En ambos casos los péptidos derivan de procesamiento citosólico del antígeno endógeno.
Las moléculas MHC de clase II se unen a péptidos derivados de antígenos exógenos que previamente han sido introducidos en la célula presentadora por endocitosis o fagocitosis, y que son sometidos a procesamiento endocítico.

9.2 ESTUDIOS CLÁSICOS SOBRE EL PROCESAMIENTO Y PRESENTACIÓN ANTIGÉNICOS

9.2.1  Restricción de las células T por el haplotipo propio MHC

La restricción de las células T por el haplotipo propio del MHC es el hecho de que los linfocitos T (sean los CD4+ o los CD8+) sólo pueden reconocer al antígeno cuando viene presentado (como péptidos) en la membrana de una célula con MHC propio (de clase II para los linfocitos CD4+, y de clase I para los linfocitos CD8+).
Descubrimiento de la restricción por MHC-II: por los experimentos de Rosenthal & Shevach, a mediados de la década de los 70 (a estudiar en las clases de problemas)
Descubrimiento de la restricción por MHC-I: por los experimentos de Zinkernagel & Doherty (1974) (también los veremos en clases de problemas).(Por cierto, que acaba de concederse el Premio Nobel a estos dos investigadores).

9.2.2 Descubrimiento del papel de las células presentadoras de antígeno

Hacia mediados de los años 60 los inmunólogos tenían datos que indicaban que las células B y las células T reconocen el antígeno mediante mecanismos diferentes, pero esto chocaba con la idea de la época de que el sistema inmunitario reconoce el antígeno en su configuración nativa. Los experimentos de Gell & Benacerraf eran los que llevaban a la paradoja que tardó tiempo en ser resuelta:
Estos autores inyectaban proteína nativa en un animal, lo que inducía una respuesta primaria, tanto humoral como celular.
La respuesta humoral secundaria sólo se podía inducir con antígeno nativo.
Pero la paradoja llegaba al comprobar que la respuesta celular secundaria se podía provocar tanto con antígeno nativo como con antígeno desnaturalizado.
Hasta los años 80 no se pudo resolver este enigma inmunológico, en unos experimentos clásicos que pasamos a comentar:
  1. Ponemos en contacto células presentadoras de antígeno (APC) con un antígeno proteico nativo; incubamos de 1 a 3 horas; fijamos con formaldehido (lo cual detiene el metabolismo celular); finalmente añadimos células TH. Comprobamos que se produce la activación de dichos linfocitos T colaboradores.
  2. Ahora la fijación de las APC la hacemos antes de la incubación con el antígeno: tras fijar las APC con formaldehido, añadimos el mismo tipo de antígeno, incubamos como antes, de 1 a 3 horas, y finalmente añadimos las células TH. Ahora no hay activación de estos linfocitos colaboradores.
  3. La tercera variante del experimento recurre, al igual que la nº 2 a fijar las APC antes de añadir antígeno, pero ahora, este antígeno está en forma de péptidos (ya no se trata del antígeno nativo); tras incubar el tiempo preceptivo, añadimos los linfocitos TH, y el resultado es que hay activación de éstos.
Veamos lo que podemos concluir de estos experimentos:
De la prueba nº 1 podemos concluir que las células presentadoras tardan de 1 a 3 horas para procesar y desplegar en superficie el antígeno.
Comparando la prueba nº 2 con la primera, sabemos que se necesita la actividad metabólica de esas células presentadoras para presentar el antígeno (ya que si paramos su metabolismo, no pueden presentar).
Si "leemos" conjuntamente los datos de la prueba nº 3 con las dos anteriores, la conclusión final es que el procesamiento del antígeno por las APCs es un proceso metabólico que digiere las proteínas a péptidos, los cuales pueden ser desplegados en la membrana de dichas células presentadoras junto con moléculas del MHC-II.
Por las mismas fechas se vio que los linfocitos T matadores (citotóxicos, TC), al contrario de lo que se esperaba, reconocen a menudo mejor las proteínas internas de los virus, y que ello dependía de que en realidad reconocen péptidos lineares de esas proteínas desplegados en la superficie de células diana (junto con moléculas MHC de clase I).

9.3 CÉLULAS QUE PRESENTAN ANTÍGENO

Como acabamos de ver, en realidad, células que presentan antígeno pueden ser tanto células nucleadas enfermas que presenten péptidos de parásitos intracelulares (o de proteínas tumorales) a linfocitos TC como las células "profesionales" presentadoras de antígenos exógenos a los linfocitos TH. Sin embargo, a efectos de nomenclatura, a las primeras se les suele designar como células diana, para no confundirlas con las células presentadoras "profesionales" (APC en sentido estricto):
  1. Células diana (enfermas por parásitos intracelulares, o tumorales): presentan péptidos junto con moléculas MHC-I propias para que los reconozcan los linfocitos TC (CD8+).
  2. Células presentadoras de antígeno (APC): despliegan péptidos asociados con MHC-II, para su reconocimiento por linfocitos TH (CD4+). Sus principales características son:
    1. exhiben moléculas de clase II constitutivamente en sus membranas
    2. internalizan antígenos exógenos vía endocitosis y/o fagocitosis, procesándolos por la ruta endocítica, y presentándolos junto con moléculas MHC-II de sus membranas
    3. las principales APC profesionales son
      1. monocitos/macrófagos
      2. células dendríticas
      3. células de Langerhans de la piel
      4. células B maduras
      5. células dendríticas tímicas
      6. células epiteliales tímicas
      7. (en humanos) células del endotelio vascular.
Otros tipos celulares en los que se puede inducir la expresión de moléculas MHC de clase II durante una respuesta inflamatoria, actuando entonces también como presentadoras:
fibroblastos de la piel
células gliales del cerebro
células b de los islotes del páncreas
(en animales no humanos) células del endotelio vascular.

9.4 PROCESAMIENTO DEL ANTÍGENO

El sistema inmune ha "previsto" dos rutas diferentes de procesamiento, según que la amenaza sea un antígeno endógeno (intracelular) o exógeno (extracelular). Como ya sabemos, en cada caso existe una respuesta inmune diferente: actuación de células T citolíticas (CTL) para el antígeno endógeno, y producción de anticuerpos para el antígeno exógeno.
Los antígenos exógenos se procesan por la ruta endocítica, tras lo cual los péptidos resultantes se unirán a moléculas MHC de clase II, lo cual dará la señal a los linfocitos T coadyuvantes (TH).
Los antígenos endógenos se procesan por la ruta citosólica, tras lo cual sus péptidos se unirán a moléculas de MHC de clase I de la célula enferma, que así se convierte en diana para la actuación de linfocitos T matadores (TC, que en su forma "ejecutora" se denominan linfocitos T citolíticos, CTL).

9.4.1 Ruta endocítica de procesamiento

Las células presentadoras de antígeno pueden capturar antígenos proteicos por medio de fagocitosis, por endocitosis (mediada por receptor -como es el caso de los linfocitos B- o en versión de pinocitosis), o incluso por ambos sistemas (como en el caso de los macrófagos). Una vez dentro de la correspondiente vesícula membranosa, el antígeno viaja a través de los compartimentos de la ruta endocítica, y al cabo de 1 a 3 horas, algunos de los péptidos resultantes aparecen en la membrana, en el surso de moléculas MHC de clase II. El resto es excretado por exocitosis.
Veamos como ejemplo la ruta endocítica de las células B:
reconocimiento del Ag por receptor específico: mIg
ß
endocitosis mediada por receptor
ß
vesícula recubierta de clatrina
ß
endosoma temprano (pH 6-6.5)
ß
endosoma tardío o endolisosoma (pH 5-6)
(por fusión de vesículas ácidas procedentes del complejo de Golgi)
ß
lisosoma (pH 4.5-5)
En cada compartimento de esta ruta existe una variedad de hidrolasas ácidas, incluyendo abundancia de proteasas: el antígeno proteico se degrada, y se originan algunos péptidos de entre 13 y 18 aminoácidos, que se unirán al MHC-II (véase el apartado 9.5).
Entre las proteasas ácidas requeridas dentro del endosoma para este procesamiento está las catepsinas B, G y L.
Se puede lograr el bloqueo artificial de esta ruta endocítica tratando las células con agentes como la cloroquina (que origina una subida del pH), o los inhibidores de proteasas (como la leupeptina).

9.4.2 Ruta citosólica de procesamiento

Los antígenos endógenos (p. ej., proteínas producidas durante el ciclo intracelular de virus) se degradan en el citoplasma de la célula enferma mediante la ruta citosólica. Parece que esta ruta es igual o muy parecida a la que existe en todas las células sanas como mecanismo de renovación (turnover) de proteínas:
proteína a degradar
ß
sometida a la actuación del complejo ubicuitinizante
ß
la proteína queda "marcada" con varias ubicuitinas
unidas a grupos e -amino de lisinas
ß
la proteína así marcada pasa por el interior hueco (10-20 Å de Æ )
del proteosoma (una partícula cilíndrica a base de sucesivos
anillos de subunidades de varios tipos de proteínas), que
funciona como un complejo proteolítico
ß
salen varios péptidos derivados de la proteína original

El proteosoma es un gran complejo multicatalítico, formado por 28 subunidades (con p.m. entre 20 y 30 kDa), que degrada proteínas marcadas por la ubicuitina. Su estructura es la de un cilindro hueco a base de 4 anillos, cada uno con 7 subunidades.
Se ha visto que los interferones inducen tres proteínas que sustituyen a otras tantas del proteosoma normal, de modo que este proteosoma modificado está "especializado" en degradar péptidos que luego van a ser encajados en el surco de moléculas MHC de clase I:
LMP-2 y LMP-7 están codificadas por sendos genes situados dentro del complejo MHC (pero en la zona MHC-II).
MECL-1 viene codificada por un gen externo al MHC.
Parece ser que son estas tres subunidades inducibles por IFN las que tienen la actividad proteasa característica para el procesamiento de antígenos endógenos.

9.5 ENSAMBLAJE DE LAS MOLÉCULAS MHC Y PRESENTACIÓN DEL ANTÍGENO

La presentación del antígeno consiste en la asociación intracelular de los péptidos derivados de su previo procesamiento con moléculas MHC, con el ulterior desplazamiento de los complejos MHC-péptido a la membrana celular.
Las moléculas MHC de clase I se asocian con el péptido en el interior del retículo endoplásmico rugoso.
Las moléculas MHC de clase II parece que se asocian con el péptido a nivel de algún compartimento endosómico.
La unión del péptido a la molécula MHC origina la estabilización de las cadenas constituyentes de dicho MHC.

9.5.1 Ensamblaje y estabilización de las moléculas MHC-I, y presentación de péptidos procedentes de procesamiento citosólico (Ruta para antígenos endógenos)

Antes de entrar en detalles digamos como resumen que el MHC de clase I se sintetiza en polisomas adosados al retículo endoplásmico rugoso. Por otro lado, el péptido procedente del procesamiento citosólico (en complejos de tipo proteosoma) entra también al lumen del REr, y allí logra la estabilización definitiva del MHC-I por asociación de la cadena a con la b 2-microglobulina. (De hecho, la ausencia del péptido inhibe la asociación de ambas cadenas). Los péptidos antigénicos de 8 o 9 aminoácidos son los que logran mejor este efecto. Pero veamos esto en más detalle, porque hay más cosas:
Este sistema está formado por dos proteínas ancladas a la membrana del REr, denominadas TAP-1 y TAP-2, y pertenece a la llamada familia de transportadores ABC (poseen un dominio de unión a ATP). Cada proteína está codificada por un gen situado en la región II del complejo MHC, cerca de LMP-2 y LMP-7. El transportador selecciona para su paso al lumen del REr a aquellos péptidos de tamaño y características apropiadas para que luego sean anclados al surco del MHC-I (consultar estas características en el tema anterior).
La cadena a del MHC-I recién sintetizada se asocia en el interior del REr con la proteína calnexina, que retiene a dicha cadena a en una conformación parcialmente plegada.
Luego, la b2-microglobulina recién introducida al lumen del REr, se une a la cadena a con lo que la calnexina queda desplazada. (El complejo a:b2-m está aún en una configuración parcialmente plegada).
Mientras tanto, los péptidos antigénicos procedentes de procesamiento en el proteosoma van a entrar al REr por un sistema específico, llamado complejo de transporte de péptidos antigénicos.
El complejo a:b2-m se une ahora a la porción intraluminal del TAP-1. En cuanto un péptido de tamaño y caracteres adecuados entra por el transportador TAP, se une al surco de la molécula MHC-I, y es entonces cuando ésta adquiere la configuración definitiva, estable y plegada.
El complejo formado por el MHC-I unido al péptido abandona el REr, viajando por el sistema de vesículas que lo transportará a la superficie celular, de modo que finalmente quedará expuesto al exterior: ya tenemos al péptido presentado por el MHC-I. Los péptidos que no se hayan unido regresan al citosol por un sistema diferente de transporte al del TAP.

9.5.2 Ensamblaje y estabilización de MHC-II, y presentación de los péptidos procedentes de procesamiento endosómico (Ruta para los antígenos exógenos)

Las dos cadenas (a y b) del MHC-II se sintetizan por separado en ribosomas igualmente adosados al REr, y en el lumen se ensamblan. Ahora bien, hasta que no reciba el péptido, el MHC-II por sí solo es inestable: ¿cómo se evita esta desestabilización hasta que llegue a encontrarse más adelante con el péptido? En un primer momento, la molécula MHC se asocia con la calnexina, pero más tarde ésta es desplazada por la llamada cadena invariante (Ii):
La cadena invariante Ii forma trímeros (Ii)3, y cada una de las unidades de Ii se asocia con una molécula de MHC, de modo que cubre el surco de cada MHC-II. Esta unión Ii:MHC-II permite:
Que el surco de MHC quede bloqueado, con lo que en el caso de células presentadoras de Ag (que por ser células somáticas nucleadas también están procesando péptidos endógenos que deben ser asociados con MHC-I) se evita que los péptidos derivados de procesamiento citosólico puedan unirse al MHC-II.
Que la molécula MHC-II pueda viajar desde el REr a un compartimento endosómico de pH bajo donde se encontrará con péptidos derivados de endocitosis/fagocitosis.
Así pues, los complejos Ii:MHC-II viajan por vesículas hasta un tipo de compartimento ácido, donde permanecen unas 2-4 horas. Durante este tiempo la cadena Ii es rota ordenadamente por proteasas (como la catepsina L) en varios sitios, de modo que la MHC-II queda unida a un fragmento (llamado CLIP) que sigue cubriendo su surco. En algún momento de este proceso la vesícula "ascendente" que contiene CLIP:MHC-II se fusiona con una vesícula "descendente" que contiene péptidos procedentes de endocitosis/fagocitosis de antígenos exógenos.
Posteriormente ocurre el desplazamiento de CLIP, debido a que ahora MHC-II se asocia con la molécula HLA-DM (se trata de una forma especial de MHC-II dedicada a esta tarea, y sin capacidad de unir péptidos).Esta misma HLA-DM cataliza ahora la entrada de péptidos al surco de la MHC-II, con lo que éste queda estabilizado.
Finalmente el MHC-II unido al péptido termina de hacer su viaje "ascendente": la vesícula membranosa se fusiona con la membrana celular, quedando expuesto al exterior el complejo MHC-II unido fuertemente al péptido (el pH neutro del exterior estabiliza aún más la unión).
Se sigue debatiendo el lugar donde se rompe la Ii y en donde el MHC-II se encuentra con los péptidos antigénicos. Parece que debe ser un compartimento vesicular procedente del trans-Golgi que se ha fusionado con endosomas. Hay evidencias de que existe un compartimento ácido especializado, llamado MIIC (acrónimo en inglés de compartimento para MHC-II), donde se produce la rotura final de Ii y la interacción de MHC-II con los péptidos antigénicos.
Como es lógico, las células presentadoras de antígeno (APC) expresan simultáneamente MHC-II (por ser APC profesionales) y MHC-I (por ser células nucleadas somáticas). ¿Cómo evitan estas células que las MHC-II se unan al mismo tipo de péptidos endógenos que deben unirse en el REr a las moléculas de MHC-I? La explicación reside precisamente en el hecho de que el complejo MHC-II es "cubierto" a nivel de su surco por la cadena invariante (Ii), lo que evita que péptidos endógenos procedentes de la ruta citosólica ocupen dicho surco.

9.6 ALGUNAS APLICACIONES CLÍNICAS

De los conocimientos básicos adquiridos en este tema se pueden derivar algunos corolarios de tipo práctico muy interesantes para el desarrollo de vacunas:
si queremos vacunas que originen una respuesta celular restringida por MHC-I, lo ideal será usar vacunas atenuadas (microorganismos vivos, atemperados en su capacidad patogénica), capaces de multiplicarse limitadamente en el citoplasma; con ello logramos que se puedan procesar adecuadamente proteínas antigénicas que se espera que confieran protección contra el patógeno intracelular.
Si queremos desencadenar una respuesta humoral sería bueno intentar usar epitopos del patógeno reconocibles eficazmente por las células B, que comenzarían la ruta endocítica tras captar antígeno por endocitosis mediada por receptor (sus mIg).

Otra derivación (en este caso inmunopatológica) de lo aprendido en este tema es que parece que ciertas formas de diabetes autoinmunes dependen de defectos en los transportadores de clase I (proteínas TAP) que impiden que durante la maduración tímica se les enseñe a los timocitos ciertos péptidos de proteínas propias. La secuela de esto es que no se eliminan los correspondientes clones de linfocitos T autorreactivos, los cuales podrán atacar a moléculas propias durante la vida adulta.
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